Un protocolo eficiente y Reproducible para la osteogénesis de la distracción en un modelo de rata a un fémur regenerado funcional

Resumen

Este estudio describe un protocolo reproducible y detallado usando un fijador externo desarrollado recientemente para la osteogénesis de la distracción () en una rata femoral modelo que permisos fisiológica portantes por el animal después del retiro del fijador externo.

Resumen

Este protocolo describe el uso de un fijador externo desarrollado recientemente para la osteogénesis de la distracción en un modelo femoral de la rata. Distracción osteogénica (DO) es una técnica quirúrgica para la regeneración después de una osteotomía del hueso. Las extremidades osteotomized se mueven lejos de uno a por distracción gradual para alcanzar la elongación deseada. Este procedimiento es ampliamente utilizado en los seres humanos para miembro superior e inferior, alargamiento, tratamiento después de un hueso no sindical, o la regeneración de un defecto del hueso después de la cirugía para extirpación de tumor de hueso, así como en la reconstrucción maxilofacial. Sólo unos pocos estudios demuestran claramente la eficacia de su protocolo en la obtención de un funcional del hueso regenerado, es decir, hueso que carga fisiológica sin fractura después del retiro del fijador externo. Además, protocolos para variar y reproducibilidad es limitada por falta de información, comparación entre los estudios difíciles. El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo reproducible que comprende un diseño adecuado de fijador externo para rata miembro alargamiento, con una técnica quirúrgica detallada que permite carga fisiológica por el animal después del retiro de la externa fixator.

Introducción

Distracción osteogénica (DO) es que una técnica quirúrgica ampliamente utilizado clínicamente^1,2,3,4 en humanos de^1,inferior² y superior³ alargamiento de extremidades, tratamiento después de un hueso no sindical, o la regeneración de un defecto del hueso después de la cirugía para la supresión del tumor del hueso, así como en reconstrucción maxilofacial⁴. NO conduce a la regeneración del hueso después de la colocación de un fijador externo en hueso y osteotomía. Las extremidades osteotomized se mueven lejos de uno a por distracción gradual² para alcanzar la elongación deseada. Sigue un período de consolidación, durante el cual no hay más elongación.

El procedimiento de hacer se divide en tres fases: latencia, distracción y consolidación. Por lo general, un período de latencia 7 días comienza justo después de la osteotomía⁴. Esto permite la reparación ósea comenzar el paso inicial de la curación del proceso⁴. El período de latencia es seguido por un periodo de distracción donde las fuerzas de tracción se aplican a los callos regenerados y los tejidos blandos circundantes^1,de^2,4. Una vez alcanzada la elongación deseada, se detiene la distracción y el período de consolidación comienza. Durante este período, el fijador externo se mantiene hasta que el hueso regenerado es funcional para apoyar su retirada.

Varios parámetros de influir en la reparación de hueso tales como longitud y la tasa de alargamiento, tipo de fijador externo, frecuencia de distracción, la duración del período de consolidación, o tipo de estrés mecánico aplicado al callo distraído. Por ejemplo, la tasa y frecuencia de alargamiento pueden conducir a consolidación prematura⁵ o interrupción del proceso creando daños irrecuperables como tejido necrótico o quistes dentro del callo^6,7.

Muchos protocolos han sido aplicadas a diferentes modelos animales^8,9,10 para estudiar procesos de reparación del hueso y para maximizar la consolidación ósea. En ratas, la mayoría estudios^{11,12,13,14,15} se centró en Cómo acortar el Protocolo por acelerar el callo de consolidación. Algunos de estos estudios experimentales utilizan Fijadores externos ya comercialmente disponibles para aplicaciones clínicas humanas^5,13,15,16. Sin embargo, estos tipos de fijador externo no son adecuados para hacer en el fémur de la rata, que exhibe diversas características anatómicas del fémur humano. Por otra parte, sólo unos pocos estudios demuestran claramente la eficacia de los protocolos en la obtención de un hueso regenerado funcional^7,16. Por lo tanto es difícil comparar los resultados de varios estudios, debido a sus diferentes protocolos y la falta de información sobre el fijador externo^12,13,14,17.

