Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

Özet

Koku duyu nöronları, uygun sinirsel devreleri oluşturmak için çok çeşitli akson sıralama moleküllerini ifade eder. Bu protokol, olfaktör duyu nöronlarının akson ucunda akson sıralama moleküllerinin kombinatoryal ifadelerini görselleştirmek için bir immünohistokimyasal boyama yöntemi tarif eder.

Özet

Fare koku sistemi, basit anatomik yapısı nedeniyle sinirsel devre oluşum mekanizmalarını incelemek için sıklıkla kullanılır. Bir Koku Giderici Nöron (OSN), tek bir dendrit ve tek bir dalkonsuz akson bulunan iki kutuplu bir hücredir. Bir OSN yalnızca bir Olfaktor Reseptör (OR) geni ifade eder; belirli bir OR türünü ifade eden OSN'ler, aksonlarını Olfaktör Ampul (OB) 'de birkaç değişmez glomerül setine yaklaştırır. OSN projeksiyonunun dikkate değer bir özelliği, ifade edilen OR'lerin aksonal projeksiyonda öğretici roller oynamasıdır. ORs, çoklu akson sıralama moleküllerinin ekspresyonunu düzenler ve OSN akson ucunda akson sıralama moleküllerinin kombinatoryal moleküler kodunu üretir. Dolayısıyla, VEYA'ya özgü akson yönlendirici mekanizmaların moleküler mekanizmalarını anlamak için, aynı glomerül içerisinde OSN akson ucunda ifade profillerini karakterize etmek hayati önem taşımaktadır. Bu makalenin amacı, mümkün olduğu kadar çok glomerül toplamak için yöntemler tanıtmaktır.Tek bir OB bölümünde ve birden fazla antikor kullanılarak immün boyamanın gerçekleştirilmesi için. Bu, akson sıralama moleküllerinin ekspresyon modellerinin karşılaştırılması ve analiz edilmesine, OB bölümleri arasında renk değişikliği yapmadan izin verir.

Giriş

Gelişme sırasında nöronlar, normal beyin fonksiyonu için kritik olan uygun sinirsel devreleri oluşturmak için birbirleriyle tam olarak bağlantılıdır. Beyindeki anormal sinirsel devrelerin, otizm ve şizofreni gibi zihinsel rahatsızlıkların nedeni olduğu düşünülürse, sinirsel devre oluşum mekanizmalarını anlamak, sinirbilimi alanındaki en büyük zorluklardan biridir.

Fare olfaktör sisteminde, Olfaktor Epitelyumdaki (OE) her Koku Giderici Nöron (OSN), yalnızca bir fonksiyonel Olfaktör Reseptör (OR) genini ifade eder ve aynı OR'yi ifade eden OSN'ler, aksonları belirli klonlama noktalarına, Koku dolabı (OB) ^{1 , 2} . Fare koku sistemi, sinirsel devre oluşumunun moleküler mekanizmalarını incelemek için mükemmel bir model sistemidir çünkü araştırmacılar OR ifadesini belirli bir sUbtype OSNs ve net glomerüler yapılar olarak OSN aksonların projeksiyon yerleri görselleştirmek. OSN projeksiyonunun dikkati çeken bir özelliği, OR'lerin OSB aksonlarını OB ^{3 , 4 , 5 , 6'ya} yansıtmada öğretici rol oynamasıdır. Daha spesifik olarak, OSN aksonları yaklaşık hedef bölgelere yönlendirildikten sonra, OR'ye bağımlı bir şekilde glomerulus oluşturmak üzere ayrılırlar. Önceki çalışmalar, OR moleküllerinin glomerüler ayrımı düzenleyen akson ayırma moleküllerinin ekspresyonunu kontrol ettiğini göstermiştir 7,8. Dahası, biriken kanıtlar, OR moleküllerinin akson sıralama moleküllerinin benzersiz bir kombinasyonu ile nöronal kimlik kodunu ürettiklerini göstermektedir ⁹ . Dolayısıyla, VEYA'ya bağlı glomerüler ayrışmanın mekanizmasını anlamak için, akson sıralama molekülünün ekspresyon profillerinin karakterize edilmesi gereklidirOSK'larda ecules.

Flüoresan immün boyama, spesifik genlerin ekspresyonunu görselleştirmek için yaygın bir yöntemdir. Akson ayırma moleküllerinin proteinleri ağırlıklı olarak OSN aksonlarına lokalize olduğundan, araştırmacılar OSN'lerdeki ifade şekillerini karakterize etmek için OB bölümlerini kullanmaları gerekir. OB'nin koronal kesitlemesi immün boyama için rutin olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu preparat aynı OB bölümünde anterior-posterior eksen boyunca topografik bilgiyi kaybeder. Bu nedenle, OB'nin medial tarafında aynı OB bölümünde olabildiğince çok çevreleyen glomerül yükleyebilen parasagital bir preparat geliştirdik. Birden fazla antikor kullanılarak immün boyama ile bir araya getirilen bu preparasyon, akson ayırma moleküllerinin ekspresyon modellerinin karşılaştırılması ve analiz edilmesine izin verir ve OB bölümleri arasında renk değişikliği yapmaz.

