Métodos para el pH intracelular de la proyección de imagen del linaje de la célula de vástago del folículo en vivo tejido ovárico de Drosophila

Resumen

Proporcionamos un protocolo para pH intracelular de un linaje de células epiteliales en el tejido ovárico de Drosophila en la proyección de imagen. Se describen métodos para generar moscas transgénicas expresando un biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagen el biosensor usando proyección de imagen de fluorescencia cuantitativa, generar curvas estándar y convertir valores de intensidad de fluorescencia a valores de pH.

Resumen

Cambios en el pH intracelular (pHi) desempeñan papeles importantes en la regulación de muchas funciones celulares, incluyendo metabolismo, proliferación y diferenciación. Por lo general, dinámica de pHi se determina en las células cultivadas, que son susceptibles de medición y la manipulación experimental de pHi. Sin embargo, el reciente desarrollo de nuevas herramientas y metodologías ha permitido estudiar dinámica pHi dentro del tejido intacto, vivo. Para la investigación de Drosophila , un desarrollo importante era la generación de una línea transgénica con un biosensor de pHi, mCherry::pHluorin. Aquí, describimos un protocolo que habitualmente utilizamos para proyección de imagen en ovariolas de Drosophila para medir pHi en el linaje de la célula de vástago (FSC) epitelial del folículo en líneas transgénicas tipo salvaje de mCherry::pHluorin; sin embargo, los métodos aquí descritos pueden ser fácilmente adaptados para otros tejidos, incluyendo los discos de ala y el epitelio del ojo. Se describen técnicas para expresar mCherry::pHluorin en el linaje FSC, manteniendo el tejido ovárico durante la proyección de imagen, vivo y adquirir y analizar imágenes para obtener valores de pHi.

Introducción

Estudios recientes revelaron un papel para cambios en pHi durante celular diferenciación y displasia en vivo^1,2. Estos estudios encontraron que pHi es notablemente consistente en células del mismo tipo en la misma etapa de diferenciación, pero que cambia como las células de transición de una etapa a otra. En algunos casos, bloqueando parcialmente los cambios en pHi altera la diferenciación, lo que sugiere que el cambio en pHi no es sólo una consecuencia de los cambios de destino de la célula pero en cambio ayuda a promover el cambio de destino de la célula, quizás a través de efectos sobre el pH-sensible a la regulación las proteínas o las reacciones químicas necesarias para la diferenciación. Los estudios futuros tienen el potencial para revelar más información sobre las muchas funciones diferentes del pHi dinámica en vivo. Sin embargo, uno de los desafíos de estudiar la pHi durante la diferenciación en vivo es la obtención de medidas precisas de pHi. A diferencia de otras características de diferenciación, tales como cambios en la morfología celular y expresión génica, pHi es una propiedad química lábil de la célula que no se conserva en las células que se han fijado y permeabilized con métodos estándar. Además, pHi puede no ser estable en las células que están estresadas o muere como resultado de la manipulación experimental. Por lo tanto, es importante mantener las células vivas y tan saludable como sea posible cuando mide pHi. Varios colorantes vitales están disponibles que funcionan bien para medir PI de las células en cultura³, pero en muchos casos no son adecuadas para en vivo los estudios porque no penetran el tejido uniformemente o profundamente bastante para proporcionar mediciones precisas .

Para evitar el problema de la penetración de tinte pobre, nosotros y otros hemos utilizado una sonda genéticamente codificada, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, que puede ser expresado específicamente en la célula tipos de interés y reflejada en tejido vivo. pHluorin es una variante de la GFP con un pKa superior (~ 7,0 vs ~ 4.0) que dobla más fácilmente a pH más alto; así que la intensidad de fluorescencia total emitida por una población de pHluorin de moléculas en la célula aumenta con el aumento del pHi⁸. Lo importante, la fluorescencia es lineal dentro del rango normal citosólico de los valores de la pHi. En contraste, la fluorescencia de mCherry (pKa ~ 4.5) es insensible a los cambios en el pH dentro de la gama citosólica. Estos dos periodistas son covalente juntos como una sola proteína quimérica, codificada por un marco abierto de lectura único, por lo que siempre están presentes en cantidades iguales. Por lo tanto, el de pHluorin a la intensidad de la fluorescencia mCherry proporciona una medida del pHi que es normalizada a la concentración de la sonda en cada célula. Los cocientes se pueden convertir entonces las estimaciones de los valores de la pHi usando una curva estándar generada por obtener la pHluorin mCherry cocientes de los tejidos que han sido equilibrados a valores de pH conocido.

