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Resumen

Aquí, presentamos el protocolo detallado en la BioMILD cribado prueba para realizar la prueba de clasificador circulación de microARN firma para detección temprana de cáncer de pulmón.

Resumen

El desarrollo de una prueba mínimamente invasiva, como la biopsia líquida, para la detección precoz del cáncer de pulmón en su fase preclínica es crucial para mejorar el resultado de esta enfermedad mortal. MicroRNAs (miRNAs) son específico, pequeños, no-codificación RNAs regulación de la expresión génica, que puede actuar como mensajeros extracelulares de señales biológicas derivadas de la diafonía entre el tumor y su microambiente circundante de tejido. Podrían representar así los candidatos ideales para la detección temprana del cáncer de pulmón. En este trabajo se propone un flujo de trabajo metodológico para la validación prospectiva de una circulación miRNA prueba microfluídicos hecho personalizado tarjetas y PCR cuantitativa en tiempo real en muestras de plasma de voluntarios en un ensayo la detección del cáncer de pulmón. Además, puesto que el lanzamiento de miRNAs relacionados con hemólisis y aspectos técnicos más generales puede afectar el análisis, también se presentan los pasos de control de calidad en los procedimientos de operación. El protocolo es reproducible y da resultados cuantitativos fiables; sin embargo, al utilizar series clínicas grandes, pre-analíticas y analíticas las características deben ser evaluadas con cautela.

Introducción

Cáncer de pulmón es el más comúnmente diagnosticado cáncer en todo el mundo, representando cerca del 25% de los diagnósticos de cáncer1. A pesar de la reducción constante en la tasa de mortalidad de cáncer de pulmón en las últimas 2 décadas, debido principalmente a la reducción de tabaquismo, cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en hombres y mujeres. En 2017, se prevé que cuenta aproximadamente el 25% y 20% de las muertes de cáncer total en los Estados Unidos y Europa, respectivamente1,2.

Puesto que los síntomas no ocurren generalmente en la enfermedad temprana, la mayoría de los cánceres de pulmón se diagnostica en etapas avanzadas. Esto lleva a una limitada posibilidad de intervención terapéutica y la pobre eficacia de los tratamientos3. Por lo tanto, muchos esfuerzos científicos se dirigen a identificar una prueba eficaz para la detección temprana de cáncer de pulmón.

Una variedad de ensayos de detección muestra que la radiografía de tórax no tiene valor en la detección de cáncer de pulmón, mientras que bajas dosis computada tomografía (LDCT) es una mejor herramienta en comparación con la radiografía para la detección temprana etapa pulmonar cáncer4. Por otra parte, se ha visto thatscreening con el uso de LDCT reduce mortalidad por cáncer de pulmón hasta un 20% entre los fumadores actuales y anteriores5. Estos datos apoyan el uso de la detección del cáncer de pulmón en una población de alto riesgo como se define en las directrices en varias sociedades profesionales4,6.

De nota, entre las principales preocupaciones de detección LDCT, existe la alta tasa de resultados falsos positivos y sobrediagnóstico. Que siendo así, la comunidad científica está buscando una estrategia superar estos problemas y aumentar la especificidad de la prueba de detección de LDCT. El desarrollo de biomarcadores complementarios no invasivo podría ser útil aquí. Hasta la fecha, hay una extensa lista de biomarcadores de candidatos bajo investigación, como miRNAs, sin células ADN, metilación de genes, proteínas pequeñas y otros7.

Biomarcadores basados en la sangre, incluyendo biomarcadores de la respuesta inmune y circulación miRNAs, son aquellos que llegan a los más avanzados validación fase8. Los biomarcadores de la respuesta inmune se basan en el conocimiento de que las respuestas inmunitarias contra dos antígenos de tumor intracelular y de superficie se acumulan en el cáncer de pulmón pacientes9. Por ejemplo, Ajona et al. evaluado el papel de C4d, un producto de degradación de la vía clásica del complemento, en el diagnóstico y pronóstico de cáncer de pulmón10. De lo contrario, un suero de autoanticuerpos comercialmente disponible prueba examinar siete antígenos tumorales ha sido validado en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas y mostró 36% de sensibilidad y 91% de especificidad11. Biomarcadores de la respuesta inmune son interesantes, pero se necesitan más estudios de validación para una potencial aplicación clínica.

miRNAs son endógeno pequeños no-codificación RNAs mecanismo conservado y de gran significación funcional en todo los reinos animal y vegetal. El papel de miRNAs es regular la traducción de la proteína: reprimen la expresión de un amplio conjunto de genes objetivo12. Ha sido bien documentado que la expresión de alteraciones ofmiRNAs contribuir a la patogenesia del cáncer más humano12,de13,14. Además, tumor y células estromales liberan miRNAs, estabilizada por su incorporación en microvesículas o a través de la asociación a proteínas de unión a RNA, en fluidos corporales como el plasma y el suero15,16, orina17 y saliva18. Circulación de miRNAs así puede reflejar la respuesta del huésped y la dinámica interacción entre el tumor y su microambiente19. En conjunto estas observaciones han hecho miRNAs circula una prometedora clase de biomarcadores para la detección de cáncer en humanos.