Ayrıca, immünhistokimyasal bir boyama yöntemi, PFA ile fiksasyon sonrası uygulanmadan sunulmuştur.Sekroz tedavisi. Bu yöntem, araştırmacıların çok değişkenli veri analizi için yeterli yüksek kaliteli boyama verilerini elde etmelerini sağlar. Burada sunulan protokoller, olfaktör sinirsel devre oluşumunu inceleyen araştırmacılar için güçlü yöntemlerin ayrıntılarını verecektir.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, Tokyo Üniversitesi'ndeki hayvan deney etik komitesinin onayı ve Tokyo Üniversitesi tarafından laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili kurallarına uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Çözümlerin Hazırlanması

1. 0.01 M Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) hazırlayın: 1 L damıtılmış suya bir PBS tableti (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO ₄ ^3- , pH 7.4) ilave edin ve tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında karıştırın.
2. PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın: 100 mL PBS'ye 4 g PFA ekleyin. Çözeltiyi tamamen çözülene kadar 60 ° C'de karıştırın.
   1. PFA'nın PBS'de çözülmesinden sonra, çözeltinin pH'ını 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ile 7.4'e ayarlayın. Ardından, buz üzerinde soğutun ve partiküler maddeleri temizlemek için çözeltiyi bir filtre kağıdından geçirin. 4 ° C'de saklayın.
      Dikkat: Bu reaktifleri kullanırken dikkatli olun. SapDikkatli olun ve eldivenleri, emniyet gözlükleri ve laboratuar önlüğü kimyasal bir başlık altına alın.
      NOT: 2 d içerisinde hazırlanan yeni% 4 PFA solüsyonu kullanın.
3. % 0,3 Triton X-100 (PBST) ile desteklenmiş 0.01 M PBS hazırlayın: 3 ml Triton X-100 ila 997 mL PBS ekleyin. Çözeltiyi, tamamen eriyene kadar karıştırın.
4. % 1 ve% 5 bloke edici çözelti hazırlayın:% 5 engelleme çözeltisi hazırlamak için 200 mL PBST'ye 10 gr yağsız süt ekleyin. Tamamen çözünene kadar oda sıcaklığında karıştırın. % 1 bloklama solüsyonu hazırlamak için PBST ile% 5 engelleme solüsyonunu beş kez seyreltin.

2. Parasagittal OB Bölümlerinin Hazırlanması

1. 1-2 haftalık hayvanlar kullanın. Bu yaş grupları, aşağıdaki deneyler için uygundur, çünkü glomerüller açıkça görülebilir ve beyin kafatası ile kesilebilir.
2. Hayvanı intraperitoneal pentobarbital enjeksiyonu (50 mg / kg vücut ağırlığı) ile anestezi altına alınız. Hayvanı transcardially buz soğukluğunda% 4 P ile besleyinPBS'de FA. Kimyasal kaputun altında dikkatlice tutun ve eldivenleri, güvenlik gözlükleri ve laboratuar önlüğü kullanın.
3. Perfüzyon sonrasında, başını makasla kesin ve cildi dikkatli bir şekilde çıkarın. Ardından, üst ve alt dişler arasındaki boşluğa makas bıçağı takın ve alt çene kemiği kaldırmak için yatay olarak kesiniz. OB ve OE dahil olmak üzere koku alma dokusunu terketmek için fazla doku forseps ve makasla alın.
   NOT: OB'yi çevreleyen kafatasını çıkarmayın, çünkü medial glomerülleri dikey olarak hizalanmış tutar.
4. Burun boşluğundaki havayı çıkarmak için koku alma dokusunu PBS'ye daldırın. Beynin arka kısmını dikey olarak kesin ve koku alma dokusunu, kesme yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirme kalıbının altına yerleştirin. Kalıbı Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun ve ardından kalıp sıvı nitrojene batırın.
   1. Bileşikteki doku tamamen donduktan sonra, kriyolarda inkübe edin-20 ° C'de 1 saat bekletme.
5. Bir kriyostat ile OB'nin seri parasagittal kesitlerini (10 μm) yapın ve bunları MAS kaplı cam slaytlara tutturarak toplayın. Yapışkan olduktan sonra, slaytları bir üfleme kurutucu ile hemen kurutun.

3. Gün 1. OB Dilimlerinin Dörtlü İmmün Sıyırılması

1. Slaytları 5 dakika oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
2. Slaytları, oda sıcaklığında% 5 engelleme solüsyonuyla 1 saat inkübe ederek spesifik olmayan bağlanma yerlerini bloke edin.
3. Slaytları O / N, oda sıcaklığında% 1 engelleme solüsyonunda birincil antikorların (her bir slaytta 400 μL) bir kokteyl ile inkübe edin. Aşağıdaki primer antikorları kullanın: kobay anti Kirrel2 antikoru (1: 1000), keçi anti-Semaforin-7A (Sema7A) antikoru (1: 500), sıçan anti-OL-protokadherin (OLPC) antikoru (1: 500) Ve fare anti-veziküler glutamat taşıyıcı 2 (VGLUT2) antikoru (1: 500).

