Segmentación de volumen y análisis de materiales biológicos con SuRVoS (Super-región segmentación de volumen) Workbench

Resumen

Segmentación de datos tridimensionales de muchas técnicas de imagen es un cuello de botella importante en análisis de sistemas biológicos complejos. Aquí, describimos el uso de SuRVoS Workbench datos volumétricos de segmento semi-automáticamente en varias escalas de longitud utilizando conjuntos de datos de ejemplo de tomography del cryo-electrón, cryo suave tomografía de rayos x y técnicas de tomografía de rayos x de contraste de fase.

Resumen

Segmentación es el proceso de aislar regiones específicas u objetos dentro de un volumen de imagen, para que puedan llevar a cabo un estudio más profundo en estas áreas de interés. Cuando se considera el análisis de sistemas biológicos complejos, la segmentación de los datos de la imagen tridimensional es un paso mucho tiempo y mano de obra intensiva. Con la mayor disponibilidad de muchas modalidades de imágenes y esquemas de colección de datos automatizada, esto plantea un mayor reto para el biólogo experimental moderno pasar de datos a conocimiento. Esta publicación describe el uso de SuRVoS Workbench, un programa diseñado para resolver estos problemas al proporcionar métodos para semiautomática segmento complejo volumétrico datos biológicos. Tres conjuntos de datos de diferentes aumentos y modalidades de la proyección de imagen se presentan aquí, cada uno destaca diferentes estrategias de segmentación con SuRVoS. Tomografía de rayos x de contraste fase (microCT) del cuerpo fructífero de una planta se utiliza para demostrar usando entrenamiento de modelo de segmentación, cryo tomografía de electrones (cryoET) de plaquetas humanas se utiliza para demostrar la segmentación utilizando super - megavoxels y crio suave Tomografía de rayos x (cryoSXT) de una línea de células de mamífero se utiliza para demostrar la etiqueta división herramientas. También se presentan estrategias y parámetros para cada tipo de datos. Por la mezcla de una selección de los procesos semiautomáticos en una sola herramienta interactiva, SuRVoS proporciona varios beneficios. En general se reduce el tiempo a los datos volumétricos de segmento por un factor de cinco en comparación con segmentación manual, uno de los pilares en muchos campos de procesamiento de imagen. Esto es un ahorro significativo al segmentación manual completo puede tomar semanas de esfuerzo. Además, se dirige subjetividad mediante el uso de cómputo identificados límites y división colecciones complejas de objetos por sus propiedades calculadas, en lugar de una base de caso por caso.

Introducción

El SuRVoS Workbench es un software diseñado para permitir a los investigadores extraer información científica relevante de los datos volumétricos de diferentes muestras, independientemente de la estructura de interés, la resolución o la proyección de imagen de modalidad^{1, 2}. Datos volumétricos como estas se recogen a menudo usando sistemas de tomografía de rayos x o electrones, habitualmente basan en grandes laboratorios o instalaciones centralizadas debido a su complejidad. Ambos de estos métodos y otras técnicas, producen grandes, información ricos conjuntos de datos que prueban desafiante segmento con cualquiera de los dos métodos semi-automáticos o manualmente. Particularmente, casi nativo estado inmovilizado cryo datasets requieren condiciones de dosis baja, resultando en una baja relación de señal a ruido y poco contraste, especialmente en cryo electron tomography (cryoET)^3,4,5 . Un factor adicional en algunos conjuntos de datos 3D es la presencia de artefactos introducidos por las difíciles condiciones experimentales implicadas, por ejemplo faltan artefactos de cuña debido a la recopilación de datos sobre una limitada inclinación gama, dando por resultado la falta de información y elongación en la dirección de la viga^3,4,5. Incluso cuando baja señal a ruido o artefactos de cuña que falta no son problemáticos (por ejemplo enfocado viga de ion SEM⁶ o serie bloque cara SEM⁷), la complejidad y la naturaleza tridimensional de la muestra y la gran cantidad de datos significan análisis sería todavía se benefician de un proceso automatizado para la segmentación de datos.

En la actualidad, al considerar volúmenes biológicos de las células, hay muchas opciones para la identificación de forma automática o semiautomática características celulares muy específicas, como la actina, microtúbulos o complejos de proteínas específicos, utilizando una búsqueda basada en plantilla, o identificación de características de determinados tipos de conjuntos de datos (por ejemplo, alto contraste, teñido, embebido en resina muestras)^8,9,10,11,12. Sin embargo, en estos casos a priori información o protocolos de preparación de muestra específico están necesarios, limitar la amplia aplicabilidad de estas estrategias de segmentación. También hay herramientas disponibles que realizan entrenamiento de modelo en el nivel de voxel para conocer la aparición de diversas estructuras de interés cuando dado el usuario entrada¹³. Sin embargo, en este nivel la complejidad de la formación y pruebas de los modelos puede ser computacionalmente costoso y propenso a errores. Segmentación manual, dadas las difíciles condiciones de imagen y la falta de estrategias de segmentación semiautomática, ampliamente aplicable, es común, incluso cuando se trabaja con materiales biológicos complejos^{14,15, 16 , 17}. sin embargo, está generalmente aceptado que el proceso de la segmentación manual no es sólo desperdiciador de tiempo, pero también errores, subjetiva y variable^{4,5,18,19 ,20}. Algunos programas de segmentación ofrecen herramientas para facilitar el proceso de segmentación manual (es decir, interpolación, lasso o herramientas de golpe)^21,22, sin embargo, en los casos de conjuntos de datos ruidosos, son difíciles de aplicar con éxito, y incluso cuando se utilizan con éxito, el proceso es todavía subjetiva y variable.

Tradicionalmente, se han utilizado segmentaciones de dos distintas maneras: cualitativa o cuantitativamente. Como mejoran la imagen de tecnologías y estrategias de segmentación, se ha vuelto más habitual utilizar la segmentación como una herramienta para responder a cuestiones biológicas y como una "verdad de la tierra" para el algoritmo desarrollo^{8,12, 15,23,24,25}. Para ello, equilibrios y controles detallados se requieren para disminuir la variabilidad y subjetividad en el proceso²⁶. Sin embargo, estas precauciones más aumentan la naturaleza desperdiciadora de tiempo de la segmentación. Debido a esto, es fundamental para proporcionar una estrategia de segmentación más rápida y menos variable.