Circulación miRNAs puede detectarse mediante diferentes métodos: microarrays plataformas20, cuantitativa inversa transcripción PCR (RT-qPCR)21y siguiente generación de secuenciación (NGS)14,22. Diversos estudios de Perfil de expresión basados en las tecnologías mencionadas se han desarrollado en los últimos años. Microarray es una tecnología de alto rendimiento, capaces de analizar miles de miRNAs en un solo análisis. Sin embargo, tiene menor rango dinámico y especificidad comparado con RT-qPCR o NGS. Además, microarray es un método no cuantitativo, por lo tanto se requiere mayor validación experimental. Métodos basados en la secuencia pueden permitir la identificación de los miRNAs desconocido y son convenientes especialmente en una fase de descubrimiento. Por otro lado, NGS métodos son todavía caros y requieren equipo especial y bioinformáticos experto, lo que limita su uso en cohortes grandes de validación y ajustes clínicos23. Por el momento, RT-qPCR es la plataforma más adoptada para la detección de miRNA en un contexto de diagnóstico/clínica24de circulación. Existen diferentes tecnologías de RT-qPCR para análisis miRNAs, pero el lazo del vástago RT seguido por TaqMan PCR es el más ampliamente utilizado25. Esta técnica es extremadamente sensible y preciso (la sola discriminación del nucleótido) y tiene un alto rango dinámico; sin embargo, permite la detección de miRNAs conocido solamente.

El control de calidad de microARN Mestdagh et al investigado ampliamente las características de algunas plataformas disponibles comercialmente para miRNAs perfiles basados en las tres tecnologías mencionadas26estudio (estudio miRQC). Analizando 196 miRNAs en muestras de suero y los tejidos, se evaluó el desempeño de las distintas plataformas en términos de reproducibilidad, sensibilidad, precisión, especificidad y concordancia de la expresión diferencial. Los resultados han mostrado que plataformas basadas en NGS microarray tecnologías tenían una mayor reproducibilidad y especificidad, y RT-qPCR plataformas fueron más precisos y sensibles y tenían una tasa de detección, especialmente para bajo entradas muestras de RNA, como cuerpo fluidos. Así, RT-qPCR parece ser el método más adecuado para una potencial aplicación en el diagnóstico clínico rutinario.

En 2011, Sozzi et al analizaron el perfil de miRNA de las muestras de plasma de voluntarios inscritos en un primer LDCT screeningtrial (ensayo INT-IEO)27 y cuatro firmas de miRNA compuestas por relaciones recíprocas entre 24 circulando miRNAs se generaron. Estas firmas fueron capaces de discriminar individuos libres de enfermedad de pacientes con alguna o letal cáncer de pulmón en el tiempo o hasta 2 años antes de la detección de enfermedad LDCT28. En un trabajo posterior, el mismo grupo se describe por primera vez el clasificador de firma de miRNA (MSC), obtenido mediante la combinación de las cuatro firmas de miRNA para estratificar a los pacientes en tres niveles de riesgo: alta, intermedia y baja. Su utilidad clínica fue validado en un amplio conjunto retrospectivo de más de 1.000 personas en el ensayo de proyección suave, un estudio aleatorizado comparando armas LDCT anuales o Bienal con un brazo de observación29. De hecho, la combinación de MSC y LDCT redujo la tasa de falsos positivos LDCT por aproximadamente 5 veces y fueron los tres grupos de riesgo MSCasociados con la supervivencia global.

Más tarde, en 2013 en la "Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori" (Milán, él) prospectiva proyección ensayo (BioMILD) aplicación LDCT con el plasma basado en prueba MSC fue lanzado. Voluntarios en el ensayo BioMILD experimentan retiro LDCT y sangre que se procesa inmediatamente para separar plasma de miRNA perfiles utilizando tarjetas de encargo hecho microfluídicos. La combinación de los resultados de LDCT y MSC define la específica investigación algoritmo24.

En el presente trabajo, el conjunto del protocolo metodológico utilizado en el ensayo BioMILD se describe, a partir de la recolección de muestras de sangre, al aislamiento de plasma, extracción de RNA, y el perfil de expresión de 24 miRNAs uso personalizado tarjetas de microfluidos RT-qPCR. Dada la alta consistencia y reproducibilidad, estos procedimientos pueden también utilizarse para el desarrollo de las biopsias líquidos base de miRNA en otras enfermedades.