Así, el objetivo de este estudio fue describir en un modelo de rata, un protocolo eficiente y reproducible para el DO en el fémur que conduce a un funcional del hueso regenerado. Para ello, hemos diseñado un fixator externo casero y fácil de utilizar especialmente para el fémur de la rata, que hemos descrito en detalle en el presente Protocolo. En la redacción de las especificaciones técnicas de este dispositivo, se tomaron en cuenta todas las limitaciones fundamentales para una buena distribución de tensiones mecánicas, evitando la producción de tensión residual. Las especificaciones técnicas incluyen una geometría adecuada para el dispositivo permitir la tracción pura en los huesos y el tejido circundante, un peso adecuado para la marcha del animal, control de la longitud de alargamiento de hueso y una buena alineación de los segmentos de hueso sin producción de tensión de esquileo en la intersección de los pernos y el hueso. Además, este dispositivo tenía que ser utilizable sin sedación del animal durante la distracción, biocompatible y esterilizable sin daño. Después de 7 semanas de consolidación, este protocolo para en el fémur de rata condujo a un hueso regenerado funcional, demostrado por carga fisiológica los animales sin fractura del callo regenerado después del retiro del fijador externo. La marcha fisiológica de los animales era constante con parámetros arquitectónicos obtenidos de análisis de micro-CT de callos regenerados y rayos x.

Protocolo

todos los procedimientos descritos fueron aprobados por la Universidad de Aix-Marseille institucional animal uso y cuidado Comité y el Ministerio francés de investigación y realizados en la casa de animales convencional de (Facultad de medicina de Marsella Francia).

1. definir las especificaciones funcionales del fijador externo en las siguientes guías

1. anclaje de hueso optimizar.
   1. Implante pernos de media rosca de 1 mm de diámetro (de la sección roscada).
2. Elegir un diseño para reducir las molestias para el animal.
   1. Elegir un fijador externo de un tamaño pequeño que cabe en un volumen de 7.723 mm ³ (32 x 19 x 12,7 mm).
   2. Elegir un fijador externo con bajo peso, menos de 13 g sin las clavijas, para evitar molestar a los animales ' marcha. Elegir el aluminio como material para los dos bloques debido a su baja densidad.
      Nota: Los chaflanes de los bloques disminuyen considerablemente el peso de las dos partes.
3. Controlar el movimiento del fixator tal que la dirección de la fuerza de tracción se mantiene paralela a la dirección del hueso y asegurar las fuerzas de tracción puras.
   1. Uso un deslizamiento de la barra pasa por los dos bloques. Surco y abrir los bloques por lo que cada uno puede llevar pasadores.
   2. Utilizar un tornillo de alargamiento con una cara lisa que gira libremente en el bloque y puede ser agarrado con los dedos y con una parte roscada que desplaza el segundo bloque de rotación. Fijar pasadores al hueso, a cada lado de la fractura, para mantener la dirección de la fuerza de tracción paralela a la dirección del hueso. Mantener las fuerzas de tracción en el eje longitudinal para permitir la buena distribución de la tensión en los pernos. Asegure las cuatro clavijas con tornillos de seguridad.
4. Elegir materiales como aluminio, titanio y acero que puede resistir temperaturas de esterilización.
5. Garantizar que la colocación del perno corresponde a la geometría del fijador externo ( figura 1 -B).
   1. Use una perforación guía que contiene una abrazadera apretada en el hueso para mantener la posición de perforación.
   2. Acortar el brazo de palanca de la abrazadera de baja fuerza de sujeción. Coloque la abrazadera en el centro del dispositivo, por encima de la fractura futura, para borrar las partes.
6. Hacer la distracción fácil manual de ajustar mediante la adición de un tornillo moleteado para apretar y soltar el bloque móvil.
   1. Usar un tornillo lo suficientemente amplio como para manipular con los dedos solo.
   2. Añadir una tuerca cuadrada perforado en medio de los tornillos de alargamiento entre los dos bloques, para permitir la fácil distracción.
   3. Hacer esta tuerca cuadrada (8 mm a cada lado) más grande que los dos bloques para permitir el uso manual con un alfiler fino o cualquier tipo de objeto. Gire el tornillo de ¼ de vuelta para permitir un alargamiento de 0,125 mm.