Banco de trabajo SuRVoS comienza a abordar estas cuestiones proporcionando al usuario una selección del aprender de máquina y herramientas que ayudan al usuario en el proceso de segmentación, al tiempo que también guía al usuario a través de los pasos requeridos de procesamiento de imágenes. Para lograr esto, dos innovaciones claves se aplican juntos en SuRVoS. En primer lugar, utiliza una jerarquía de súper región al grupo similar, regiones cercanas de los datos basan en sus propiedades inherentes. Cada una de las regiones en la jerarquía representa el mismo volumen utilizando menos elementos, mientras que todavía proporciona adherencia límite fuerte. Así, las regiones súper reducen la complejidad de la segmentación de un volumen por varios órdenes de magnitud todavía siguen representan los datos sin pérdida significativa de información²⁷. En segundo lugar, SuRVoS proporciona una estrategia de segmentación semiautomática que usa entradas de segmentación manual mínima para entrenar clasificadores, que se utilizan para segmentar el restante volumen^28,29. Esta estrategia reduce la segmentación manual, grandemente disminuyendo la cantidad de tiempo de usuario en segmentación y, al usar las Super regiones, elimina manual delineación de límites, potencialmente reduciendo la variabilidad y subjetividad.

Otra característica clave de SuRVoS es la herramienta del separador etiqueta, por el que un usuario puede clasificar una serie de objetos ya segmentadas basada en sus propiedades inherentes. Después de la segmentación de diversos objetos de interés, esta herramienta puede utilizarse para dividir el conjunto en subclases basadas en medidas tales como la intensidad del objeto media, varianza, tamaño, ubicación, etc. resulta útil para clasificar a grupos grandes de objetos con alta complejidad. Por ejemplo, se puede dividir un grupo de organelos celulares en las mitocondrias, vesículas vacías, gotas lipídicas, etcetera.; o un conjunto de inclusiones pueden ser separadas del material basado en el tamaño o forma. Una vez segmentadas las etiquetas individuales puede ser dividida en grupos usando cualquier número de clasificadores, reduciendo el sesgo de identificación.

El SuRVoS Workbench se ha utilizado con éxito a los datos de segmento de varias técnicas de imagen. Aquí, el sincrotrón radiografía fase contraste tomografía (microCT) del cuerpo fructífero de una planta se utiliza para demostrar segmentatisobre el uso de entrenamiento modelo, cryo tomografía de electrones (cryoET) de plaquetas humanas se utiliza para demostrar la segmentación utilizando super y megavoxels y tomografía de rayos x suave cryo (cryoSXT) de una línea de células de mamífero se utiliza para demostrar la etiqueta división herramientas

Protocolo

Nota: generalmente las gamas útiles de parámetros para cada paso de proceso y los parámetros específicos para cada tipo de datos se muestra a continuación se proporcionan en la tabla 1.

1. preparar un espacio de trabajo y los datos de carga

1. lanzar SuRVoS Workbench, haga clic en el botón open dataset y en la ventana resultante, seleccione el archivo de datos a ser segmentados. Elegir una adecuada orientación del conjunto de datos. A continuación, elija o cree una carpeta donde se almacenará el espacio de trabajo y los archivos asociados. Se recomienda que esta carpeta está vacía cuando se inicia una nueva segmentación. Después de que se ha cargado los datos, se abrirá la mesa de trabajo con el panel de Plugins de la izquierda, el panel de visualización a la derecha y un conjunto de métodos abreviados de la herramienta entre los dos cristales ( figura 1).

2. Preprocesamiento y representación de datos

1. en el ROI seleccione ficha, de entrada la salida z, y y x y coordenadas del extremo de la región de interés y haga clic en Agregar. Para elegir la adecuada y y x coordenadas coloca el ratón sobre un punto en la imagen. Elegir z coordenadas usando el control deslizante en la parte superior del panel de visualización. Una vez que se ha añadido una región, asegúrese de que está seleccionado activando la casilla a la derecha. Todos los cálculos posteriores se realizarán en la región seleccionada. En general, a partir de un pequeño, aconseja representante región de interés (ROI), optimización de parámetros y luego volver a aplicar estos parámetros para toda el área a ser segmentados.
2. Ficha en canales función, utilice el menú desplegable en la parte superior para elegir un función de filtro y añadir a la cola (ver la discusión para más información sobre canales de función). Una vez un función de filtro ha sido seleccionado haciendo clic en su nombre, modificar opciones específicas a la función de filtro y elija el conjunto de datos de entrada en el que se ejecute la función de filtro. Una vez elegidas todas las opciones, haga clic en la casilla de verificación a la derecha del nombre de la función filtro para calcular.
   1. Con el fin de optimizar los parámetros para un nuevo conjunto de datos, agregar características de filtros múltiples y elegir los parámetros, antes de ser computada en orden, uno tras otro. Para hacer esto, agregar cada filtro novedad seleccionar parámetros adecuados, marque la casilla a la izquierda de cada filtro/función a ejecutar y haga clic en el cuadro de características de cálculo en la parte superior del panel. Ver la discusión para obtener más información.

3. Generar regiones súper apropiadas

ficha

1. en las Super regiones, en la sección de Supervoxels, utilice el menú desplegable de fuente para seleccionar el conjunto de datos filtrado desde el que se creará supervoxels. Continuación, especifique la forma, espacio y compacidad de la supervoxels (véase la discusión y la figura 2 para más detalles). Por último, haga clic en el botón aplicar para generar el supervoxels. Una vez que se han creado los supervoxels puede verse en el panel de visualización, encendida o apagar y la transparencia en la pestaña de visualización y acceso directo de la ventana del visor.
2. Ficha en las Super regiones, en la sección de Megavoxels, utilice el menú desplegable de fuente para seleccionar el conjunto de datos filtrado desde el que se creará megavoxels. A continuación, especifique la lambda, numBins y los parámetros de la Gamma de la megavoxels (véase la discusión para más detalles). Una vez que se han creado los megavoxels puede verse en el panel de visualización, encendida o apagar y la transparencia en la pestaña de visualización y acceso directo de la ventana del visor.