Protocolo

el protocolo fue aprobado por el Comité de ética de investigación de nuestra institución.

1. recogida de muestras de plasma

  1. recoger 10 mL de sangre entera muestra en tubos Vacutainer con aerosol revestido K 2 EDTA y almacenar a temperatura ambiente.
    Nota: Para minimizar la hemólisis, separar el plasma dentro de 2 h. No guarde la sangre a baja temperatura (es decir, 4 ° C) para evitar el choque térmico y célula lysis que conducir a una liberación inespecífica miRNA.
  2. Dentro de 1 h, separar el plasma por un primer paso de centrifugación en 1.258 x g y 4 ° C por 10 min.
  3. Transferir el plasma sobrenadante en un tubo de 15 mL, evitando cuidadosamente el contacto con el anillo linfocítico.
  4. Centrifugar el plasma una segunda vez a 1.258 x g y 4 ° C por 10 min.
  5. Alícuota 1 mL de plasma en crioviales de 1.5 mL, evitando la recogida de la fracción de plasma en la base del tubo de.
  6. Almacenar todas las alícuotas en − 80 ° C, excepto para la evaluación de la hemólisis. El análisis molecular debe realizarse dentro de 5 semanas.

2. Evaluación de la hemólisis por medición espectrofotométrica

  1. inmediatamente después de la etapa de separación del plasma, en una cubeta para espectrofotometría, hacer un 1:10 dilución de la muestra de plasma de 1 X PBS (p. ej., 100 μl de plasma en 900 μl de 1 X PBS) y mezclar para homogenizar lo
    Nota: La muestra de plasma no debe ser congelada antes de efectuar las medidas espectrofotométricas, como la congelación-descongelación de la muestra (y en particular en muestras lipémicas), podrían formar flóculos que interfieren con el análisis espectrofotométrico.
  2. Leer la absorbancia a 375 nm, 414 nm, 541 nm y 576 nm usando un espectrofotómetro UV-Vis, con una corrección de línea base se instalaron a 750 nm y una longitud de ruta de acceso de 10 mm. realizan una medición en blanco 1 mL de PBS 1 x.
  3. Calcular la relación entre la absorbancia a 414 nm y 375 nm; si superior a 1.4, considerar la muestra las muestras hemolizada y repetir el retiro de la sangre (QC1 en la tabla 1).

3. Extracción de RNA Total de plasma

  1. preparar una solución de 1-Thioglycerol/homogeneización (OMG) con 20 μl de 1 Thioglycerol por cada mL de solución de homogenización. 1-Thioglycerol es viscoso, Pipetear cuidadosamente para una medición precisa. Enfríe la solución de OMG en hielo o en el 2-10 ° C antes de usar it
    Nota: La solución es estable a 2-10 ° C durante 1 mes.
  2. Suspender el liofilizado DNasa I añadiendo 275 μl de nucleasa-libre del agua en el frasco y mezcle suavemente (no agitar con vortex). Como ayuda visual, añadir 5 μl de azul del tinte a la ADNasa reconstituida y dispensar la solución en partes alícuotas de un solo uso en tubos libres de nucleasas. Almacene reconstituido DNasa I en-30 ° C a -10 ° C.
  3. a partir de 200 μL de plasma, añadir 200 μL de la solución fría de la OMG.
  4. Agitarlos durante 15-30 s para asegurar una completa homogeneización. Si ocurre la formación de espuma, dejar que la muestra colocar en hielo.
  5. Añadir 200 μL de tampón de lisis y 25 μl de proteinasa K a la muestra homogeneizada y vortex 20 s.
  6. Incubar las muestras durante 15 min en un Termomezcladores precalentadas a 37 ° C.
  7. Carga un cartucho para cada muestra en la bandeja de la cubierta del instrumento y coloque el condensador en la posición adecuada.
  8. Transferir el lisado a la posición apropiada en el cartucho instrumento.
  9. Añadir 5 μl de DNasa I solución en la posición correcta en el cartucho de.
  10. Añadir 60 μL de agua libre de nucleasas hasta la base de cada tubo de elución de.
  11. Seleccione el " RSC miRNA tejido " método y comenzar la depuración automática ejecute. Las muestras de RNA total se pueden almacenar en − 80 ° C.

