후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

요약

후각 감각 뉴런은 적절한 신경 회로를 만들기 위해 다양한 축삭 정렬 분자를 발현합니다. 이 프로토콜은 후각 감각 뉴런의 축삭 종말에 축삭 - 정렬 분자의 조합 표현을 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색법을 설명합니다.

초록

마우스 후각 시스템은 간단한 해부학 구조로 인해 신경 회로 형성 메커니즘을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 후각 감각 뉴런 (OSN)은 단일 수상 돌기 및 단일 비 축삭 축색 돌기가있는 양극성 세포입니다. OSN은 하나의 후각 수용체 (OR) 유전자 만 발현하며, 주어진 유형의 OR을 표현하는 OSN은 그들의 축색 돌기를 후각 망막 (OB)의 불변성 사구체에 수렴시킵니다. OSN 예측의 두드러진 특징은 표현 된 OR이 축삭 투영에서 중요한 역할을한다는 점입니다. OR는 다중 axon-sorting 분자의 발현을 조절하고 OSN 축삭 말단에서 axon-sorting 분자의 조합 분자 코드를 생성한다. 따라서, OR- 특정 axon 유도 메커니즘의 분자 메커니즘을 이해하기 위해서는 동일한 사구체 내의 OSN 축삭 말단에서 그들의 발현 프로파일을 특성화하는 것이 중요합니다. 이 기사의 목적은 가능한 많은 사구체를 수집하는 방법을 소개하는 것이 었습니다e를 단일 OB 부위에 투여하고 다중 항체를 사용하여 면역 염색을 수행한다. 이것은 OB 절 사이의 얼룩 변이없이 축색 - 정렬 분자의 발현 양상을 비교 분석 할 수있게한다.

서문

개발하는 동안, 뉴런은 서로 정확하게 연결되어 정상적인 뇌 기능에 중요한 적절한 신경 회로를 형성합니다. 뇌의 비정상적인 신경 회로는 자폐증 및 정신 분열증과 같은 정신 장애의 원인으로 여겨지므로 신경 회로 형성 메커니즘을 이해하는 것이 신경 과학 분야의 주요 과제 중 하나입니다.

마우스 후각 시스템에서 Olfactory Epithelium (OE)의 각 감각 신경 세포 (OSN)는 오직 하나의 기능적 후각 수용체 (OR) 유전자를 발현하고 동일한 OR을 발현하는 OSNs는 축색 돌기의 고정 된 위치에서 사구체의 특정 쌍에 축삭을 수렴시킵니다. 후각 망막 (OB) ^{1 , 2} . 마우스 후각 시스템은 신경 회로 형성의 분자 메커니즘을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 연구자는 OR 표현을 활용하여 특정 s를 식별 할 수 있기 때문에OSNs의 ubtype과 명확한 사구체 구조로 OSN axons의 투영 사이트를 시각화. OSN 예측의 주목할만한 특징은 OR이 OSN 축색 돌기를 OB ^{3 , 4 , 5 , 6} 에 투사 할 때 중요한 역할을한다는 점입니다. 보다 구체적으로, OSN 축삭 돌기가 표적 부위를 대략적으로 안내 한 후에, 이들은 분리되어 OR 의존성 방식으로 사구체를 형성한다. 이전의 연구는 OR 분자가 사구체 분리를 조절하는 축삭 정렬 분자의 발현을 조절한다는 것을 보여 주었다. 더욱이 축적 된 증거에 따르면 OR 분자는 축삭 정렬 분자의 독특한 조합에 의해 신경 신원 코드를 생성한다. 따라서, OR 의존성 사구체 분리의 메커니즘을 이해하기 위해서는 axon-sorting mol의 발현 프로파일을 특성화 할 필요가있다OSNs의 ecules.

형광 면역 염색은 특정 유전자의 발현을 시각화하는 일반적인 방법입니다. axon-sorting 분자의 단백질은 주로 OSN 축삭에 국한되어 있기 때문에 연구자들은 OBN을 이용하여 OSN에서의 발현 양상을 분석 할 필요가있다. OB의 관상 절편은 면역 염색에 일상적으로 사용되었습니다. 그러나,이 준비는 같은 OB 섹션에서 전후 축을 따라 지형 정보를 잃습니다. 따라서 우리는 OB의 내측의 parasagittal 준비를 개발했다. 이것은 같은 OB 구역에서 가능한 한 많은 주변 사구를 장착 할 수있다. 여러 항체를 이용한 면역 염색과 결합하여, OB 절 사이의 염색 변이없이 축삭 정렬 분자의 발현 양상을 비교 분석 할 수 있습니다.