4. Introducción a la anotación

1. las anotaciones en la ficha utilice el botón Agregar nivel para añadir un nivel de anotación. Después de que se ha añadido un nivel, use el botón Añadir etiqueta en ese nivel para agregar una etiqueta para la anotación. Una vez añadido, pueden modificarse el nombre y el color de la etiqueta para facilitar la anotación de.
2. a continuación, para comenzar a anotar, seleccione el icono de lápiz de la sección de acceso directo de la herramienta. Cuando se activa un conjunto de opciones aparecen en la parte superior del panel de visualización. Estas opciones controlan el ancho de la pluma y si vóxeles, supervoxels o megavoxels se utilizará para anotar.
   1. Con el propósito de formación del modelo, por lo general, seleccione supervoxels en el cuadro de lista desplegable de nivel de anotación y se debe utilizar un medio pelo ancho de pluma grande. En la ficha de anotaciones, seleccione la etiqueta de ser anotado marcando la casilla a la derecha de la información de la etiqueta. A continuación, haga clic en el panel de visualización para anotar un solo supervoxel, o haga clic y arrastre para anotar muchos.
      Nota: Vóxeles megavoxels ser seleccionado en el cuadro de lista desplegable de nivel de anotación y solía anotar en la misma forma, que, en el caso de megavoxels, permite a muchos miles de vóxeles similares a segmentarse con un solo clic del ratón.

5. Segmentación utilizando modelo formación demostró con un dataset microCT.

Nota: la primera segmentación para muchos conjuntos de datos es a distinguir varias regiones grandes de uno a. Por ejemplo, separando el núcleo del citoplasma y la célula de la estructura externa del hielo y el apoyo. Para este tipo de segmentación, con límites delineados claros y grandes regiones, la formación de modelo es útil. Para demostrar esto, se utilizarán datos tomográficos de contraste de fase de rayos x de pasto pata de ganso.

1. Cargar los datos, preprocesar utilizando la suite de filtro y función y determinar apropiado supervoxels o megavoxels como se describe en las secciones anteriores usando los parámetros en la tabla 1 como guía. Continuar usando los parámetros de la tabla 1 y las instrucciones en la sección 4, más o menos anotar algunas áreas grandes del conjunto de datos, como se muestra en la figura 3.
   Nota: El conjunto de datos no necesita ser totalmente segmentado en este momento.
2. En la formación del modelo de ficha, establezca el nivel de predecir al nivel que contiene las anotaciones de manual de entrenamiento, y en el descriptor de sección de la región a Supervoxels. A continuación, seleccione los descriptores que se utilizan para diferenciar las regiones de los datos haciendo clic en el desplegable seleccionar fuentes y comprobando las cajas de las características y los filtros de elección (ver tabla 1 y discusión).
3. a continuación, haga clic en el botón de predecir. Después de cómputo completo, el panel de visualización se actualizará con las predicciones de todos los vóxeles no etiquetados que muestra que de las clases de anotación que se predicen que pertenecen a. Generalmente, los parámetros por defecto para cada metodología clasificador proporcionan un buen punto de partida y el usuario sólo es necesario cambiar entre clasificadores para encontrar un buen ajuste. Sin embargo, para los usuarios expertos o experimentados las opciones para cada clasificador están disponibles y pueden ser modificadas.
4. Después de evaluar el efecto de las metodologías de formación y elegir uno, aplicar refinamiento adicional haciendo clic en el Refine desplegable en la sección de refinamiento. En la parte inferior de la formación de modelo de ficha, en la " actualización anotaciones " sección, asegúrese de que el menú desplegable de visualización se establece en PredictioNS. Utilice el control deslizante de confianza para asignar más o menos de la supervoxels unannotated a las etiquetas de la anotación seleccionada.
5. Después de un nivel de confianza adecuado ha sido seleccionado basado en inspección visual, utilice los botones de guardar al lado de las etiquetas en la parte inferior de la herramienta de confianza para guardar las predicciones en etiquetas específicas. El panel de visualización se actualizará para mostrar los cambios. Cada etiqueta puede guardarse por separado, y de hecho, las etiquetas pueden guardarse de las subregiones más pequeñas introducir valores en el campo de y a z, y y x cajas y haciendo clic en el botón de guardar para cada etiqueta.
6. Dirección menor Etiquetado falso proporcionando más datos como se describe en la sección 4. Después de las predicciones correspondientes se agregan a las etiquetas, repita el proceso del modelo de formación con refinamiento y agregando las predicciones de alta confianza hasta que no hay más sin etiqueta supervoxels. Esto es efectivo porque cada vez que ejecutar el proceso de formación de modelo que más se asignan supervoxels a entrenar con, y por lo tanto, el proceso se convierte en más robusto como las iteraciones aumentan.

6. Segmentación utilizando las Super regiones, demostró con un CryoET Dataset.

Nota: desde Super-región segmentación es útil para áreas más pequeñas, discretamente consolidadas, aquí se centrará en la segmentación de los organelos y microtúbulos dentro de este conjunto de datos. Formación modelo fue utilizado para segmentar rápidamente las plaquetas desde el fondo hielo y carbón; Estos parámetros no se discuten más lejos, pero se presentan en la tabla 1.

1. Cargar los datos, preprocesar utilizando la suite de filtro y función y determinar apropiado supervoxels o megavoxels como se describe en las secciones anteriores usando los parámetros en la tabla 1 como guía.
2. Agregar los niveles apropiados y las etiquetas a la pestaña de anotación, seleccione una etiqueta y empezar a anotar usando un medio pelo pluma de ancho con supervoxels seleccionado. Ser consciente de la necesidad de elegir diferentes etiquetas para los objetos muy cerca entre sí para evitar etiquetado como un solo objeto.
3. Para limpiar las anotaciones más, utilizar métodos de refinamiento morfológico (dilatación, erosión, apertura, cierre y relleno agujeros). Estas opciones pueden encontrarse en la parte inferior de la ficha de anotaciones. Para usarlo, seleccione el método de la etiqueta y refinamiento de segmentación. Introduzca un valor de radio y elegir cómo aplicar el refinamiento. Haga clic en refinar.