4. Base de Taq RT

  1. utilizar la piscina de la cartilla de Taq RT con los miRNAs de interés para convertir el RNA a cDNA con el Kit de transcripción inversa de Taq MicroRNA.
  2. Preparar 12 μl de mezcla de reacción de RT en el hielo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL según las instrucciones del kit, utilizando 6 μl de la piscina de cartilla personalizada de Taq RT.
  3. Agregar 3 μl de total RNA para un volumen final de 15 μl e incubar en hielo por 5 min.
  4. Carga la reacción de RT en un ciclador térmico configurado como sigue: 16 ° C por 30 min, 42 ° C por 30 min, 85 º C por 5 min y mantener a 4 ° C.
    Nota: El cDNA puede almacenar a -15 a-20 ° C durante por lo menos una semana.

5. La amplificación

  1. mezcla 2.5 μl de cada producto de RT con 12,5 μl de Taq Master Mix 2 x, 3,75 μl Taq Custom y piscinas 6,25 μl nucleasa-libre de agua, para un volumen total de 25 μl.
  2. Realizar la reacción de amplificación previa con un ciclador térmico según el siguiente perfil térmico: 95 ° C durante 10 min, 55 ° C por 2 min, 72 ° C por 2 min, 12 ciclos de 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 4 min , mantenga a 99,9 ° C durante 10 minutos y a 4 ° C.
  3. Diluir agregando 175 μl de 0,1 X TE, pH 8.0.
    Nota: El producto diluido puede almacenar a -15 a-20 ° C durante por lo menos una semana.

6. Reacción de RT-qPCR en Custom Taq matriz MicroRNA tarjetas

  1. uso el 384-bien microfluidicCustom Taq matriz MicroRNA tarjeta para medir los niveles plasmáticos de los miRNAs específicos 24 (spotted por duplicado) en 8 muestras simultáneamente. MiRBase ID (v21) para las 24 miRNAs son: ha-miR-101-3 p, p ha-miR-106a - 5p, ha-miR-126-3, p ha-miR-133a - 3P, ha-miR-140-3, ha-miR-140-5 p, p ha-miR-142-3, p ha-miR-145-5, ha-miR-148b - 3P, p ha-miR-15b - 5p, ha-miR-16-5, p ha-miR-17-5, ha-miR-197-3 p, p ha-miR-19b - 3P, ha-miR-21-5, ha-miR-221-3 p, p ha-miR-28-3, ha-miR-30b - 5p, ha-miR - 30c - 5p, ha-miR-320a, ha-miR-451a, ha-miR-486-5 p, ha-miR-660-5 p y ha-miR-92a - 3 p.
  2. Mezcla 1,13 μl de la muestra diluida del preamplificador con 56.25 μl de 2 X Taq Universal Master Mix y 55.69 μl de agua libre de nucleasas en un tubo de 0,5 mL.
  3. Carga hasta 8 mezcla de reacción de PCR en las tarjetas de encargo Taq matriz MicroRNA.
  4. Centrifugar a 311 x g durante 2 min.
  5. Sello de la tarjeta personalizada con el sellador de tarjeta matriz.
  6. Ejecutar el en tiempo real la reacción usando un sistema de PCR en tiempo real modificando los parámetros de ciclo como sigue: 94,5 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 97 ° C durante 30 s y 59,7 ° C por 60 s.

7. Extrapolación de datos y generación de relaciones de

  1. uso del software para obtener valores de Ct crudos, establecer una línea base automática para eliminar las señales de fondo y un umbral fijo de 0,15 para todos los ensayos y muestras. Quitar manchas con curvas de amplificación deficiente o pobre referencia pasiva señales.
  2. Exportación crudos valores de Ct en " .xls " utilizar el Ct significa el valor de los dos duplicados para su posterior análisis y el formato.
  3. Correlación miRNAs ' niveles de expresión histórico mediciones sobre las muestras de estudio clínico (Tabla 2). Si al menos el 50% de las muestras en cada tarjeta personalizada microfluídicos hecho provocar un Pearson ' correlación s < 97.5, repita la tarjeta (QC2 en la tabla 1).
  4. Calcular la − ΔCts entre los miRNAs, equivalentes a los valores de log2 de los cocientes miRNA.

8. Evaluación de la hemólisis por el miRNA relacionados con firma

  1. generar la firma miRNA relacionados con hemólisis con las siguientes proporciones de miRNA cortes respectivos (log2 valores) para las muestras de plasma de almacenamiento corto (1-5 semanas en − 80 ° C): miR-126/451 < − 0.07, 15b/451 < − 3.67, 221/451 < − 3.18, 30b/451 < − 1.1, p 126/486-5 < − 0,33, p 486/15b-5 < − 3,86, p 221/486-5 < − 3,17, 30b/486-5 p < − 1.42, 126/92a < 1.8, 15B/92a < − 1.8, 221/92a < − 1.04, 30b/92a < 0.87, 126/16 < − 2.85, 15b/16 < − 6.33, 221/16 < − 5.9, 30b/16 < − 3.68.
  2. Clasificar como muestras hemolizadas, donde al menos el 50% de las relaciones (8 de 16) exceder límite respectivo (QC3 en la tabla 1).