또한, 면역 조직 화학 염색 방법은 PFA a와 함께 고정 후 (post-fixation)없이 제시되었다자당 치료. 이 방법을 통해 연구자는 다 변수 데이터 분석을위한 고품질의 염색 데이터를 얻을 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 후각 신경 회로 형성을 연구하는 연구자에게 강력한 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 도쿄 대학의 동물 실험 윤리위원회의 승인과 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 도쿄 대학의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 0.01 M 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비합니다 : PBS 정제 (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO ₄ ^3- , pH 7.4)를 증류수 1 L에 넣고 완전히 용해 될 때까지 실온에서 저어줍니다.
2. PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비합니다 : 100 ML PBS에 4g의 PFA를 추가합니다. 그것이 완전히 녹을 때까지 60 ° C에서 용액을 저어 준다.
   1. PBS에 PFA를 용해시킨 후, 1N 수산화 나트륨 (NaOH)으로 용액의 pH를 7.4로 조절한다. 그런 다음 얼음으로 식힌 다음 여과지를 통해 용액을 여과하여 미립자 물질을 제거합니다. 4 ° C에서 보관하십시오.
      주의 :이 시약을 사용할 때는 적절한주의를 기울이십시오. 핸들장갑, 안전 안경 및 화학 물질 두건 아래 실험실 코트를 조심스럽게 사용하십시오.
      참고 : 2 일 이내에 준비된 신선한 4 % PFA 용액을 사용하십시오.
3. 0.3 % Triton X - 100 (PBST)가 보충 된 0.01M PBS를 준비하십시오 : PBS의 997 ML에 트리톤 X - 100 3 ML을 추가합니다. 용액이 완전히 녹을 때까지 실온에서 교반하십시오.
4. 1 % 및 5 % 블로킹 용액을 준비한다 : 탈지유 10g을 PBST 200mL에 넣고 5 % 블로킹 용액을 만든다. 그것이 완전히 녹을 때까지 실온에서 교반하십시오. PBST로 5 % 블로킹 용액을 5 번 희석하여 1 % 블로킹 용액을 제조한다.

2. Parasagittal OB 섹션의 준비

1. 1 ~ 2 주령의 동물을 사용하십시오. 사구체가 명확하게 보이고 두개골로 뇌를 절단 할 수 있기 때문에이 연령대는 다음 실험에 적합합니다.
2. pentobarbital (50 MG / kg 체중)의 intraperitoneal 주사로 동물을 마취. 얼음 냉 4 % P로 동물을 경련 주사한다.PBS의 FA. 조심해서 다루고 화학 물질 두건 아래에 장갑, 안전 고글 및 실험실 코트를 사용하십시오.
3. 관류 후 가위로 머리를 잘라 피부를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 가위 칼날을 위턱과 아래턱 사이의 공간에 삽입하고 수평으로 자르면서 아래턱을 제거합니다. OB 및 OE를 포함하여 후각 조직을 떠나려면 집게 및 가위로 과도한 조직을 정리하십시오.
   참고 : OB를 둘러싸고있는 두개골을 제거하지 마십시오. 이것은 중간 사구체를 수직으로 똑바로 유지하기 때문에 OB를 둘러싼 두개골을 제거하지 마십시오.
4. 비강에있는 공기를 제거하기 위해 PBS에 후각 조직을 담그십시오. 뇌의 후부를 수직으로 잘라 내고 후각 조직을 삽입면의 아래쪽에 삽입하십시오. 몰드에 Optimal Cutting Temperature (OCT) 화합물을 채우고 액체 질소에 몰드를 담그십시오.
   1. 화합물에있는 조직이 완전히 얼린 후에, 그것을 cryos에서 품어 라.-20 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
5. 저온 유지 장치를 사용하여 OB의 직렬 parasagittal 섹션 (10 μm)을 만들고 MAS 코팅 유리 슬라이드에 부착하여 수집하십시오. 붙인 후 즉시 블로 드라이어로 슬라이드를 건조하십시오.

3. 1 일째 : OB 슬라이스의 4 배 Immunostaining

1. RT에서 PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오.
2. 실온에서 5 % 차단 솔루션과 슬라이드를 1 시간 품어 비특이적 인 바인딩 사이트를 차단합니다.
3. RT에서 1 % 차단 솔루션의 기본 항체 (각 슬라이드 400 μL)의 칵테일과 O / N 슬라이드를 품어. 기니피그 항 Kirrel2 항체 (1 : 1000), 염소 항 세마포린 -7A (Sema7A) 항체 (1 : 500), 래트 항 -OL- 프로토 커 들린 (OLPC) 항체 (1 : 500) 및 마우스 항 - 소 혈청 글루타메이트 트랜스 포터 2 (VGLUT2) 항체 (1 : 500).