7. Clasificación y análisis de objetos de datos basado en características inherentes, demostró con un CryoSXT Dataset

Nota: generalmente, el siguiente paso después de la segmentación es el análisis de los datos. La herramienta del separador etiqueta en SuRVoS permite la clasificación de los objetos segmentados utilizando reglas basadas en características intrínsecas de los objetos tales como intensidad del objeto media, varianza, volumen o posición. La herramienta de estadísticas de etiqueta permite la visualización de las relaciones entre estas medidas para cada nueva clase de objeto. Estos son potentes nuevas herramientas para el análisis de complejos conjuntos de datos 3D tras segmentación.

1. Cargar los datos, preprocesar utilizando la suite de filtro y característica, determinar el apropiado supervoxels o megavoxels y segmento tal como se describe en las secciones anteriores usando los parámetros en la tabla 1 como guía.
2. Después de segmentación, haga clic en la segunda pestaña del panel de visualización, llamado etiqueta de separador. Esto agregará una nueva área en el lado derecho de la ventana - el panel de regla creación.
3. En la parte superior de esta zona, seleccionar un nivel apropiado y etiquetas para partir de la etiqueta. Continuación, seleccione el conjunto de datos para consulta y haga clic en etiqueta. Ahora todos los objetos en las etiquetas seleccionadas serán delineados en azul como objetos separados en el panel de visualización y un diagrama mostrando la intensidad media de los objetos se mostrarán en el panel de creación de la regla. Para cambiar la medida que se muestra en el diagrama, haga clic en el cuadro de lista desplegable en la parte superior de la derecha.
4. Para empezar a dividir los objetos en clases pertinentes, haga clic en Añadir nueva etiqueta en la parte inferior del panel de creación de la regla. Pueden cambiar el nombre y el color asociado a esta nueva etiqueta como se describe anteriormente.
   1. , Haga clic en Añadir nueva regla y el uso de los cuadros de entrada desplegable y libre de definen la regla a aplicar. Haga clic en aplicar para ver los efectos de la nueva regla en el panel de visualización y la conspiración en el panel de creación de la regla. Varias reglas pueden aplicarse a una sola etiqueta y varias etiquetas se pueden crear en el mismo conjunto de datos.
      Nota: Con el fin de reunir los objetos sin etiqueta, crear una nueva etiqueta y en lugar de agregar una regla a él, haga clic en seleccionar otros.
5. Cuando los objetos de interés se han dividido en nuevas etiquetas, crear un nivel nuevo, vacío en la ficha de anotaciones. Seleccione este nivel en la ficha de creación de la regla y haga clic en guardar etiquetas. Esto permitirá guardar las nuevas etiquetas a este nivel vacío.
6. En el borde del panel de visualización, haga clic en la pestaña de estadísticas de la etiqueta. Se abrirá un nuevo panel de visualización que puede utilizarse para comenzar a entender las relaciones entre clases de objetos en los datos. En la parte superior, seleccione Etiquetas de un nivel adecuado y el conjunto de datos para consulta.
   1. Seleccione algunas de las medidas de interés marcando las casillas al lado de ellos. Haga clic en etiqueta. Esto producirá parcelas de comparación pares para cada una de las medidas seleccionadas. Para actualizar las parcelas, seleccione o anule la selección de medidas apropiadas y haga clic en actualización parcela.

8. Exportación de datos y segmentación

1. las parcelas y los datos de medición crudo de exportación haciendo clic en trama de exportación y exportación de datos, respectivamente, en la pestaña de estadísticas de la etiqueta del panel de visualización de.
2. Exportar los datos de imagen y segmentaciones haciendo clic en la ficha de exportación en el panel de Plugins. En primer lugar, haga clic para seleccionar una carpeta donde se guardarán los datos. A continuación, seleccione el formato (HDF5, MRC o TIFF) y la salida (datos sin procesar, crudo anotaciones, máscaras de segmentación o datos enmascarados). Por último, seleccione los niveles de anotación a la exportación usando las casillas de verificación y haga clic en exportar. Los datos pueden escalarse e invertidos antes de exportar según sea necesario. Al exportar los datos enmascarados, el conjunto de datos que se aplicará el mask(s) a se puede seleccionar con un menú desplegable.

Resultados

Tres conjuntos de volumen datos recopilados de tres distintas técnicas (microCT, cryoET y cryoSXT) fueron utilizados para demostrar tres características importantes de SuRVoS Workbench: modelo de formación, Super-región segmentación y división de etiqueta. Los conjuntos de datos representan un grupo diverso de resultados experimentales, para cada uno de los cuales parámetros de procesamiento se proporcionan (tabla 1).

Para demostrar la formación de modelo con SuRVoS Workbench, fue elegido un conjunto de datos relativamente alto contraste con definición de límites de la región. Este conjunto de datos de la fruta de Galium aparine, o pasto pata de ganso, se recopiló utilizando tomografía de contraste de fase de rayos x en la línea de proyección de imagen de diamante-Manchester y I13-2 en fuente de luz diamante, Chilton, Oxfordshire, Reino Unido. La muestra fresca se montó en el aire sobre un goniómetro base encima de la fase de rotación, a una distancia del detector de la muestra de 30 mm. exposición tiempos eran 0.10 s con el espectro del rayo rosa que tiene una energía media de alrededor de 22 keV. Las proyecciones fueron recogidas a través de 180° con un tamaño de paso de 0,1 °. Reconstrucciones tomográficas fueron realizadas usando Savu^30,31 con el filtro de Paganin para contraste de fases basadas en la propagación de imágenes³² seguido por la reconstrucción de la retroproyección filtrada en el kit de herramientas ASTRA del^{33 , 34}. esta información fue luego reducida con 2 x 2 x 2 binning para reducir el tamaño del archivo antes de que ingresa en el Banco de trabajo SuRVoS.

