Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo

Resumen

Las neuronas sensoriales olfativas expresan una amplia variedad de moléculas de clasificación de axones para establecer circuitos neurales adecuados. Este protocolo describe un método de tinción inmunohistoquímica para visualizar las expresiones combinatorias de las moléculas de clasificación de axones en los terminales axónicos de las neuronas sensoriales olfatorias.

Resumen

El sistema olfativo de ratón se utiliza a menudo para estudiar los mecanismos de formación de circuitos neuronales debido a su estructura anatómica simple. Una Neurona Sensorial Olfativa (OSN) es una célula bipolar con una sola dendrita y un solo axón no ramificado. Un OSN expresa sólo un gen receptor Olfactory (OR), OSNs que expresan un determinado tipo de OR convergen sus axones a unos pocos conjuntos de glomérulos invariantes en el Olfactory Bulb (OB). Una característica notable de la proyección de OSN es que las RUP expresadas desempeñan papeles instructivos en la proyección axonal. Las OR regulan la expresión de múltiples moléculas de clasificación de axones y generan el código molecular combinatorio de las moléculas de clasificación de axones en los terminales axónicos de OSN. Por lo tanto, para comprender los mecanismos moleculares de los mecanismos de orientación de axones específicos de OR, es vital para caracterizar sus perfiles de expresión en el OSN terminales axón dentro del mismo glomérulo. El objetivo de este artículo fue introducir métodos para recoger tantos glomérulos como possiblE en una única sección de OB y ​​para realizar la inmunotinción usando múltiples anticuerpos. Esto permitiría la comparación y el análisis de los patrones de expresión de las moléculas de clasificación de axones sin variación de tinción entre las secciones OB.

Introducción

Durante el desarrollo, las neuronas están conectadas con precisión entre sí para formar circuitos neurales adecuados, lo cual es crítico para la función cerebral normal. Dado que los circuitos neuronales aberrantes en el cerebro se piensa que son la causa de trastornos mentales como el autismo y la esquizofrenia, la comprensión de los mecanismos de formación de circuitos neuronales es uno de los principales desafíos en el campo de la neurociencia.

En el sistema olfativo de ratón, cada Neurona Sensorial Olfativa (OSN) en el Epitelio Olfativo (OE) expresa solamente un gen funcional del Receptor Olfativo (OR) y OSNs que expresan el mismo O convergen sus axones a un par específico de glomérulos en localizaciones estereotipadas en el Bulbo Olfativo (OB) ^{1 , 2} . El sistema olfativo de ratón es un excelente sistema modelo para estudiar los mecanismos moleculares de la formación de circuitos neuronales porque los investigadores pueden utilizar la expresión OR para identificar unaUbtype de OSNs y visualizar los sitios de proyección de axones OSN como estructuras glomerulares claras. Una característica notable de la proyección de OSN es que las RUP desempeñan papeles instructivos en la proyección de axones OSN a la OB ^{3 , 4 , 5 , 6} . Más específicamente, después de que los axones de OSN son guiados para aproximar regiones diana, se segregan para formar glomérulos de una manera dependiente de OR. Estudios previos han demostrado que las moléculas OR control de la expresión de axón de clasificación de las moléculas, que regulan la segregación glomerular [ ^{7 , 8]} . Además, la acumulación de pruebas sugiere que las moléculas OR generar el código de identidad neuronal por una combinación única de axón de clasificación de moléculas [ ^9] . Por lo tanto, para comprender el mecanismo de la segregación glomerular dependiente de OR, es necesario caracterizar los perfiles de expresión de axon-sorting molEcules en OSNs.

La inmunotinción fluorescente es un método común para visualizar la expresión de genes específicos. Dado que las proteínas de las moléculas de clasificación de axones se localizan predominantemente a axones OSN, los investigadores necesitan utilizar secciones OB para caracterizar sus patrones de expresión en OSN. La sección coronaria del OB se ha utilizado de forma rutinaria para la inmunotinción. Sin embargo, esta preparación pierde la información topográfica a lo largo del eje anterior-posterior en la misma sección OB. Por lo tanto, desarrollamos una preparación parasagital del lado medial del OB, que puede montar tantos glomérulos circundantes como sea posible en la misma sección OB. Combinada con la inmunotinción utilizando múltiples anticuerpos, esta preparación permite la comparación y el análisis de los patrones de expresión de las moléculas de clasificación de axones sin manchas de variación entre las secciones OB.

