ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

要約

ライブショウジョウバエ卵巣組織の上皮幹細胞系列の細胞内 pH のイメージングのためのプロトコルを提供します。定量的蛍光イメージングを用いたバイオ センサー pH センサー、mCherry::pHluorin、イメージを表現する遺伝子組換えハエを生成し、標準曲線を生成 pH 値に変換する蛍光強度の方法について述べる。

要約

細胞内 pH (pHi) の変化は、代謝、増殖、分化など多くの細胞機能の調節に重要な役割を果たします。通常、ピピのダイナミクスは、測定やピピの実験操作に適している培養細胞で決定されます。ただし、新しいツールと方法論の最近の発展が可能そのままに、ライブの組織内のピピのダイナミクスを研究します。ショウジョウバエ研究の 1 つの重要な開発だったピピ バイオ センサーを運ぶ遺伝子組換えラインの世代 mCherry::pHluorin。ここでは、我々 は mCherry::pHluorin 遺伝子の野生型の行数で卵胞上皮幹細胞 (FSC) 系統のピピを測定するイメージング ライブショウジョウバエ卵巣小管に頻繁に使用されるプロトコルについて述べるただし、ここで説明する方法は翅原基と眼の上皮を含む他の組織のために容易に適応することができます。ライブ イメージング、および集録および解析ピピ値を取得する画像中の卵巣組織の維持 FSC 系統 mCherry::pHluorin を表現するための手法について述べる。

概要

最近の研究は、細胞分化と異生体内で^1,2ピピの変化のための役割を明らかにしました。これらの研究は、細胞 1 つの段階から別への移行が変更されるが、そのファイは著しく分化、同じステージで同じ型のセルで一貫性のあるを発見します。いくつかのケースでピピで変更を部分的にブロック分化、ピピの変化は細胞の運命の変化の結果だけではないが、代わりにおそらく pH に敏感な調節に及ぼす影響を細胞の運命の変化を促進するのに役立ちます示唆を妨害します。タンパク質や分化に必要な化学反応。今後の研究には、ピピ動態の生体内でさまざまな役割にもっと洞察力を明らかにする可能性があります。しかし、生体内での分化時にピピを研究の課題の 1 つがピピの正確な測定を取得します。分化細胞の形態と遺伝子発現の変化などの他の機能とは異なりピピはセルが固定され、標準的な方法でグリセリンのセルに保存されていないの不安定な化学プロパティです。さらに、強調している細胞の安定や実験操作の結果として死んで、ピピはできません。したがって、ピピを測定するとき生きていると可能な限り健康細胞を保つために重要です。いくつかの重要な染料が生体内研究深くまたは均等に、彼らは組織を浸透しないので、場合は細胞文化³ではなく、多くのピピを測定、それらのためによく働くが適していないいる利用可能な正確な測定を提供するために十分な.

貧しい染料の浸透の問題を回避するために私たちと他の人は、遺伝的コード化プローブ、mCherry::pHluorin^4,5,6、7セルで具体的に表すことができるを使用しています。興味とイメージで生体の種類。pHluorin は高い pKa と GFP のバリアント (~ 対 7.0 〜 4.0) を折るより容易により高い ph;だから pHluorin 分子の人口から放出される総蛍光強度は φ⁸の増加とともに増加します。重要なは、蛍光、ピピ値の正常細胞質範囲内で線形です。対照的に、mCherry の蛍光 (pKa 〜 4.5) ゾル性細胞質範囲内の pH の変化に敏感ではないです。これらの 2 つの記者が均等に存在している常にので、1 つのオープンリーディング フレームによって符号化される単一のキメラ蛋白質として一緒にリンク共有されます。したがって、mCherry の蛍光強度を 1p-169 比は、各セルにプローブ濃度に正規化されたファイの測定を提供します。比率は、知られている pH 値を平衡して組織から mCherry 比、pHluorin を取得することによって生成された標準的なカーブを使用して φ 値の推定値に変換できます。