En primer lugar, los datos de entrada (Figura 3A) fue filtrados y afianzado con abrazadera (para quitar valores de intensidad superior e inferior de los datos) (figura 3B). De esta manera, el fondo y primer plano hicieron más fácilmente distinguibles y se acentuó la textura de la estructura interna de la fruta. A continuación, supervoxels fueron construidos sobre la base de datos filtrada (figura 3). Para evaluar la calidad de la supervoxels, mostraban sin los datos para verificar que los datos pertinentes del conjunto de datos estaban bien representados por el supervoxels (figura 3D). Siguientes, manual anotaciones usando supervoxels fueron proporcionadas como datos de entrenamiento en tres rebanadas del volumen (figura 3E, colores oscuros). Estos datos de entrenamiento fueron suficientes para entrenar el clasificador para predecir (colores luz) las áreas que correspondían al fondo (verde), cerda (rojo) de la fruta, material de semilla (púrpura) y carne (azul). Ajustes morfológicos fueron utilizados para limpiar las segmentaciones por los orificios de llenado, crecimiento o encogimiento como sea necesario (figura 3F). El tiempo total empleado para determinar los parámetros adecuados y este conjunto de datos del segmento fue de 2 h.

Para demostrar la segmentación de la súper-región con SuRVoS Workbench, un conjunto de datos ruidoso y complejo fue elegido¹⁵. Este conjunto de datos se recopiló utilizando cryoET en el centro nacional para la proyección de imagen Macromolecular en el Baylor College of Medicine, Houston, TX USA. Brevemente, las plaquetas fueron penetración congelado en resplandor descargada y rejillas de carbón perforado oro Fiduciario tratados TEM. Serie de inclinación se recolectaron de ±65 ° con un incremento de 2°. La serie de inclinación entonces fue reconstruida usando proyección ponderada en IMOD³⁵.

Después de cargar los datos en SuRVoS (Figura 4A), una región de interés se seleccionó y aplicó un sistema de filtro apropiado. En este caso, un filtro gaussiano suavizado, seguido por un filtro de la variación total del contraste con abrazadera se utiliza para acentuar los bordes y texturas de los datos (Figura 4B). A continuación, formación de modelo con la entrada mínima del usuario basada en supervoxel fue utilizado para segmentar las plaquetas desde el fondo hielo y carbón. Entonces, segmentación semi-manual con megavoxels y supervoxels fue utilizado para segmentar las organelas. Por último, el parámetro de la fuente de supervoxel fue cambiado a un filtro de eliminación de ruido débil y forma supervoxel fue hecho más pequeño (véase tabla 1) con el fin de conservar mejor los límites de los microtúbulos para segmentación (figura 4). Para los orgánulos y los microtúbulos, se utilizaron rápidas anotaciones manual cada 5-10 rebanadas para seleccionar el supervoxels que describen la característica de interés (figura 4 & 4E). El tiempo total empleado para determinar los parámetros adecuados y segmento de la región de interés presentado fue de 6 h.

Para demostrar la etiqueta División con SuRVoS Workbench, eligió un conjunto de datos con muchos, variados orgánulos. Este conjunto de datos se recopiló utilizando cryoSXT en la línea B24 fuente de luz diamante, Chilton, Oxfordshire, Reino Unido³⁶. Brevemente, las células HEK293 fueron cultivadas en rejillas de buscador de oro, fiduciales oro tamaños adecuado fueron agregados y la red estaba caída congelada con una EM con cara espalda borrar. Serie de inclinación entonces recolectaron en un microscopio de ±65 ° con un incremento de 0,5 °. La serie de inclinación entonces fue reconstruida usando proyección ponderada en IMOD³⁵.

Después de cargar los datos en SuRVoS (figura 5A), se seleccionó un área de interés y un filtro apropiado variación total fue utilizado para mejorar los límites de los organelos a lo largo del volumen (figura 5B). A continuación, organelos fueron semi-manually segmentado usando megavoxels y supervoxels y luego refinado con orificios de llenado, de cierre y dilatación para suavizar bordes (figura 5). El tiempo total para determinar parámetros adecuados y segmento de la región de interés presentado fue de 4 h. Una vez que finalizó la segmentación, la cortadora de la etiqueta fue utilizada para visualizar cada organelo como un objeto en el conjunto de datos (figura 5) y diversas características sobre cada objeto en la trama de datos (figura 5E). La interfaz del sello separador es interactiva, actualizando el color asociado a cada nueva clase de etiqueta en la visualización y la trama de datos. Esto permite la creación de varias reglas basadas en las características inherentes en los datos que pueden utilizarse para separar los objetos en clases útiles (figura 5F).