Aquí, describimos los métodos para el uso de mCherry::pHluorin para medir la pHi del linaje epitelial de la FSC en el ovario del Drosophila . Este tejido bien caracterizado se ha utilizado para modelar diferentes aspectos de la biología epitelial, tales como la célula de vástago auto renovación y diferenciación^9,10,11, migración de la célula colectiva¹² , el desarrollo y mantenimiento de celulares polaridad^13,14. El epitelio del folículo se produce por dos remiten que residen en el borde anterior de los tejidos en una estructura llamada el germarium^15,16. Estas células se dividen regularmente durante la edad adulta para la autorrenovación y producir progenie, denominadas células prefollicle (PFC), que pueden volver a entrar en el nicho y convertirse en un FSC o diferenciar en uno de los tres tipos de células del folículo diferentes: las células polares, las células del tallo, o células del folículo del cuerpo principal. Demostramos previamente que en el tejido de tipo salvaje, el PI aumenta constantemente durante las primeras etapas de diferenciación, de una pHi de aproximadamente 6,8 en remiten a 7.0 en PFC, 7.3 en folículo células². Bloqueo este aumento por la caída de ARNi de un intercambiador sodio/protones ubicuo expresada, DNhe2, severamente deteriora diferenciación de pFC, considerando que el aumento de pHi por la sobreexpresión de DNhe2 causa una leve diferenciación de exceso fenotipo. Estos resultados demuestran que el pHi se mantiene estable en el linaje FSC temprano y que pueden ser experimentalmente aumentado o había disminuido en vivo. Los métodos descritos aquí pueden utilizarse para medir pHi en tejido tipo salvaje o diversas formas de tejidos mutantes, incluyendo caída de ARNi o sobreexpresión usando Gal4 de interés y los clones mitotic.

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Protocolo

Nota: para medir la pHi en el linaje FSC, calcular la relación de intensidades de fluorescencia de pHluorin a mCherry en Eve, PFC y las células del folículo en condiciones fisiológicas y convertir la relación en valores de pHi con estándar curvas de calibración para cada célula tipo ⁷. En primer lugar, energizados experimentos de imagen se realizan para medir intensidades de fluorescencia de pHluorin y mCherry en germaria disecado en un tampón que contiene NaHCO ₃, que imita las condiciones fisiológicas ^{1 , 7}. curvas estándar siguiente se generan mediante la medición de pHluorin y mCherry intensidades de fluorescencia en una Na ⁺-K ⁺ buffer que contiene el ionóforo nigericin libre, ajustado a dos valores de pH diferentes, 6.5 y 7.5. En presencia de nigericin, pHi se equilibra con el pH del buffer a través de la membrana plasmática, provocando pHi para que coincida con el pH extracelular. Por último, las curvas estándar se utilizan para convertir pHluorin a mCherry proporciones pHi Estimado valores.

1. cuestiones preliminares: pHi de preparación antes de la medición En Vivo

Nota: para medir pHi en vivo, el transgen mCherry::pHluorin se expresará en el tipo de la célula de interés. A continuación se muestran algunas maneras comunes para generar transgénico pHluorin vuela en el linaje FSC. Generando clones de mCherry::pHluorin es particularmente útil para identificar remiten, que se encuentra en el borde anterior de un clon FSC. Tejido específico mCherry::pHluorin expresión es útil para la medición de pHi en el tejido entero y también es más conveniente cuando se combina con la expresión de un ARNi o transgén.

1. Vuela generación de transgénico pHluorin
   1. mCherry::pHluorin-con la etiqueta FSC clones
      1. hacer mCherry::pHluorin FSC clones, Cruz UAS-mCherry::pHluorin ¹ a un acto-Gal4 flipout stock u otra la acción con un Gal4 inducible Flp/FRT.
      2. Para hacer heatshock clones inducibles, heatshock adultos F1s durante 2 días post eclosión en frascos vacíos para 1 h en un baño de agua de 37 ° C, cuatro veces aproximadamente cada 12 h.
      3. Para asegurar el crecimiento normal y tasas máximas de ovogénesis durante este período, mantener moscas proporcionando levadura húmeda fresca (aproximadamente partes iguales seco baker ' s levadura y agua) diariamente durante al menos 6 días después de la inducción clon.
   2. Expresión de tejido específico mCherry::pHluorin
   3. Cruz mCherry::pHluorin UAS ¹ a un folículo celular driver específico, y ¹ w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).
   4. 3 días después de moscas eclosing, recoger y colocar en frascos que contienen levadura húmeda, durante al menos 24 h antes de la disección.
2. Haciendo soluciones
   Nota: es importante preparar los siguientes buffers en el día del experimento porque las concentraciones en el buffer de pH y soluto pueden cambiar con el tiempo.
   1. Búferes de bicarbonato, nigericin y la disección de preparar. Añadir los componentes en el orden listados para evitar la formación de precipitados (consulte la tabla 1, tabla 2 y tabla 3).