Además, se ha presentado un método de tinción inmunohistoquímica sin post-fijación con PFA aTratamiento con sacarosa. Este método permite a los investigadores obtener suficientes datos de tinción de alta calidad para el análisis de datos multivariables. Los protocolos presentados aquí proporcionarán detalles de métodos poderosos para los investigadores que estudian la formación del circuito neural olfativo.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron con la aprobación del comité de ética experimental de animales en la Universidad de Tokio y de acuerdo con las directrices de la Universidad de Tokio para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Preparación de Soluciones

1. Preparar solución salina tamponada con fosfato 0,01 M (PBS): añadir un comprimido de PBS (NaCl 0,14 M, KCl 0,0027 M, PO _ { ₄ } ₃ 0,010 M, pH 7,4) a 1 L de agua destilada y agitar a TA hasta que se disuelva completamente.
2. Preparar paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS: añadir 4 g de PFA a 100 ml de PBS. Se agita la solución a 60 ° C hasta que se disuelve completamente.
   1. Después de disolver el PFA en PBS, ajustar el pH de la solución a 7,4 con hidróxido de sodio 1 N (NaOH). A continuación, enfriar sobre hielo y filtrar la solución a través de un papel de filtro para eliminar cualquier materia en partículas. Almacenar a 4 ° C.
      Precaución: Tenga cuidado al utilizar estos reactivos. Encargarse deCon cuidado y use guantes, gafas de seguridad y bata de laboratorio debajo de un capó químico.
      NOTA: Utilice una solución fresca de PFA al 4% preparada en un plazo de 2 días.
3. Preparar PBS 0,01 M suplementado con Triton X-100 al 0,3% (PBST): añadir 3 ml de Triton X-100 a 997 ml de PBS. Agitar la solución a RT hasta que esté completamente disuelta.
4. Preparar una solución de bloqueo al 1% y al 5%: añadir 10 g de leche desnatada a 200 ml de PBST para preparar una solución de bloqueo al 5%. Agitar a RT hasta que esté completamente disuelto. Diluir 5% de solución de bloqueo cinco veces con PBST para preparar solución de bloqueo al 1%.

2. Preparación de las secciones de Parasagittal OB

1. Use animales entre 1-2 semanas de edad. Estos grupos de edad son adecuados para los siguientes experimentos porque los glomérulos son claramente visibles y el cerebro se puede cortar con el cráneo.
2. Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg de peso corporal). Perfundir el animal transcardialmente con hielo 4% PFA en PBS. Manipule con cuidado y use guantes, gafas de seguridad y bata de laboratorio debajo de un capó químico.
3. Después de la perfusión, corte la cabeza con unas tijeras y retire la piel cuidadosamente. A continuación, inserte una hoja de las tijeras en el espacio entre los dientes superior e inferior y corte horizontalmente para quitar la mandíbula inferior. Corte el exceso de tejido con fórceps y tijeras para dejar el tejido olfativo incluyendo el OB y ​​OE.
   NOTA: No quite el cráneo que rodea al OB ya que éste retiene los glomérulos medianos alineados verticalmente rectos.
4. Sumerja el tejido olfativo en PBS para eliminar el aire en la cavidad nasal. Cortar la parte posterior del cerebro verticalmente y colocar el tejido olfativo en la parte inferior del molde de inclusión con la cara de corte hacia abajo. Llene el molde con el compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) y luego sumerja el molde en nitrógeno líquido.
   1. Después de que el tejido en el compuesto esté completamente congelado, incube en los cryosTat a -20 ° C durante 1 h.
5. Hacer secciones parasagitales en serie (10 μm) del OB con un criostato y recogerlas pegándolas a los portaobjetos revestidos con MAS. Después de pegar, seque las diapositivas inmediatamente con un secador.

3. Día 1: Immunostaining cuádruple de las rebanadas de OB

1. Lavar las diapositivas durante 5 min con PBS a RT. Repita 3 veces.
2. Bloquear los sitios de unión no específicos incubar las diapositivas durante 1 hora con la solución de bloqueo al 5% a RT.
3. Incubar las diapositivas O / N con un cóctel de anticuerpos primarios (400 μl cada diapositiva) en la solución de bloqueo al 1% a RT. Utilizar los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-Kirrel2 de guinea pig (1: 1000), anticuerpo anti-Semaphorin-7A (Sema7A) de cabra (1: 500), anticuerpo anti-OL-protocadherina de rata (1: 500) Y anticuerpo transportador de glutamato anti-vesicular de ratón2 (VGLUT2) (1: 500).