Figura 1. El diseño y características generales de SuRVoS Workbench.
La interfaz gráfica de usuario está a la izquierda, mientras que el panel de visualización está a la derecha. Estas dos áreas están separadas por una columna de herramientas y accesos directos. La GUI es dispuesta a caminar el usuario a través de los principales pasos de preprocesamiento de los datos, elegir los parámetros supervoxel o megavoxel, segmentación de los datos y si es necesario usando modelo de entrenamiento, antes de la exportación de las segmentaciones. El panel de visualización se puede utilizar en tres modos: visualización básica y segmentación para ver los datosy aplicar filtros y segmentar los datos, splitter para categorizar objetos en nuevas etiquetas basadas en aspectos inherentes a los datos de la etiqueta y etiqueta finalmente estadísticas para medir y visualizar las características de los objetos segmentados. Para cada uno de estos modos, el menú desplegable en la parte superior izquierda esquina mandos datos que es, y el control deslizante en la parte superior controla el eje z. Los accesos directos de herramienta proporciona control de fácil acceso sobre contraste, transparencia de capas, zoom, panorámica y regresar a "home" en el panel de visualización y herramientas de apertura para anotación como se describe en el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Súper región jerarquía reduce la complejidad de la segmentación de la imagen.
Una imagen de la base de datos de segmentación de Berkeley (BSDS500³⁷) fue utilizada para demostrar las propiedades y efectos de Super-regiones. La imagen original (izquierda) se compone de miles de voxels, que son luego reunidos en agrupaciones adyacentes, similares a crear unos cien supervoxels (centro). Supervoxels se puede obtener también en las agrupaciones adyacentes, de manera similares para crear unas decenas de megavoxels (derecha). Con cada grupo, se disminuye la complejidad de la tarea de segmentación, recursos computacionales y manuales. Lo importante, aquí se muestra un ejemplo 2D, sin embargo, supervoxels y megavoxels 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Procesamiento de un microCT Dataset mediante una estrategia de segmentación del modelo formación.
A. una sola rebanada 2D de los datos en bruto. B. aplicar un filtro de variación total sujeta a los datos crudos mejora los límites entre los diversos aspectos del cuerpo fructífero. C. supervoxel apropiado parámetros fueron escogidos. D. se muestra una región de interés (caja roja en C) para demostrar que los límites de los datos están presentes en el supervoxels ellos mismos. E. tres rebanadas del volumen con anotaciones manuales de diversas áreas del conjunto de datos muestran en colores oscuros (verdes, rojos, azul y púrpura) y predicciones después de ejecutar la formación de modelo en los colores de luz. F. las tres rebanadas mismo la segmentación final después de las predicciones del modelo formación han sido aceptadas. Barras de escala son 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Procesamiento de un conjunto de datos utilizando una estrategia de segmentación de la súper-región de cryoET.
A. una sola rebanada 2D de los datos en bruto. B. una región de interés (caja roja en A) con un sistema de filtro de capas para acentuar los límites de los organelos. C. ejemplo de anotar un organelo con súper-regiones. Un orgánulo único aparece con supervoxels con la anotación de usuario aparece en negro (izquierda) y el supervoxels elegido con esa anotación que se muestra en azul (derecha). D. ejemplo de anotar un microtúbulo con súper-regiones. Se muestra una sola región de microtúbulos con la anotación de usuario aparece en negro (izquierda) y el supervoxels elegido con esa anotación que se muestra en verde (derecha). E. la segmentación final con la plaqueta segmentada del fondo utilizando el modelo de formación (ver tabla 1 para más detalles) y diversos orgánulos y microtúbulos segmentados mediante una estrategia de segmentación de la Super región. Colores no indican tipos de organelas específicas como aparecen aquí antes de clasificación. Bares en la escala A, B y E son 1 μm y en C y D son 0,5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Análisis de un conjunto de datos utilizando la herramienta de sello separador de cryoSXT.
A. una sola rebanada 2D de los datos en bruto. B. una región de interés (cuadro rojo en la A) con un variación total del filtro aplicado para acentuar los organelos. C. la segmentación final con supervoxels superpuestas. D. La parte de visualización del separador de la etiqueta con los organelos clasificado utilizando las reglas que se muestran en F. E. la porción de la parcela del separador etiqueta mostrando la intensidad promedio dentro de cada objeto, con la normativa que aparece en F aplicada. Cada línea vertical a lo largo del eje x representa un solo objeto y codificada por colores para que coincida con la clase que ha sido asignado. F. reglas de clasificación del ejemplo para separar varios objetos basados en sus propiedades inherentes. Barras de escala son 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre / conjunto de datos	Fuente	P1	P2	P3	P4
Filtro gaussiano		Sigma
Por defecto / gama	-	[0,5, 10] / 1
CryoET (G1)	Datos en bruto	1
CryoET (G2)	Datos en bruto	2
Variación total		Lambda	Espaciamiento de	# Iter	Abrazadera
Por defecto / gama	-	[0.1, 30] / 10	[0.1, 10] / 1	[50, 500] / 100	-
MicroCT (TV1)	Datos en bruto	10	1	100	(1,-)
CryoET (TV2)	G1	7	1	200	-
CryoET (TV3)	G2	10	1	100	-
CryoSXR (TV4)	Datos en bruto	7	1	100	-
Umbralización		Vmin	Vmax
Por defecto / gama

(TH1) cryoET TV3 0 - Gaussiano centrado Sigma Por defecto / gama - [0,5, 10] / 2 (GC1) microCT TV1 2 Normalización gaussiano Sigma Por defecto / gama - [0,5, 10] / 2 (GN1) microCT TV1 2 Laplaciano de Gauss Sigma Trille Respuesta Por defecto / gama - [0,5, 10] / 2 [Yes/No] / No [Brillante oscuro] / brillante MicroCT (LG1) TV1 2 No Brillante Diferencia de Gaussianas Inicio de Sigma Relación de Sigma Por defecto / gama - [0,5, 10] / 2 [1.1, 3] / 1.6 (DG1) microCT TV1 2 1.6 CryoET (DG2) TV3 2 1.6 Tensor de la estructura det. Sigma1 Área de Sigma Por defecto / gama - [0,5, 10] / 2 [0,5, 10] / 2 CryoET (ST1) TV3 2 2 Supervoxels Forma Espaciamiento de Compacidad Por defecto / gama - [1, 10] / 10 [0.1, 5] / 1 [1, 200] 20 (SV1) microCT TV1 (10, 10, 10) (1, 1, 1) 30 CryoET (SV2) TV3 (10, 10, 10) (1, 1, 1) 50 CryoET (SV3) TV2 (3, 5, 5) (1, 1, 1) 50 CryoSXT (SV4) TV4 (10, 10, 10) (1, 1, 1) 30 Megavoxels Lambda # Contenedores Gamma Por defecto / gama - [0.01, 1] / 0.1 [10, 200] 20 Ninguno, auto o [0, 1] / ninguno CryoET (MV1) SV2 0.1 50 Automático TV1 (MV2) cryoSXT SV4 0.4 50 Ninguno TV4 Modelo de formación Región Clasificador Refinamiento Disponibles por defecto / [voxel / supervoxel] [Modelos de lineales de conjuntos, SVM, en línea] / [Ninguno, Potts, aspecto] / aspecto Conjunto - RF microCT TV3 SV1 Bosque al azar: Aspecto TH1 GC1 -Árbol #: -Lambda: GN1 [10, 100] / 100 [1, 500] / 10 LG1 100 50 DG1 cryoET TV2 DG2 ST1 SV2 Bosque al azar: Aspecto -Árbol #: -Lambda: [10, 100] / 100 [1, 500] / 10 100 50 Refinamiento de la anotación Radio Por defecto / gama [1, 20] / 1 microCT Apertura 5 Orificios de llenado 1 Dilatación 2 cryoET Apertura 3 Orificios de llenado 1 Dilatación 2 cryoSXT Apertura 3 Orificios de llenado 1 Dilatación 2

Tabla 1. Parámetros optimizados para procesar cada uno de los tres conjuntos de datos (microCT, cryoET y cryoSXT).>
Para cada parámetro, se dan una gama de propósito general y por defecto. En muchos casos, datos filtrados se utilizan como una fuente para el procesamiento de aguas abajo. En estos casos, una abreviatura se utiliza para denotar el nuevo conjunto de datos fuente. Por ejemplo, G1 (los datos en bruto cryoET filtrado gaussiano) fue usados como entrada en un filtro de variación total para crear TV2. Información se presenta sólo en los aspectos de la mesa de trabajo que se utilizaron para procesar cada conjunto de datos. Por ejemplo, modelo de formación no fue utilizada durante el procesamiento del conjunto de datos cryoSXT presentado aquí, por lo tanto parámetros no se dan para esto.