2. Prueba: Medición de pHi en el linaje de FSC

Nota: la disección, montaje y vivo la proyección de imagen pasos para el buffer de bicarbonato y las dos condiciones de buffer nigericin deba ser realizado dos veces: una vez para determinar el microscopio ajustes y una segunda vez para recoger los datos experimentales. Vea la sección 2.2 a continuación para obtener más información.

1. Disección y montaje
   Nota: para materiales necesarios para realizar este paso, consulte figura 1 y Tabla de materiales. Cámaras 3D montaje impresos, archivos de impresora 3D se proporcionan como suplementario archivo 1 y archivo adicional 2.
   1. Disección:
      1. preparar salas de montaje, aplicando una capa delgada de grasa para vacío en el lado más plano de la 3D impreso cámara de montaje. Coloque ese lado en un cubreobjetos de 22 x 40 mM para sellar el cubreobjetos a la sala de montaje.
   2. Diseccionar los ovarios de las moscas adultas en 500 μl de tampón de disección (tampón de bicarbonato o nigericin, tabla 3)
      1. anestesiar a moscas de 3-4 utilizando gas de CO ₂ y transferencia vuela sobre una almohadilla mosca perfundido con CO ₂ gas.
      2. Recoger una mosca anestesia con lugar en los medios de comunicación de disección y pinzas.
      3. Pellizcar el tórax de la mosca con una pinza, mientras tirando de la punta de su abdomen hasta que sus ovarios son.
      4. Después de extraer los ovarios de los otros órganos, embromar aparte las ovariolas utilizando una aguja de jeringa de ^1/2 22. Separe cuidadosamente el músculo de la envoltura de los ovarios y ovariolas individual separado de la agrupación de ovariolas. Una técnica eficaz para aislar la vaina del músculo es utilizar una aguja de jeringa para mantener el racimo de ovariolas en su extremo anterior y movimiento hacia abajo a lo largo de ovariolas solo.
      5. Incubar los ovarios disecados en medios de disección durante exactamente 10 minutos antes de proceder con el paso de montaje por lo que hay tiempo suficiente para que el PI de las células para equilibrar totalmente con el pH de los medios de comunicación de disección nigericin.
         Nota: Asegúrese de que se extrae la vaina del músculo de las ovariolas. La vaina del músculo puede atenuar la señal de fluorescencia, lo que dificulta identificar células individuales con Concanavilin-A y puede causar ovariolas moverse espontáneamente durante la proyección de imagen vivo.
   3. De montaje
      1. Coloque una gota pequeña de los medios de disección sobre el cubreobjetos de vidrio dentro de la cámara de montaje.
      2. Transferencia separada ovariolas usando fórceps.
      3. Separar posteriormente etapa huevo de chambers germaria asociado con cámaras de huevo de etapas anteriores y tratar de asegurar que el germaria disecada se colocan en el centro de la gota de medio de disección.
      4. Añadir dos pequeñas gotas de esmalte de uñas a lados opuestos de un cubreobjetos redondo de 12 mm y dejar aire seco durante unos 10 s.
      5. Lugar la ronda cubreobjetos sobre la gota de medio de disección que contiene separan germaria tal que el lado con esmalte de uñas hacia abajo y entra en contacto con los medios de comunicación de la disección. Presione las piezas del borde con esmalte de uñas para aplanar y asegurar la germaria en posición. Se recomienda utilizar esmalte de uñas mayores porque mancha menos, sobre la superficie del cubreobjetos, como se asegura en lugar.
      6. Llene la cámara de montaje con medios de disección adicional. Búfer específico de condición que contienen tinte concanavalina-A se puede utilizar para llenar la cámara de.
         Nota: El tiempo total gastado de disección y montaje no debe exceder 15 minutos. Esto es importante para minimizar los efectos de daño de tejido y muerte celular.
2. Imagen en:
   Nota: en este paso, primero recoger imágenes de la condición de bicarbonato y las dos condiciones de nigericin para determinar la configuración del microscopio adecuado, ajustar el microscopio según sea necesario, y luego recoger imágenes de los datos experimentales. Usar un microscopio confocal de imágenes en 3 canales: GFP (emisión 475 excitación/509), mCherry (575 emisión excitación/610) y far-red (emisión excitación/647 633).
   Nota: Set Microscopio configuración: las intensidades de los píxeles de las imágenes recogidas se cuantifican para determinar las estimaciones de pHi, por lo que es importante que los valores de intensidad de la señal en cada juego de la imagen es demasiado baja ni saturado. La gama de intensidades que puede capturar en una imagen se define por la profundidad de bits de imagen. En muchos casos, se generan imágenes de 8 bits por defecto, pero se recomienda adquirir los datos de imágenes de 16 bits, que tienen un rango dinámico más amplio. Es importante asegurarse de que se reduce al mínimo la interferencia entre canales fluorescentes, por lo que la configuración debe ajustarse de modo que el espectro de emisión obtenidos cada fluoróforo no se superponen. Para probar estas configuraciones, tomar una imagen de muestra utilizando el espectro de excitación de GFP y recoger en el espectro de emisión para mCherry y viceversa. Si los valores han sido ajustados correctamente, debe ser no hay señal en cualquiera de los casos. Establecer la configuración del microscopio (es decir, configuración de voltaje de un sistema de escaneo láser confocal, laser power y del agujero de alfiler de tamaño) para que las intensidades de los píxeles de la señal en todos los conjuntos de tres imágenes están dentro de la gama dinámica del archivo de imagen. Para todos nuestros experimentos, se utilizó un blanco luz láser confocal microscopio con un objetivo 40 x para la adquisición de imágenes de 16 bits en formato de 1.024 × 1.024, mientras nos habían optimizado ganancia de voltaje para cada experimento, según sea necesario. Por ejemplo, en un experimento, establece la ganancia de voltaje para GFP, mCherry y far-red como 37,8% 72,9% y 260%, respectivamente.
   1. Imagen ovariolas en buffer de disección nigericin a pH 6.5 y ajustar la configuración tal que intensidades de píxeles de las imágenes pHluorin y mCherry son bajos, pero no debajo de los límites de detección de la cámara de.
   2. Otro conjunto de ovariolas en buffer de disección nigericin a pH 7.5 la imagen y ajustar la configuración de tal manera que las intensidades de los píxeles de las imágenes pHluorin y mCherry están alta, pero no saturado.
   3. Imagen ovarios en disección de bicarbonato del almacenador intermediario y aseguran de que las intensidades de los píxeles de las imágenes pHluorin y mCherry no están saturadas con las opciones solicitadas. Si los píxeles están saturados, ajuste la configuración según sea necesario.
      Nota: Microscopio parámetros de configuración pueden variar basado en la configuración del microscopio exacta se utiliza y debe optimizarse para cada experimento. Después de establecer los ajustes del microscopio, no los cambian para el resto del experimento. Ajustes deben ser consistentes a través de control y condiciones experimentales. En nuestros experimentos iniciales pHi, genera las curvas de calibración de punto nigericin 2 y 3 y no encontró diferencias significativas entre pHi calculado utilizando cualquiera de los métodos. Sin embargo, en general, la adición de más puntos en la curva de calibración se espera mejorar la precisión. Por lo tanto, se recomienda generar curvas con diferentes números de puntos para determinar cuántos son necesarios para un determinado conjunto de condiciones experimentales de.
3. Recolección de datos:
   1. realizar la disección, montaje y proyección de imagen de las muestras en las condiciones de buffer bicarbonato y nigericin. Después de la disección y montaje, el tiempo máximo de un conjunto de muestras de la proyección de imagen no debe exceder 45 minutos para asegurar que se realicen las mediciones de intensidad de fluorescencia en el tejido vivo, sano.
   2. Para cada condición, adquirir imágenes de al menos 5 germaria.