2. Cirugía

Nota: un asistente es necesario para todos los procedimientos quirúrgicos. Cuatro 12 semanas de edad ratas Sprague Dawley machos fueron alimentadas con una dieta estándar de laboratorio del ad libitum.

1. Preparar herramientas quirúrgicas.
   1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos siguientes: 1 rugine, Senn 2 ' retractores de s, 1 micro Olsen-Hegar-sostenedor de la aguja, 1 portaagujas Mayo-Hegar, tijera mayo 1 y 1 bisturí.
   2. Esterilizar el fijador externo, la guía de barrenado, 4 pernos de rosca por la mitad, 4 tornillos, la punta y la cadena del taladro y la punta y la cuerda del piezotome. Esterilice en autoclave a 135 ° C durante 18 minutos los estos instrumentos
   3. Instalar una almohada debajo del campo estéril, en la mesa quirúrgica. Coloque todos los instrumentos o herramientas en un campo estéril otro.
2. Anesthetize y preparar a los animales.
   1. Pesa la rata para preparar la anestesia y la mezcla analgésica
   2. determinar y calcular la cantidad de Bupremorphine y Carprofen para preparar la mezcla analgésica espontáneamente. Utilizar buprenorfina (0,03 mg/mL) y carprofeno (5 mg/mL) respectivamente en 0,05 mg/kg y 5 mg/kg.
   3. Refrenar la rata y por vía subcutánea inyectar la mezcla analgésica. espere unos segundos, y luego inyectar por vía intraperitoneal la mezcla anestésica.
   4. Afeitar las extremidades derecha con una afeitadora eléctrica y desinfectar la extremidad con solución de povidona-yodo.
   5. Poner el animal lateralmente (lado derecho hacia arriba) en el campo estéril para permitir la correcta posición del fijador externo en el eje mediolateral.
   6. Poner una compresa estéril en su cabeza para proteger sus ojos durante la cirugía.
3. Implantar el fijador externo en fémur.
   1. Punto de referencia la incisión en la piel. Con un marcador, dibuje un punto de la parte distal (rodilla) y un segundo punto en la parte proximal (cadera) siguiendo la línea media en el plano sagital. Luego trace una línea entre estos 2 puntos.
   2. Incidir la piel se extendía a lo largo de la línea de dibuja usando un bisturí.
   3. Corte entre el bíceps femoral y vasto lateral hasta que el fémur está totalmente expuesto, con la ayuda de un bisturí. Uso los 2 Senn ' retractores de s (pueden requerir un asistente) para facilitar la incisión muscular.
   4. Levantar el periostio y desconectar el tejido blando del hueso con la ayuda de un rugine.
   5. Compruebe que el fémur expuesto es suficiente.
      1. Inserte las clavijas en agujeros más proximales y distales de fixator externo.
      2. Colocar el fijador externo y compruebe que los pines pueden ser anclados en el fémur.
   6. 4 implantes paralelos pernos de media rosca de 1 mm en el fémur.
      1. Tomar la guía de barrenado y aparte mover los músculos con 2 Senn ' retractores de s. Apriete la abrazadera de la guía de perforación en el fémur.
      2. Taladro 4 agujeros previamente en el fémur. Utilizando un taladro eléctrico, perforar a una velocidad de 2.000 rpm al pasar una broca de metal de 0,6 mm de diámetro a través de los orificios de 4 guía. Agujeros
         1. Inicio con el más proximal y distal y acabado con los dos medio de la guía. Tenga cuidado al ir a través de ambas cortezas pero no a dañar los tejidos blandos debajo del fémur.
      3. Despegar de la guía de barrenado.
      4. Agrande los pre-orificios 4 con perno de rosca media de 0,8 mm.
         1. Trabajo el perno hacia adelante y hacia atrás a través de 0,6 mm agujeros. Tenga cuidado de que permanezca perpendicular al fémur y al fregadero a través de ambas cortezas.
      5. Pernos de media rosca de 1 mm del implante.
         1. Agarrar la cabeza del perno de rosca medio 1 mm con un sostenedor de la aguja.
         2. Fregadero de la clavija para agrandar el agujero antes. Compruebe que los pernos penetran ambas cortezas y no sobresalgan más de 1 mm, con un Senn ' retractor s.
      6. Conectarse el fixator del external de los 4 pernos de media rosca. Asegúrese de que el desplazamiento (distancia entre el fixator ' s dos bloques y la superficie del hueso) es aproximadamente de 6 mm permitir la fácil puntadas y buena rigidez del sistema ¹⁸.
      7. Seguro los 4 tornillos de fijación para que el fijador externo está bloqueado a los pins de.
4. Osteotomize fémur.
   1. Realizar una osteotomía entre los 2 pines centrales con un piezotome.
   2. Cerrar el woy con una puntada continua con un hilo de sutura reabsorbible (5.0) y portaagujas Mayo-Hegar. Asegúrese de que sólo la piel se sutura y no los músculos.
5. Verificar las cirugía y monitor animales.
   1. Realizar una radiografía sólo después de la cirugía, mientras que el animal todavía está anestesiado. Verificar la profundidad de todos los pernos y las extremidades osteotomized alineadas siguiendo el eje largo.
   2. Asegúrese de que la analgesia y antibioprophylaxy por la inyección subcutánea de buprenorfina (0,03 mg/mL) y enrofloxacina (50 mg/mL) respectivamente en 0,05 mg/kg y 10 mg/kg.
   3. Determinar y calcular la cantidad de antipamezole para revertir la anestesia. Tenga antipamezole a 1mg/kg y una inyección subcutánea para administrar el producto. Permitir que el animal recuperar la conciencia y regresar a su jaula.
   4. Seis horas después de la cirugía, inyectar una segunda dosis de la mezcla de analgesia (buprenorfina y Carprofen) respectivamente en 0,05 mg/kg y 5 mg/kg por vía subcutánea.
      Para los próximos 3 días por lo menos, dan estas inyecciones dos veces al día para la mezcla de analgesia y una vez al día para la antibioprophylaxy. Exámenes clínicos regulares deben realizarse para evaluar la efectividad de la analgesia y deben ser modificados según los signos de comportamiento de cada animal.
   5. Compruebe que los animales pueden caminar utilizando sus extremidades funcionado normalmente en el día después de la cirugía.