Discusión

SuRVoS Workbench difiere de otros programas de segmentación en que optimización de parámetros es un paso importante y necesario antes de comenzar la actual segmentación. En algunos programas de segmentación manual o semi manual, el usuario comienza a segmentar en momentos de la apertura de un nuevo proyecto. Con SuRVoS, porque grandes cantidades del volumen serán segmentados con usuario muy poco y límites están delineados por el programa, optimización de los parámetros es fundamental para una segmentación exitosa. En concreto, canales de función y Super-región edificio son dos áreas donde se debe prestar atención.

Canales de función y formación del modelo

Además de los datos crudos, SuRVoS permite crear conjuntos de datos adicionales o canales derivados de un conjunto de datos existente. Estos canales se pueden crear usando una selección de metodologías computacionales o extractores de característica. Cada una de las representaciones de datos están disponible en paralelo y pueden mostrarse individualmente para evaluar los resultados de filtro o función de aplicación. Debido a estas características, denominan canales de función en SuRVoS. Hay muchas opciones de canal característica en SuRVoS. Para obtener información sobre las opciones y parámetros que se utilizan aquí, ver tabla 1, para una lista completa y descripción de los canales disponibles de la función visita https://diamondlightsource.github.io/SuRVoS/ ². Conjuntos de datos en primer lugar, ruidoso se beneficiarán de la eliminación de ruido Gaussiano o total filtro de variación. Se recomienda que más lejos característica canal y supervoxel/megavoxel cómputos realizarse utilizando uno de estos conjuntos de datos denoised como origen de datos. Generalmente, se utiliza el conjunto de datos de la variación total denoised como los datos de origen para los cómputos de canal y supervoxel/megavoxel función. Se recomienda correr con los valores por defecto en primer lugar, evaluar el resultado en 3D y finalmente, optimizar iterativamente los parámetros del conjunto de datos. Además, función canales pueden construirse en "conjuntos de filtro" que específicamente aislar aspectos de conjunto de datos y estos pueden luego utilizarse como fuentes de datos para crear supervoxels y megavoxels. Aunque esta estrategia es altamente dependiente del conjunto de datos, puede ser beneficioso.

Canales de función también se utilizan como fuentes para entrenar el clasificador en la formación de modelo. Al momento de decidir en qué canales de función a utilizar, se recomienda que algunos canales de característica sólida (p. ej., de detección de blob, textura y estructura o categorías de características robustas) se utilizan cuando se trabaja con una pequeña cantidad de anotaciones para capacitar a los clasificador. Cuando se trabaja con una gran cantidad de datos de entrenamiento, es aconsejable utilizar canales de función más generales, de cualquiera de las categorías como proporcionan información variada al clasificador (p. ej., añadir a los anteriores canales de función lista de locales características y categorías de funciones Gaussian).

Hay tres partes principales al modelo de formación: proporcionar fuentes de entrada de datos que describen los datos, usando estas entradas a un clasificador de tren y finalmente refinar las predicciones de salida. Generalmente, las regiones más pequeñas de los datos requerirá más anotaciones de usuario exactamente entrenar el clasificador, mientras que las regiones más grandes de los datos requerirá de menos anotaciones de usuario. Modelo formación primero sin seleccionar un refinamiento puede utilizarse para encontrar las mejores predicciones. A continuación incluyen el refinamiento y optimizar el parámetro lambda según sea necesario para solucionar problemas con las predicciones tales como agujeros o bordes irregulares.

Supervoxels y megavoxels

Supervoxels son agrupaciones de varios lugares similares vóxeles^38,39. Supervoxels comienza como una rejilla 3D estándar superpuesta en los datos que luego se deforma iterativamente con el fin de cumplir con los límites subyacentes y así representar mejor los datos. Supervoxel creación y deformación es controlada por cuatro entradas del usuario: origen de datos, superpixel forma, espacio y compacidad. El origen de datos proporciona las entradas de datos que se consultan durante la creación de supervoxel. Cualquier fuente se puede utilizar como fuentes de datos filtrados. Los parámetros de forma superpixel determinan la parrilla de salida 3D y la forma aproximada de la supervoxels resultante. Cambiar estos parámetros puede aumentar o disminuir el tamaño de la supervoxels antes de deformación. Los parámetros de espaciado definen la importancia de los límites en cada dirección. Cambiar estos parámetros puede enfatizar los límites en una o dos direcciones a expensas de otro (s), lo que significa el supervoxels resultante se deforman para seguir mejor los límites de datos en las direcciones dadas. El último parámetro, compacidad, controla cuánto la supervoxels pueden deformarse. Un número de baja compacidad permite el supervoxels a deformar más. Estos parámetros deben optimizarse para proporcionar supervoxels que representan los límites de los datos de interés. Nota: Actualmente, los parámetros de forma de supervoxel deben ser igual a 1024 o menos al multiplicar juntos.

De alguna manera, supervoxel parámetros pueden compensar entre sí, significa que existe una "respuesta correcta" al decidir sobre los parámetros. Por ejemplo, una gran parrilla de salida (por ejemplo forma de superpixel: 10 x 10 x 10) y un número de baja compacidad (ej. 20) puede dar supervoxels con similar adherencia límite en comparación con una pequeña parrilla de salida (por ejemplo forma de superpixel 5 x 5 x 5) y una mayor número de compacidad (p. ej. 50). Porque hay más, supervoxels más pequeños en el segundo escenario, no tienen a deformar tanto para representar límites. Ambos conjuntos de parámetros podrían ser apropiados para la segmentación de la base de datos.