4. Gün 2. OB'nin Dörtlü İmmün Sıyırılmasıdilimler

1. Birincil antikor çözeltisini atın ve slaytları RT'de PBST ile 5 dakika boyunca yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
2. Slaytları, oda sıcaklığında PBS içinde ikincil antikorların (her bir slayttan 400 μL) bir kokteyl ile 1 saat inkübe edin. Aşağıdaki ikincil antikorları kullanın: eşek anti-fare Alexa Fluor 405 (1: 400), eşek anti-keçi Alexa Fluor 488 (1: 400), eşek anti-gine domuz Alexa Fluor 555 (1: 400) ve eşek anti- Sıçan Alexa Fluor 647 (1: 400).
   NOT: Tüm ikincil antikorlar aynı konakçı türe ait olmalıdır. Her birincil antikor için ikincil antikorların floresansının farklı bir dalga boyu seçerek dalga boylarının örtüşmesini sağlamayın.
3. Çözümü atın ve slaytları oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
4. Lamelleri montaj ortamı ile slaytlar üzerine monte edin. Bunun için, her slayt üzerine 2 damla montaj malzemesi uygulayın ve sonra hava kabarcıklarını giderecek şekilde lamel koyun.

5. Yoğunluk Measurements

1. Floresan bir mikroskop ile floresan görüntü elde edin. Aşağıdaki filtre küplerini kullanın: Alexa Fluor 405 sinyalleri, GFP filtre küpü için (470/40 nm uyarılma, 525/50 nm emisyon, DIP filtresi küpü (360/40 nm uyarılma, 460/50 nm emisyon ve 400 nm dikroik ayna) Ve Alexa Fluor 555 ve Cy5 filtre küpü için (620/60 nm uyarılma, 700) 495 nm dikey renk aynası) için Alexa Fluor 488, TRITC filtre küpü (545/25 nm uyarılma, 605 / 70nm emisyon ve 565 nm dikroik ayna) / 75 nm emisyon ve 600 nm dikroik ayna) Alexa Fluor 647 için.
   Not: Görüntünün doygunluk olmadan floresan sinyalleri elde etmek için pozlama süresini ayarlayın.
2. Glomerüler yapıyı VGLUT2'nin immünofloresan sinyalleri ile tanımlayın. ImageJ ile glomeruller içindeki akson sıralama moleküllerinin boyama yoğunluğunu ölçün.

6. Veri Analizi

1. Akson sıralama moleküllerinin boyama yoğunluklarından arka plan sinyallerini çıkarın.
2. HazırlayınEkspresyon veri matrisi, akson ayırma moleküllerinden ve glomerüllerden oluşan sıralardan oluşan sütunlara sahiptir.
3. Hazırlanan ifade veri setini kullanarak bir ana bileşen analizi (PCA) yapın. Ardından, her temel bileşenin PCA puanlarını, katkı oranlarını ve faktör yüklemelerini elde edin.

Sonuçlar

Koku sonrası glomerüler harita ilk küresel hedefleme ve ardından OSN aksonlarının ^{1 , 2} glomerüler segregasyonu ile oluşur. Glomerüler ayrım, ekspresyon seviyeleri eksprese edilen OR molekülleri ⁷ tarafından belirlenen akson ayırma moleküllerinin aracılık ettiği yapışkan / itici aksonal etkileşimlerle düzenlenir. Glomerüler ayrıma dahil olan akson ayırma molekülleri, OB

Tartışmalar

Parasagittal OB bölümlerinin dörtlü immün boyası, daha fazla sayıda glomerül içerisinde eş zamanlı olarak dört akson sıralama molekülünün ekspresyon seviyelerinin görselleştirilmesini ve sayısallaştırılmasını sağladı. Bu çok değişkenli veriyi PCA ile analiz ederek, bu moleküllerin ifadesinin özellikleri spekülasyona tabi tutulabilir.

Başarılı bir boyama için, doku örneği hazırlığı kritik öneme sahiptir. Bazı protokoller dokuların% 4'lük PFA i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Skim Milk	nacalai tesque	31149-75
goat anti-Sema7A antibody	R&D Systems	AF2068
rat anti-OLPC antibody	Merck Millipore	MABT20
mouse anti-VGLUT2 antibody	Merck Millipore	MAB5504
goat anti-BIG-2 antibody	R&D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibody	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)	Wako	162-16065
MAS coated slide glasses	MATSUNAMI	MAS-01
forceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X700
DAPI filter cube	KEYENCE	OP-87762
GFP filter cube	KEYENCE	OP-87763
TRITC filter cube	KEYENCE	OP-87764
Cy5 filter cube	KEYENCE	OP-87766
filter paper	ADVANTEC	00011185
O.C.T compound	Sakura Finetek	M71484