4. Día 2: Inmunotinción Cuádruple del OBRebanadas

1. Deseche la solución de anticuerpo primario y lave las diapositivas durante 5 min con PBST a RT. Repita 3 veces.
2. Incubar las diapositivas durante 1 h con un cóctel de anticuerpos secundarios (400 μ l cada diapositiva) en PBS a RT. Utilice los siguientes anticuerpos secundarios: burro anti-ratón Alexa Fluor 405 (1: 400), burro anti-cabra Alexa Fluor 488 (1: 400), burro anti-guinea Alexa Fluor 555 (1: 400) Rata Alexa Fluor 647 (1: 400).
   NOTA: Todos los anticuerpos secundarios deben proceder de la misma especie huésped. Elija una longitud de onda diferente de la fluorescencia de anticuerpos secundarios para cada anticuerpo primario para asegurar que no se superponen las longitudes de onda.
3. Desechar la solución y lavar los portaobjetos durante 5 minutos con PBS a RT. Repita 3 veces.
4. Monte los cubreobjetos en las diapositivas con el medio de montaje. Para ello, aplique 2 gotas del medio de montaje en cada portaobjetos y, a continuación, coloque un cubreobjetos quitando las burbujas de aire.

5. Intensidad MeAsentamientos

1. Obtener imágenes fluorescentes con un microscopio de fluorescencia. Utilice los siguientes cubos de filtro: Cubo de filtro DAPI (excitación de 360/40 nm, emisión de 460/50 nm y espejo dicroico de 400 nm) para señales Alexa Fluor 405, cubo de filtro GFP (excitación de 470/40 nm, emisión de 525/50 nm, Y un espejo dicroico de 495 nm) para Alexa Fluor 488, cubo de filtro TRITC (excitación de 545/25 nm, emisión de 605/70 nm y espejo dicroico de 565 nm) para Alexa Fluor 555 y cubo de filtro Cy5 (excitación de 620/60 nm, 700 / Emisión de 75 nm, y espejo dicroico de 600 nm) para Alexa Fluor 647.
   Nota: Ajuste el tiempo de exposición para obtener señales fluorescentes de la imagen sin saturación.
2. Definir la estructura glomerular por las señales de inmunofluorescencia de VGLUT2. Medir las intensidades de tinción de las moléculas de clasificación de axones dentro de los glomérulos con ImageJ.

6. Análisis de datos

1. Reste las señales de fondo de las intensidades de tinción de las moléculas de clasificación axónica.
2. PrepararE matriz de datos de expresión, que tiene columnas compuestas de moléculas de clasificación de axones y filas compuestas por los glomérulos.
3. Realizar un análisis de componentes principales (PCA) utilizando el conjunto de datos de expresión preparado. Luego, obtenga los puntajes de PCA, cocientes de contribución y cargas de factores de cada componente principal.

Resultados

El mapa glomerular olfativo está formado por la orientación global inicial y posterior segregación glomerular de los axones OSN ^{1 , 2} . La segregación glomerular está regulada por las interacciones axonales adhesivas / repulsivas mediadas por moléculas de clasificación axónica cuyos niveles de expresión están determinados por moléculas OR expresadas ⁷ . Las moléculas de clasificación de axones...

Discusión

La inmunotinción cuádruple de las secciones OB parasagitales permitió la visualización y cuantificación de los niveles de expresión de hasta cuatro moléculas de clasificación de axones simultáneamente en un mayor número de glomérulos. Al analizar estos datos multivariables con PCA, se pueden especular las características para la expresión de esas moléculas.

Para una tinción exitosa, la preparación de muestras de tejido es de importancia crítica. Algunos protocolos sugieren q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Skim Milk	nacalai tesque	31149-75
goat anti-Sema7A antibody	R&D Systems	AF2068
rat anti-OLPC antibody	Merck Millipore	MABT20
mouse anti-VGLUT2 antibody	Merck Millipore	MAB5504
goat anti-BIG-2 antibody	R&D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibody	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)	Wako	162-16065
MAS coated slide glasses	MATSUNAMI	MAS-01
forceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X700
DAPI filter cube	KEYENCE	OP-87762
GFP filter cube	KEYENCE	OP-87763
TRITC filter cube	KEYENCE	OP-87764
Cy5 filter cube	KEYENCE	OP-87766
filter paper	ADVANTEC	00011185
O.C.T compound	Sakura Finetek	M71484