ここでは、mCherry::pHluorin を使用してショウジョウバエ卵巣上皮の FSC 系統のピピを測定する方法をについて説明します。このよ特徴付けられた組織は、上皮の生物学、幹細胞の自己複製と分化^9,10,11, 集団細胞遊走^{12 などのさまざまな側面をモデルに使用されています}、および開発、細胞極性^13,14の保守。卵胞上皮は、germarium^15,16と呼ばれる構造に組織の前方の端にある 2 つの Fsc によって生成されます。これらの細胞が自己更新し、ニッチを再入力と FSC になるまたは 3 つの異なる卵胞細胞の種類のいずれかに分化する実行できる prefollicle 細胞 (pFCs) と呼ばれる子孫を生成する成人期に定期的に分割: 極細胞、茎細胞、または本体卵胞細胞。我々, 以前では野生型組織、ファイは、Pfc の 7.0 に Fsc の約 6.8 のピピから、卵胞細胞²7.3 への分化の初期段階の間に着実に増加します。深刻な pFC 分化を損なう、 DNhe2の過剰発現によるピピの増加に対し原因軽度の過剰な分化の普遍的発現ナトリウム/プロトン交換、 DNhe2、RNAi ノックダウンでこの増加をブロック表現型。これらの調査結果は、ピピは初期の FSC 系統の維持安定、生体内で増減実験できることを示しています。ここで説明する方法は、野生型組織や RNAi ノックダウンまたは利子および有糸分裂のクローンの Gal4 を使用して過剰発現を含む突然変異体の組織の様々 な形のピピを測定する使用できます。

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プロトコル

注: FSC 系統のピピを測定する Fsc、pFCs、生理的条件下で卵胞細胞の mCherry に 1p-169 の蛍光強度の比を計算し、標準でピピ値比に変換各セルの較正曲線は、 ⁷ を入力します。PHluorin と mCherry germaria NaHCO ₃、生理的条件 ^{1 ,} を模倣するを含むバッファーに解剖での蛍光強度を測定するためまず、ライブ イメージング実験を行った ⁷. ナ ⁺ で pHluorin と mCherry の蛍光強度を測定することによって次に、標準的なカーブが生成されます-無料、イオノフォア nigericin を含む K ⁺ のバッファーは、2 つの異なる pH 値の調整 6.5、7.5。Nigericin の存在下でピピは細胞外 pH を一致するファイを引き起こす膜の間でバッファーの pH をあります。標準曲線を使用して pHluorin を mCherry 比の推定ピピ値に変換する最後に

。

1。 予審: In Vivo 測定前準備ピピ

注: ピピ 体内 測定、mCherry::pHluorin 遺伝子が興味のセル型で表されます。FSC 系統で飛ぶ遺伝子 pHluorin を生成するいくつかの一般的な方法のとおりです。MCherry::pHluorin のクローンを生成する FSC クローンの前方の端に配置されている Fsc を識別する場合に特に便利です。ティッシュ特定の mCherry::pHluorin 式は全体の組織の間でピピの計測に有用、またより便利な RNAi や遺伝子の表現を組み合わせるとき

。

遺伝子組換え 1p-169 世代ハエ
1. mCherry::pHluorin ラベル FSC
2. クローン
   1. mCherry::pHluorin FSC のクローンを作成するは、株式やその他法律 Gal4 flipout に UA mCherry::pHluorin ¹ をクロスFlp/FRT 誘導 Gal4 と貯蔵
   。
   2. 誘引可能なクローンは、heatshock を作成する heatshock 2 日間大人 F1s 投稿 37 ° C の水浴、4 回 12 h. に約 1 時間の空の小瓶で羽化
   3. にこの期間中には、正常な成長と卵形成の最大レートを確保するため、新鮮なウェット酵母を提供することによってハエを維持 (約等しい部品乾燥パン屋 ' s 酵母と水) クローン誘導後少なくとも 6 日の毎日
   。
3. 組織特定 mCherry::pHluorin 式
4. 卵胞細胞特定のドライバーを y ¹ w *; UA mCherry::pHluorin ¹ をクロスP {GawB} 10930/CyO (ブルーミントン ID: 7023).
5. ハエを eclosing、開始後 3 日を収集し、ウェット酵母、解剖前に少なくとも 24 時間を含むバイアル内に配置します
。
1. ソリューション
   注: バッファーの pH, 溶質濃度は時間の経過と共に変更できるので、実験の日に次のバッファーを準備することが重要です。
   1. 重炭酸塩、nigericin、および郭清のバッファーを準備します。(表 1 表 2、および 表 3 参照) の沈殿物の形成を避けるために記載されている順序でコンポーネントを追加します
   。