4. 2 일째 : OB의 4 배 Immunostaining조각

1. 일차 항체 용액을 버리고 RT에서 PBST로 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오.
2. RT에서 PBS의 보조 항체 (각 슬라이드 400 μL)의 칵테일과 1 시간 슬라이드를 품어. 당나귀 항 마우스 Alexa Fluor 405 (1 : 400), 당나귀 방제 Alexa Fluor 488 (1 : 400), 당나귀 항 기니아 피그 Alexa Fluor 555 (1 : 400) 및 당나귀 항 - 쥐 Alexa Fluor 647 (1 : 400).
   참고 : 모든 2 차 항체는 동일한 숙주에서 유래한다. 파장이 겹치지 않도록 각 1 차 항체에 대한 2 차 항체의 형광 파장을 선택하십시오.
3. 솔루션을 폐기하고 RT에서 PBS로 5 분 슬라이드를 씻으십시오. 3 번 반복하십시오.
4. 마운트 매체로 슬라이드에 coverslips를 마운트합니다. 이를 위해, 각 슬라이드에 장착 매체 2 방울을 적용한 다음, 기포를 제거하여 coverslip을 넣어.

5. 강도 Me의구심

1. 형광 현미경으로 형광 이미지를 얻습니다. Alexa Fluor 405 신호, GFP 필터 큐브 (470/40 nm 여기, 525/50 nm 방출, 500 nm 방출, 400 nm 다이크로 익 미러)에 대해 DAPI 필터 큐브 (360/40 nm 여기, 460/50 nm 방사 및 400 nm 다이크로 익 미러) 및 495 nm 다이크로 익 미러), Alexa Fluor 555 용 TRITC 필터 큐브 (545/25 nm 여기, 605/70 nm 방출 및 565 nm 다이크로 익 미러) 및 Cy5 필터 큐브 (620/60 nm 여기, 700 / 75 nm emission, 600 nm dichroic mirror)을 Alexa Fluor 647에 적용했습니다.
   참고 : 채도가없는 이미지의 형광 신호를 얻으려면 노출 시간을 조정하십시오.
2. VGLUT2의 immunofluorescence 신호로 사구체 구조를 정의하십시오. ImageJ로 사구체 내 축삭 정렬 분자의 염색 강도를 측정합니다.

6. 데이터 분석

1. 축삭 정렬 분자의 얼룩 강도에서 배경 신호를 뺍니다.
2. 준비하기e 발현 데이터 매트릭스는 축삭 정렬 분자로 구성된 컬럼과 사구체로 구성된 행을 갖는다.
3. 준비된 표현 데이터 세트를 사용하여 주성분 분석 (PCA)을 수행하십시오. 그런 다음 각 주 구성 요소의 PCA 점수, 기여도 비율 및 요인 부하를 얻습니다.

결과

후각 사구체지도는 OSN 축삭 ^{1 , 2} 의 초기 전역 표적화 및 사후 사구체 분리에 의해 형성됩니다. 사구체 분리는 ax / sorting 분자에 의해 매개되는 접착 성 / 반발 축삭 상호 작용에 의해 조절됩니다.이 분자의 발현 수준은 발현 된 OR 분자에 의해 결정됩니다. 사구체 분리에 관련된 axon-sorting 분자는 OB ⁹ 에서 위치 ?...

토론

parasagittal OB 섹션의 4 배 면역 염색은 많은 수의 사구체에서 동시에 4 개의 축삭 정렬 분자의 발현 수준을 시각화하고 정량화 할 수있었습니다. 이러한 다변량 데이터를 PCA로 분석함으로써 이들 분자의 발현 특성을 추측 할 수 있습니다.

성공적인 염색을 위해서는 조직 샘플 준비가 매우 중요합니다. 일부 프로토콜은 조직을 4 % PFA로 후 고정시키고 cryoprotection을 위해 30 % sucrose...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Skim Milk	nacalai tesque	31149-75
goat anti-Sema7A antibody	R&D Systems	AF2068
rat anti-OLPC antibody	Merck Millipore	MABT20
mouse anti-VGLUT2 antibody	Merck Millipore	MAB5504
goat anti-BIG-2 antibody	R&D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2 antibody	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
donkey anti-rat Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Paraformaldehyde (PFA)	Wako	162-16065
MAS coated slide glasses	MATSUNAMI	MAS-01
forceps	Fine Science Tools	11253-27
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
dissecting scissors	Fine Science Tools	14090-09
fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X700
DAPI filter cube	KEYENCE	OP-87762
GFP filter cube	KEYENCE	OP-87763
TRITC filter cube	KEYENCE	OP-87764
Cy5 filter cube	KEYENCE	OP-87766
filter paper	ADVANTEC	00011185
O.C.T compound	Sakura Finetek	M71484