3. Juicio Posterior: Análisis de imágenes

1. intensidades de fluorescencia medida en Eve, PFC y las células del folículo
   1. fondo resta:
      1. abierto sin procesar imágenes en FIJI con cada canal en una ventana separada ( figura 4).
      2. Utilice la herramienta Rectángulo para dibujar un área de interés (ROI) en la ventana del canal pHluorin en una parte de la imagen sin señal.
      Paso de
      3. opcional: establece el límite inferior del umbral para que los píxeles con valores de intensidad por debajo del fondo están excluidos y establecer el límite superior del umbral máximo. Cuando el umbral se establece de esta manera, las áreas de la imagen sin señal en su mayoría son de color azules y la señal es visible ( Figura 4A).
      4. Medir la intensidad de fluorescencia media en el ROI. Si el umbral se establece en el paso 3, asegúrese de comprobar la " límite umbral " en el cuadro de diálogo establecer las medidas de la caja.
      5. Restar la intensidad de fondo medido de cada canal y de la imagen utilizando la función de restar, en el proceso de → el menú Math.
      6. Repetir pasos 3.1.1.2-6 para la ventana del canal mCherry salvo que, en el paso 3.1.1.2, en lugar de dibujar un nuevo rectángulo con la herramienta Rectángulo, utilice la función de selección de restauración, en la edición → menú de selección, para añadir un rectángulo con la misma dimensiones y posición en la imagen.
   2. Identificar remiten, PFC y las células del folículo:
      1. identificar la Eve, los PFC y las células del folículo por la morfología y ubicación mediante la tinción de concanavalina-A encontrar límites de la celda ( figura 2).
      2. Eve es delgadas células triangulares situadas en el borde del germarium en la frontera de 2a/2b de la región. Si mCherry::pHluorin se expresa en un clon de la FSC, FSC también puede ser identificado como la célula más anterior del clon.
      3. PFC es células de forma irregular en la región 2b, inmediatamente adyacente a y de Eve.
      4. Las células del folículo son células cuadradas o columnares que rodean el quiste de la célula de germen en la región 3.
   3. Obtención de ratios de intensidad de fluorescencia
      1. elegir uno o más sectores en el que la célula de interés tiene mayor intensidad de fluorescencia en el canal mCherry y asegúrese de que la tinción de concanavalina-A, visto en el canal far-red, en foc nosotros dentro de la división seleccionada.
      2. ROI dibujar alrededor de cada FSC y medir la intensidad de fluorescencia media de pHluorin y mCherry en todos rebanadas solicitada para las medidas de.
      3. Dividir la intensidad de fluorescencia media del canal pHluorin por la intensidad de fluorescencia media del canal mCherry para calcular un cociente de pHluorin fluorescencia mCherry.
2. PHi Derive valores y generar imágenes pseudocolored
   1. valores de pHi Derive
      1. en todos los casos, se debe generar la curva de regresión lineal con ovarios de moscas del mismo genotipo para ambos experimental y control de condiciones. Generar una curva de regresión lineal para cada tipo de célula con los datos de dos nigericin condiciones de buffer ( figura 3). En Excel, esto puede hacerse trazando los datos de un gráfico y añadiendo una línea de tendencia lineal. Alternativamente, vea:
      2. uso la pendiente y la intersección de la curva de regresión lineal calculadas a partir de las condiciones de nigericin y la ecuación de una línea (y = mx + b) convertir el pHluorin a valores del cociente mCherry calculada a partir de las muestras en el bicarbonato condición para valores de pH. En esta ecuación, b sustituir la forma de la pendiente (la intersección), poner el valor de la relación de x y resolver para y.
   2. Generar una imagen pseudocolored que refleja los valores del cociente en FIJI.
      1. Siga el procedimiento anterior para sustracción de fondo (paso 3.1.1 y figura 4).
      2. Divide el canal de pHluorin del canal mCherry utilizando la función calculadora de la imagen, en el menú de proceso. Asegúrese de que el " crear nueva ventana " y " resultado de 32 bits (float) " casillas de verificación se comprueban. Cambiar la tabla de búsqueda (LUT), encuentra en el menú de la imagen térmica o LUT de elección. Vea la figura 4 para otras opciones adecuadas.
      3. En el cuadro de diálogo ajustar brillo y contraste (imagen → ajuste → brillo/contraste), haga clic en el " Set " botón. Conjunto mínimo muestra valor a 0 y el máximo valor a una relación que mejor captura los datos, normalmente 1.0-2.0 ( figura 5).

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Resultados

Aquí hemos descrito el proceso de medición de pHi en el epitelio folicular, que implica varios pasos. En primer lugar, los ovarios son disecados de moscas del genotipo apropiado usando herramientas para disección y montaje (figura 1). Las ovariolas son entonces reflejadas mediante microscopía de fluorescencia cuantitativa y las imágenes se analizan para obtener medidas de pHi. Para cada imagen, se identifican los tipos de células de interés tal como se...

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Discusión

Aquí, describimos un método para la medición de PI de las células en el linaje FSC dentro del tejido de tipo salvaje. Este protocolo ha sido desarrollado y refinado durante los últimos cinco años, desde que comenzó a estudiar pHi en Drosophila el tejido ovárico. Durante ese tiempo, el protocolo ha sido utilizado con éxito por varios investigadores en nuestro laboratorio y por lo menos cuatro diferentes spinning disco y microscopios de escaneo láser. La reproducibilidad de nuestra observación original,...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3