2。試み: 測定 FSC 血統でピピ

注: 郭清、マウント、およびライブ イメージング炭酸バッファーと 2 つの nigericin バッファー条件について 2 回実行する必要があります: 顕微鏡を判断します。設定、2 回目の実験データを収集します。詳細については、セクション 2.2 以下を参照してください

。

1. 郭清と取付
   注: この手順を実行する必要な材料 材料の表 と 図 1 を参照してください。3 D 印刷取り付け部屋 3 D プリンター ファイル 補足のファイル 1 と ファイル 2 の補足 として提供しています。
   1. 郭清:
      1. 準備取付チャンバー真空用グリースの薄膜コーティングを 3 D の平坦な面に適用することによってプリント取付商工会議所。22 × 40 mM coverslip 取付室 coverslip を密封するためにその辺を配置します
      。
   2. 500 μ L 解剖バッファー (重炭酸塩または nigericin、表 3) で雌成虫の卵巣の解剖
      1. CO ₂ ガスを使用して 3-4 ハエを麻酔し、転送飛ぶ飛ぶパッド CO と灌流に ₂ ガス
      。
      2. 鉗子と郭清のメディアに場所で麻酔のフライをピックアップします
      。
      3. の卵巣が公開されるまで、腹部の先端にえい航しながら 1 つの鉗子を使ってオンザフライの胸郭をピンチします
      。
      4. 卵巣が他の臓器をデタッチ後離れて 22 の ^1/2 の注射針を使用して卵巣小管をいじめます。慎重に独立した筋肉の卵巣と卵巣小管のクラスターから別の個別卵巣小管から外装します。筋肉の鞘を分離するための効果的な手法の前方の端の場所で卵巣小管のクラスターを保持し、単一の卵巣小管の長さに沿って下向きストローク 1 つの注射針を使用することです
      。
      5. Nigericin 郭清メディアの pH で完全に平衡にセルのファイの十分な時間があるので取り付けの手順に進む前に丁度 10 分間解離メディアで切り裂かれた卵巣をインキュベートします
         。 注: は、卵巣小管から筋鞘を削除することを確認します。筋肉の鞘が困難を使用して個々 のセルを識別するために蛍光信号を減衰させる、Concanavilin のライブ イメージング中に自発的に移動する卵巣小管を引き起こす可能性があります
      。
   3. マウント
      1. 取り付け室内ガラス基盤上に郭清メディアの小滴を配置します
      。
      2. 転送分離鉗子を用いた卵巣小管
      。
      3. 以前の段階の卵室に関連付けられている germaria から後ステージ卵室を分離し、切り裂かれた germaria が郭清メディア ドロップの中心に置かれることを確認してください
      。
      4. ラウンド 12 mm カバーガラスの両端に爪のポーランド語の 2 つの小滴を追加し、それが空気乾燥約 10 s.
      5. 場所ラウンド coverslip を含む解剖メディアのドロップは、マニキュアと側下の顔解剖メディアの連絡先、germaria を分離しました。平らにし、位置に germaria を確保するマニキュアとエッジの部分を押してください。スメアほど、カバーガラスの表面上の場所でそれを確保するために古いマニキュアを使用して勧めします
      。
      6. では、追加解剖メディアでの取付をチャンバーします。チャンバーにコンカナバリン A 染料を含まない条件特定のバッファーを使用できます
         。 注: 時間の合計を過ごした解剖. 取付は 15 分を超えないようにしてください。これは組織の損傷の影響を最小限に抑えることが重要です。細胞死と