9. Definición del nivel de riesgo: alto, intermedio y bajo

  1. definir las cuatro firmas de cocientes de miRNA componiendo el MSC como se informó en la figura 3: riesgo de enfermedad (RD), riesgo de enfermedad agresiva (RAD), presencia de enfermedad (EP) y la presencia de enfermedad agresiva (PAD).
  2. Para cada firma, definir las relaciones superando el valor de corte respectivos para las muestras de plasma de almacenamiento corto (1-5 semanas en − 80 ° C). El número de ratios superior al necesario para considerarse positivo es 9 de los 27 para RD y PD y 14 de 28 para RAD y cojín ( figura 3 A).
  3. Atribuir a cada muestra el nivel de riesgo MSC respectivo como sigue: bajo riesgo si RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ almohadilla neg; riesgo intermedio si RD pos ∪ PD pos ∩ RAD NEG ∩ almohadilla neg; o alto riesgo si RAD pos ∪ almohadilla pos ( figura 3 B).

Resultados

El ensayo BioMILD es un estudio prospectivo para la detección temprana del cáncer de pulmón con el fin de probar la eficacia de un enfoque combinado de MSC LDCT como exámenes de primera línea en una cohorte grande de individuos de fumador empedernido. Una clase de riesgo se atribuye a cada voluntario sobre la base de la prueba de miRNA, que evalúa relaciones entre 24 miRNAs circulantes del plasma. Como en gran parte divulgado30,31,32, la hemólisis es una cuestión crítica para el análisis de miRNA, que circulan ya que podrían obtenerse resultados falsos debido a una liberación inespecífica de miRNAs por células de la sangre. Del flujo de trabajo metodológico propuesto, un control de calidad pre analítico paso (QC1 en la tabla 1) para identificar las muestras hemolizadas, y así no analizables, las muestras de plasma fue descrito. Figura 1 reporta un análisis espectrofotométrico de muestras hemolizadas (figura 1A) y no hemolizado (figura 1B) las muestras de plasma con valores de A414/A375 respectivos. En un contexto clínico fueron el resultado de una prueba molecular es crucial para la gestión de voluntarios, permite que este QC1 repitiendo la toma de muestras de sangre y, en la mayoría de los casos, recuperar la muestra.

Después de su transformación molecular, el rendimiento de la RT-qPCR debe ser evaluado con precisión para identificar cualquier problema técnico. Figura 2 A muestra un RT-qPCR con un bajo rendimiento debido a una señal de mala referencia pasiva. Se recomienda la recarga en este caso el producto de amplificación previa tarjeta microfluídicos. Cuando la RT-qPCR se desempeña bien, como en la figura 2B, la tarjeta procede al primer paso de control de calidad analítico post para asegurar que los valores de expresión de miRNA son comparables con la medición histórica (QC2 en la tabla 1). Si falla el paso QC2, puede haber ocurrido un problema técnico durante la transcripción inversa o en las reacciones de la amplificación, y es conveniente repetir el proceso molecular entero a partir de la transcripción inversa.

El último paso de control de calidad (QC3 en la tabla 1) evalúa la hemólisis también a nivel molecular. Niveles de expresión de miRNAs de eritrocitos específicos 4 (mir-16, mir-451, mir-486-5 p y mir-92a) fueron comparados a los de 4 miRNAs relacionados no hemólisis (mir-126, mir-15b, mir-221 y mir-30b), generación de la firma relacionados con la hemólisis miRNA compuesta por la 16 (4 x 4) ratios de miRNA. Las muestras positivas se clasifican como hemólisis, mientras que las muestras negativas se proceden a la clasificación final del nivel riesgo MSC como se describe en la sección protocolo 9 y figura 3.