La consideración más importante al elegir parámetros supervoxel es qué tan bien las supervoxels representan los datos. El supervoxels solo, sin datos por debajo de ellos, como en la Figura 2D, es una buena manera de evaluar los parámetros supervoxel. Cuando aparezca de esta forma, los bordes y contornos de formas encontradas en los datos deben estar visibles en el supervoxels.

Megavoxels son conglomerados de varios vecinos, similar supervoxels^38,39. Otra vez son controlados por cuatro entradas del usuario: origen de datos, lambda, numbins y gamma. Como con supervoxels, el origen de datos proporciona las entradas de datos que se consultan durante la creación de megavoxel. Lambda y numbins influyen en el tamaño y límite de adherencia de la megavoxels. Las megavoxels el crecimiento más grande (lambda alto, bajo numbins), disminuye su adherencia límite. Lo contrario también es cierto, adherencia límite aumentará con más pequeño megavoxels (lambda baja, alta numbins), sin embargo a medida que disminuye el tamaño de la megavoxel, también lo hace su utilidad en la segmentación rápidamente grandes cantidades de voxels. El parámetro opcional gamma controla el factor de suavidad versus el costo de la fusión de dos supervoxels juntos. Valores pequeños de gamma pueden mejorar la semejanza entre dos supervoxels, a costa de tener menos megavoxels general.

Como supervoxels, la más grande consideración al elegir y optimizar los parámetros de megavoxel es así el megavoxels representar los datos. Mostrando el megavoxels solamente como se describe para supervoxels otra vez puede utilizarse para evaluar los parámetros. Sin embargo, porque megavoxels será generalmente mucho más grandes y son tridimensionales, usando la anotación herramientas to elegir solo megavoxels para el límite entre las regiones de interés esté apretado también es recomendable.

Estrategia de anotación

Se han descrito dos estrategias de anotación general: un enfoque de formación de modelo es útil para separar las regiones grandes de un conjunto de datos, mientras que un enfoque de segmentación de la Super-región es útil para funciones más pequeñas, más diversos como organelos individuales. Las anotaciones pueden ser organizadas de manera jerárquica para que sea posible anotar grandes regiones primero, luego subdividir en regiones más específicas usando una relación de padre-hijo. Puede asignar la etiqueta de los padres para una etiqueta haciendo clic en el área a la derecha de la selección de color de la etiqueta y escoger una etiqueta apropiada de padres de un nivel anterior. En la práctica, más conjuntos de datos utilizan la formación del modelo y estrategias de segmentación de la súper-región para segmentar regiones particularidades de interés.

En el ejemplo de entrenamiento modelo aquí, unas entradas de entrenamiento (en forma de anotaciones de usuario basado en supervoxel) fueron utilizados en tres cortes equidistantes de los datos. De esta manera, el aspecto de capacitación modelo de SuRVoS enormemente aumenta la velocidad con la que segmentación es posible especialmente cuando trabajan con grandes, diferenciadas regiones tales como la división entre las regiones en el cuerpo fructífero de pasto pata de ganso como se destaca en Figura 3.

Cuando el modelo formación, si las predicciones no se puede ver, puede ser necesario ir a la pestaña de visualización y asegúrese de que esté activada la capa de predicciones y establece en una cantidad apropiada de transparencia. También, una confianza de 0 asignará cada supervoxel sin etiqueta a una etiqueta, basada en cualquiera que sea el partido más cercano. Confianza de 100 sólo asignará una etiqueta si sólo cuenta con una categoría de etiqueta cualquier partido proporcional. Todo lo demás es un equilibrio de estos dos extremos. Al seleccionar un nivel de confianza se sugiere para comprobar unas lonchas para inspeccionar visualmente que no hay vóxeles incorrectamente predichos antes de guardar la predicción en una etiqueta.

Una buena estrategia para anotar con regiones súper es utilizar la herramienta de aumento para ampliar los datos, anotar algunos orgánulos a la vez en un segmento, usando un enfoque de "rápido y sucio" primero (figura 4). A continuación, mueva hacia arriba o hacia abajo unas lonchas en Z y repita este proceso. Porque supervoxels son tridimensionales, muchas de las fallas del enfoque "desordenado" se fijan por anotaciones hechas arriba o debajo de rebanadas. De esta manera, se acelera la segmentación y los límites son proporcionados por la supervoxels en lugar de manualmente.

Para limpiar una etiqueta, se proporcionan opciones de refinamiento de segmentación estándar. Dilatación hace que la etiqueta de segmentación seleccionados para crecer por el radio dado, erosión causa el encogimiento. Apertura y cierre son la aplicación de la primera erosión y dilatación o viceversa, respectivamente. Y relleno agujeros hace exactamente eso. Importa el orden de estas operaciones. En general, realizar los orificios de llenado, luego apertura y dilatación funciona bien. Cada método de refinamiento puede ser aplicado en una sola rebanada ("esta rebanada"), en todos los sectores en 2D ("todos los sectores (2D)") o en 3D ("todo volumen (3D)"). Se recomienda a todos los sectores (2D).

Importancia y futuro

Segmentación eficiente y precisa es el siguiente cuello de botella en el procesamiento de conjuntos de datos 3D, especialmente con la colección automatizada rutina de terabytes de datos de imagen durante las sesiones de largo plazo. SuRVoS Workbench puede acelerar el proceso de segmentación por un factor de 5 con respecto a la segmentación manual. También, porque los límites son delineados por la supervoxels, la variabilidad de la segmentación resultante debe mejorar. En el futuro, pretendemos explorar las maneras de utilizar la segmentación de una representación 3D región de interés como datos de entrenamiento para aplicar al resto del volumen, o incluso un volumen separado, con alta confianza. Este avance podría disminuir aún más la cantidad de tiempo del usuario y entrada necesario volúmenes biológicos complejos de segmento, ayudando a aliviar el embotellamiento de procesamiento y segmentación de imagen. Esto, a su vez, permitirá la comparación cuantitativa de los datos biológicos en varios Estados (por ejemplo, no enfermedad, enfermedad, tratada) con sólidos números experimentales.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
computer	n/a	n/a	Must be running Linux operating system and have an NVidia GPU with at least 4 GB of memory