      。
2. ライブ イメージング:
   注: この手順ではまず炭酸状態と顕微鏡の適切な設定を決定する 2 つの nigericin 条件から画像を収集; 必要に応じて顕微鏡設定を調整その後、実験データの画像を収集しています。3 チャネルでイメージングできる共焦点顕微鏡を使用: GFP (475 励起/509 排出), mCherry (575 励起/610 排出) と遠 (633 励起/647 排出).
   注: 顕微鏡設定: 各画像セットの信号強度の値が低すぎても飽和ことが重要ですので、ピピの見積もりを決定するを収集した画像のピクセル強度を定量化するでしょう。画像でキャプチャできる強度の範囲は、画像のビット深度によって定義されます。多くの場合、既定では、8 ビットの画像で生成がより広いダイナミック レンジを持つ 16 ビット イメージとしてデータを取得することをお勧めします。蛍光チャネル間のクロストークを最小化発光スペクトルから収集された設定を調整する必要がありますので、各 fluorophore は重複しないことを確認することが重要です。これらの設定をテストするには、励起スペクトルを用いた GFP サンプル画像を取る、mCherry と その逆 の発光スペクトルの収集します。設定は、正しく調整されている場合、必要がありますない信号どちらの場合。すべての 3 つのイメージ セットの信号の輝度がイメージ ファイルの動的範囲内でされるように顕微鏡設定 (すなわち、電圧設定を共焦点レーザー スキャン、レーザー パワーとピンホールのサイズ) を設定します。すべての実験において、必要に応じて、我々 はすべての実験のための電圧利得を最適化しながら、1,024 × 1,024 形式で 16 ビット画像を取得するのに白い光レーザー共焦点顕微鏡 40 倍対物を使用しました。たとえば、1 つの実験で mCherry、GFP の電圧利得が設定と 37.8%、72.9%、260%、赤外それぞれ。
   1. Nigericin 郭清 pH 6.5、buffer 内卵巣小管のイメージし、pHluorin と mCherry の画像の輝度が低く、しかし、カメラの検出限界以下の設定を調整します
   。
   2. Nigericin 郭清 pH 7.5 buffer 内卵巣小管の別のセットをイメージし、pHluorin と mCherry の画像のピクセル強度が高いが、飽和していないように設定を調整します
   。
   3. 重炭酸の解離イメージ卵巣はバッファーに格納し、pHluorin と mCherry の画像の輝度が選択した設定と飽和していないことを確認します。ピクセルを飽和している場合は、必要に応じて設定を調整します
      。 注: 顕微鏡のパラメーターの設定が異なる場合があります使用されている正確な顕微鏡の設定に基づいて、各実験のために最適化する必要があります。顕微鏡設定が設定された後、実験の残りのそれらを変更しないでください。設定すべきコントロールと実験条件間で一貫しました。初期ピピ実験で 2 と 3 点 nigericin の較正曲線を生成し、いずれかの方法を使用して計算されるピピ差が見つかりません。ただし、一般に、較正曲線のより多くのポイントの追加に期待される精度を向上させます。したがって、実験条件の特定のセットの必要な数を決定するポイントの数が異なる曲線を生成するをお勧めします
   。
3. データ収集:
   1. 郭清、マウント、および重炭酸塩と nigericin のバッファー条件で試料のイメージングを実行します。1 組のサンプルの画像をライブ、健康な組織の蛍光強度の測定をように 45 分超えない郭清と取り付け、最大の時間を過ごした後
   。
   2. 条件ごとに、少なくとも 5 の germaria の画像を取得します
   。