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Figura 1: Análisis espectrofotométrico de las muestras de plasma fresco. Perfiles espectrofotométricos de (A) 2 muestras hemolizadas y muestras de plasma no hemolizadas 2 (B), medición de la relación de absorbancias entre longitudes de onda A414 y A375. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 : RT-qPCR rendimiento en microfluidos tarjetas análisis. Amplificación y multicomponentes parcelas pobres comparando (A) y (B) buena calidad microfluídicos tarjetas. Los 24 miRNAs y un único miRNA ejemplifica se divulgan en cada panel. Las parcelas con ilustran las señales de referencia pasiva que ocurre en estas reacciones de RT-qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Algoritmo de estratificación del riesgo de MSC. Resultados representativos, considerando 6 muestras de plasma de los voluntarios inscribieron en BioMILD prueba de detección. (A) firmas de miRNA-índices de riesgo de la enfermedad (RD), riesgo de enfermedad agresiva (RAD), presencia de enfermedad (EP), presencia de enfermedad agresiva (PAD) y los valores límite correspondientes (log2) para plasma las muestras almacenadas a-80 ° C para a por lo menos 1 semana y hasta 5 semanas. (B) combinación de las cuatro firmas a estratificar las muestras analizables en alto (H), intermedia (I) y MSC (L) bajo riesgo nivel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Dificultades y retos de la el flujo de trabajo metodológico
BioMILD es el primer estudio prospectivo análisis miRNAs circula como una herramienta de diagnóstico, umbrales y recortes de madera utilizados para el análisis de los datos se obtuvieron de series retrospectivas. Para superar el problema del intervalo de almacenamiento de las muestras de plasma, los parámetros pueden ser refinados para posiblemente obtener un aumento de la performance de MSC. Sin embargo, antes de iniciar el análisis miRNAs, varios aspectos del proceso general necesitan ser evaluada cuidadosamente, como los criterios de inclusión, la recogida de muestras y procesamiento, y el algoritmo de Bioinformática adoptado para el análisis de datos. Las secciones siguientes se centrarán en los puntos más críticos del flujo de trabajo descrito en el presente trabajo, abordar las cuestiones más importantes de cada escalón y luego proponer estrategias para superarlos.

Población de estudio
Criterios de inscripción para BioMILD ensayo de detección son: 50-75 años viejos, pesados fumadores actuales o anteriores (menos de 10 años) con al menos 30 paquete-años y sin historia previa de cáncer dentro de 5 años. En esta población, la prevalencia de cáncer de pulmón estimada y la incidencia por año eran cerca de 1% y 0.7%, respectivamente. Para aplicar la prueba del MSC como se describe en el protocolo propuesto, la población analizada debe mantener características similares. En particular, el paso de QC2 descrito anteriormente consiste en comparación con los datos históricos dados obtenidos de una población similar. Mientras que una correlación por debajo 97.5 podría ser indicativa de problemas técnicos, por el contrario, mayoría de los individuos con niveles circulantes alterados de miRNA que refleja el riesgo de tener cáncer de pulmón está realmente por debajo de ese umbral. En otras palabras, si el paso QC2 con los parámetros registrados aquí se aplica a una población con mayor riesgo de desarrollar cáncer de pulmón, puede excluir las muestras aceptables. Parámetros de referencia nuevo, apropiado deben entonces definirse que son específicos para cada población analizada según resultados esperados.

Hemólisis y recolección de sangre
La colección de muestras biológicas es un paso crucial de la analítico, ya que puede afectar a las características y calidad de la muestra y así modificar los resultados finales de análisis. Con respecto a las muestras de sangre, es importante recoger sangre fresca y procesar a la muestra lo antes posible. Muestras no deben ser almacenadas a 4 ° C ni congeladas después de retiro de la sangre, ya que la congelación y descongelación pasajes pueden inducir lisis celular (hemólisis) y la degradación del RNA. Para minimizar el proceso de hemólisis, se recomienda separar el plasma dentro de 2 h de sangre colección31 .

La hemólisis es en gran parte debido a la ruptura de glóbulos rojos (gr) y consiguiente liberación de su contenido en el entorno. Esto podría ser un problema de circulación de miRNAs pruebas porque la liberación del contenido intracelular de los glóbulos rojos altera drásticamente el perfil de microARN en la sangre, podrían afectar la precisión del análisis basado en plasma30.

Ser capaces de identificar también niveles mínimos de hemólisis en las muestras de plasma es crucial para estudios basados en la circulación miRNAs como biomarcadores. La hemólisis puede ser evaluada inicialmente por inspección visual, desde después de los dos pasos de centrifugación, que el color del plasma puede variar de amarillo a rojo para muestras altamente hemolizadas. Sin embargo, mera inspección visual puede no ser lo suficientemente sensible en el contexto de la investigación de biomarcadores moleculares.