3。後の試み: 画像解析

1. Fsc、pFCs、卵胞細胞の蛍光強度を測定
   1. バック グラウンド減算:
      1. オープン未処理の別のウィンドウ (各チャネルにフィジーの画像 図 4).
      2. PHluorin チャネル ウィンドウの信号なしのイメージの一部で利益 (率 ROI) の領域を描画する四角形ツールを使用します
      。
      3. オプションの手順: しきい値の下限を設定し、背景下強度値を持つピクセルは除外し、最大しきい値の上限を設定します。この方法でしきい値を設定すると、信号のないイメージの領域は、主に青と信号が明確に表示されます ( 図 4 a).
      4. は、投資収益率の平均蛍光強度を測定します。しきい値は、手順 3 で設定された場合は、ご確認ください、" のしきい値制限 " 測定の設定] ダイアログ ボックスの
      。
      5. 各チャネルおよびプロセスは、減算関数を使用してイメージのスライスから測定したバック グラウンド強度を引く → 数学メニュー
      。
      6. 繰り返しの手順 3.1.1.2-6 3.1.1.2 の手順でを除いて、mCherry チャネル ウィンドウの矩形ツールを使って新しい四角形を描画する代わりに復元の選択機能を使用して、編集の → と同じ四角形を追加する選択メニューサイズと画像を位置します
      。
   2. を識別する場合、Fsc、pFCs、卵胞細胞:
      1. Fsc、pFCs、卵胞細胞形態およびコンカナバリン A の染色を使用してセルの境界 ( 図 2) を検索する場所を特定します
      。
      2. Fsc、薄い三角形セル領域 2 a ・ 2 b の枠線上で germarium の端に位置します。FSC には mCherry::pHluorin は、FSC クローンで表されます場合、クローンの前のほとんどの細胞として識別できます
      。
      3. pFCs は地域 2 b、すぐに隣接して、Fsc の下流で不規則な形をした細胞
      。
      4. 卵胞細胞が地域 3 胚細胞嚢胞を囲む正方形または円柱状細胞
      。
   3. 取得の蛍光強度比
      1. 興味のセルが mCherry チャネルで最高の蛍光強度を 1 つまたは複数のスライスを選択し、foc が遠チャネルで見られるコンカナバリン A 染色確認選択したスライス内私たち
      。
      2. 各 FSC と pHluorin とすべての mCherry の平均蛍光強度の測定のために選択したスライス メジャーの周りを描く ROI
      。
      3. MCherry 蛍光 1p-169 比を計算する mCherry チャネルの平均蛍光強度で pHluorin チャネルの平均蛍光強度を分割します
      。
2. 取得値し、pseudocolored の画像を生成する
   1. 取得ファイ値
      1. 同じ遺伝子型のハエから卵巣の場合、線形回帰曲線を生成します。両方の実験条件を制御し、。2 つの nigericin バッファー条件 ( 図 3) からのデータを使用して各セルの型に回帰曲線を生成します。Excel では、グラフにデータをプロットし、線形近似曲線を追加することで実行できます。代わりに、参照してください:
      2. 使用 nigericin 条件と直線の式から算出する斜面と線形回帰曲線の y 切片 (y = mx+b と)、pHluorin を mCherry 比の値に変換する重炭酸塩のサンプルから計算pH 値の条件。この式の b の代わりに斜面形 (y 切片)、x のための比の値を入れて、裕の解決
   2. フィジーの比率値を反映して pseudocolored 画像を生成します。
      1. バック グラウンド減算 (ステップ 3 上記の手順に従ってくださいします。1.1 および 図 4).
      2. は、pHluorin のチャネル mCherry プロセスのメニュー画像電卓関数を使用して分割します。必ず、" を作成する新しいウィンドウ " と " 32 ビット (浮動小数点) の結果 " のチェック ボックスの両方がオンします。変更するルックアップ テーブル (LUT)、熱または選択の LUT イメージ メニューの下にあります。その他の適切なオプションの 図 4 を参照してください
      。
      3. 調整明るさとコントラスト ダイアログ ボックス (画像 → 調整 → 明るさ/コントラスト) をクリックして、" 設定 " ボタン。セット最小表示値を 0、最大表示値比は、その最高のキャプチャ データは、通常 1.0-2.0 ( 図 5).

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結果

ここでいくつかの手順を含む卵胞上皮のピピを計測するプロセスを説明しました。まず、卵巣は解剖や実装のためのツールを使用して適切な遺伝子 (図 1) のハエから解剖しました。卵巣小管が定量的蛍光顕微鏡を使ってイメージ化して、ピピの測定画像を分析します。各イメージ セクション 3.1 (図 2) で説明されているよ?...

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ディスカッション

ここでは、野生型組織内 FSC 系統の細胞のピピの測定法について述べる.このプロトコルを開発し、ショウジョウバエ卵巣組織のピピを勉強する最初を開始して以来、過去 5 年間で洗練されました。その間、プロトコルは、複数の捜査官当研究室と、少なくとも 4 つの異なる回転する円盤とレーザ走査型顕微鏡で正常に使用されています。当社独自の観測、ピピ増加卵胞細胞状態に pFC ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3