Un método simple, pre-analítico para identificar las muestras hemolizadas plasma es la medida espectrofotométrica a longitud de onda (λ) = 414 nm la absorbancia del pico principal de la oxihemoglobina, después del ajuste apropiado de cualquier otra fuente de interferencia. Por esa razón, hemos normalizado el pico nm 414 en el valor de absorbancia en 375 nm, indicativo del contenido lipídico33. Como alternativa, o mejor, en combinación, una lipemia independenthemolysis puntuación (HS) puede ser utilizado34. Este procedimiento espectrofotométrico basado puede identificar por lo menos 6,1 mg/dL de hemoglobina libre. De lo contrario, muestras hemolizadas pueden identificarse a través de la detección de miRNAs específicos del eritrocito. Ya que incluso un porcentaje muy bajo de la hemólisis puede provocar un aumento considerable de niveles específicos de eritrocito miRNA32, Fortunato et al. identifica una firma específica relacionada con la hemólisis basada en 16 ratios de miRNAs que pueden eficazmente clasificación de hemólisis en las muestras de plasma33. Todos los ensayos mencionados pueden utilizarse en combinación desde la relación de absorbancias 414/375 y el capítulo se adopta en una fase pre-analítica ahorrar costos adicionales, mientras que los miRNAs relacionados con hemólisis de medición puede ser utilizado en una fase post analítica como un control de calidad paso.

Circulación de miRNAs aislamiento y pureza del ARN
El procedimiento de RNA la extracción es un paso muy influyente para el éxito de los análisis posteriores. A partir de una muestra de entrada baja, tales como plasma, la extracción debe ser tan eficiente como sea posible para garantizar una cuantificación exacta de miRNAs. Plasma se caracteriza por altas concentraciones de muchas proteínas, incluyendo las nucleasas y otros componentes que pueden interferir en posteriores reacciones enzimáticas de RT-qPCR y podrían afectar a la detección de miRNAs de circulación. Varios métodos de extracción han sido utilizados en este tipo de estudios, pero en general, extracción orgánica seguida de enriquecimiento RNA basados en sílice permite la eliminación de los inhibidores de la plasma mejor y luego sola TRIzol35. Sin embargo, en los últimos años, la extracción manual se ha sustituido por extracción automatizada. El menor riesgo de contaminación, la mayor reproducibilidad y el uso de tiempo económico son las principales ventajas de los sistemas automatizados en comparación a los protocolos de aislamiento manual. Por otra parte, los métodos de extracción automatizado rindieron las cantidades más altas de miRNA de muestras de sangre y la mayor eficiencia en comparación con protocolos manual36.

Cuestión de la normalización
Normalización de los niveles de miRNA de plasma sigue siendo una cuestión controvertida. De hecho, las diferencias en la calidad de la muestra o la cantidad pueden interferir con la identificación de verdaderos cambios en los niveles de expresión de miRNAs causados por la presencia o riesgo de enfermedades, llevando a interpretaciones de datos ambiguos y engañosos conclusiones. Hasta ahora, la falta de consenso ha generado diversas estrategias de normalización37.

ARN total extraído de las muestras de plasma está generalmente por debajo del umbral de los métodos de cuantificación estándar como espectrofotometría basada en fluorescencia, espectrofotometría UV así que RNA total normalización38. Por lo tanto, debe elegirse un volumen fijo en lugar de una cantidad fija de RNA eluída como entrada para la reacción de RT39.

Limpieza las transcripciones que se utiliza para el análisis de miRNA en muestras de tejido, como RNU48 y RNU6, no son adecuados para normalizar medidas miRNA extracelular, como los dos no siempre son detectables en la circulación, debido a la degradación mediada por la Rnasa40, y también están desregulados en una forma específica de la enfermedad37. No está claro si cualquier circulación miRNAs efectivamente podrían ser utilizados como controles de referencia. Por ejemplo, miR-16 se propone con frecuencia para la limpieza, pero ddiferentes estudios han demostrado que está desregulada en muestras de plasma de pacientes de cáncer28,37. Además, miR-16 niveles son altamente afectados por hemólisis30.

Mientras que para los ensayos de alto rendimiento medición varios miRNAs y normalizar el valor de la expresión media es generalmente aceptados41, cuando un número limitado de miRNAs debe ser analizados, no se puede aplicar este enfoque de normalización. Con el fin de eludir la cuestión de la normalización, Boeri et al establecido previamente un algoritmo basado en relaciones recíprocas entre los miRNAs 2428. Este enfoque, a pesar de ser muy útil para el desarrollo de la herramienta de diagnóstico, no permite fácilmente distinguir efectivamente alterado miRNAs que posiblemente teniendo un papel en el desarrollo del tumor y así identificar miRNAs como calibradores de funcionamiento. Otra estrategia eficaz, aprobado por el grupo de Bianchi et al. que desarrolló un suero miR-Test para detección temprana del cáncer de pulmón, fue basado en la normalización de la media geométrica de un grupo de 6 "limpieza suero-miRNAs" varían menos entre las muestras y clases de pacientes42.

Características de miRNA biopsia líquida y potencial aplicación
MSC basada en plasma es una prueba no invasiva molecular estudiada para el diagnóstico precoz del cáncer de pulmón en fumadores. La prueba MSC puede identificar a sujetos intermedios o de alto riesgo ante la detección de cáncer de pulmón por LDCT, con alta sensibilidad (SE, 87%) y valor predictivo negativo (VPN, 99%). Específicamente, MSC podría implementar investigación LDCT reduciendo resultados false-positive a 3,7%, de 19,7% para LDCT solo29. La prueba MSC también ha demostrado que tienen un buen pronóstico cuando se considera el único pulmón pacientes con cáncer y podría ser utilizado como una herramienta de monitoreo solo o en combinación con otros parámetros clínicos patológicos43,44. Potencialmente, la prueba de maestría podría permitir una mayor coherencia de algoritmos diagnósticos de cáncer del pulmón, disminuyendo la rentabilidad del cribado.

Además de MSC, se han reportado otras pruebas no invasivas para la detección temprana del cáncer de pulmón. Bianchi et al. propuesto una prueba miR circulación basado en 34 miRNA firma45, luego reducido a una firma de 13 miRNA42. Se obtuvieron muestras de suero fordiscovery y validación de la continua observación de fumar temas (COSMOS) LDCT investigación ensayo, realizado en la institución europea de Oncología (IEO, Milán, Italia). La prueba del miR demostró precisión de 78% para la detección de cáncer de pulmón en voluntarios de alto riesgo. Entre el suero-13 miRNAs y el 24 que componen el MSC, miRNAs sólo 5 fueron superpuestas (miR-92a, miR-30b, miR - 30c, miR-148a y miR-140-5 p). Esto pudo deberse a los distintos tipos de a partir de las muestras (suero y plasma) y elaboración de datos. De hecho, para la prueba miR, autores seleccionados miRNAs de 6 comportándose como limpieza en suero, de las cuales 3 se incluyeron también entre los cocientes de miRNA MSC (miR-15b, 19b miR y miR-197). Sin embargo, el MSC en el plasma y el miR-Test en las muestras de suero más profundamente validan el uso de biopsia líquida base de miRNA para detección de cáncer de pulmón.

MiRNAs de perfiles para la identificación de biomarcadores de cáncer de pulmón se ha realizado también en muestras de esputo46. Esputo se puede recoger fácilmente y los niveles de expresión de miRNA parecen ser extremadamente estable en él. Sin embargo, los voluntarios de detección de cáncer de pulmón son mayores de 50-55 años y son grandes fumadores con comorbilidades tales como EPOC, haciendo difícil obtener esputo. De hecho, entre los diferentes líquidos corporales, el plasma es una de las mejores alternativas para investigar el papel potencial de miRNAs como (sin limitarse a) biomarcadores de cáncer de pulmón.

En general, el procedimiento descrito en el presente documento puede ser relevante en el contexto de varias enfermedades, con ninguna restricción en el tipo de la patología investigada (desde cáncer, sistema nervioso y trastornos cardiovasculares o diabetes) y en el propósito de uso clínico (un biomarcador para el diagnóstico, pronóstico o respuesta uniforme al tratamiento).

Divulgaciones

Gabriella Sozzi, Mattia Boeri y Ugo Pastorino son inventores Co de tres patentes bajo licenciados a Gensignia Life Sciences, con respecto a la firma de miRNA divulgada en este artículo. Todos los autores restantes no declaran conflictos de intereses en relación con la obra presentada.

Agradecimientos

Los autores agradecen Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca, y Chiara Banfi para el manejo de voluntarios en los ensayos y de asistencia administrativa; y Claudio Jacomelli y Claudio Citterio para gestión de datos. El trabajo fue apoyado por la Asociación italiana para la investigación del cáncer [becas de investigador Nº 15928 arriba, 14318 GS y 12162 (programa especial de "Herramientas innovadoras para la evaluación del riesgo de cáncer y el diagnóstico precoz", 5 x 1000)]; el Ministerio italiano de salud [Grant no. RF-2010]; Conceder UO1 CA166905 del Instituto Nacional del cáncer (Estados Unidos). MB fue apoyado por una beca de Fundación Pezcoller.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
 1x PBS LonzaBE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0Molecular probeT11493Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit PromegaAS1460The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool Thermo Fisher4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X Thermo Fisher4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool Thermo Fisher4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x Thermo Fisher4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards Thermo Fisher4449137Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set Becton Dickinson367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube. Becton Dickinson366643Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro VWR/PBI 643-0326Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS SpectrophotometerThermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml Sigma-AldrichZ359033
Centrifuge 5810R EppendorfBring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ CentrifugeThermo FisherD-37520
Vortex MixerVelp ScientificaF202A0173
ThermoMixer T- shakerEuroclone A00564Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC InstrumentPromegaAS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software Thermo Fisher
Arrey Card Staker/SealerThermo Fisher4331770

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