3. Distracción

1. deja el fixator del external neutral fijación para 1 semana. Rayos x, el miembro al final de esta fase. Compruebe la posición de los pernos y la alineación de los segmentos de hueso.
2. Manual gire la tuerca cuadrada media vuelta (0,25 mm) cada 12 h para llevar a cabo la distracción. Distraer durante 10 días, que debe conducir a una prolongación de hueso de 5mm, que representan un 12% alargamiento en relación a la longitud inicial del segmento de hueso operado.
   1. No anestesiar el animal durante esta etapa. El miembro medio camino a través y al final de este periodo para comprobar la posición de los pernos y alineación de los segmentos de hueso de rayos x.
3. Mantener el fijador externo de 47 días. Rayos x la extremidad cada semana para comprobar el progreso de la calcificación de brecha distraído. En día 64, retirar el fijador externo y dejar que el animal a pie libremente por 2 días más (66 días). El período de consolidación total dura 7 semanas.
4. Eutanasia todas las ratas después de 7 semanas de consolidación con una sobredosis de inhalado sevoflurane.
5. Resección fémur distraído y contralateral sin los tejidos circundantes.
   1. Hacer una incisión en la piel de la cicatriz ubicada en la línea media el plano sagital con la ayuda de un bisturí. Ejecutar la incisión desde la parte superior de la cadera al frente de la rodilla.
   2. Corte entre el bíceps femoral y vasto lateral con un bisturí hasta que el fémur quede completamente expuesto. Tanto como sea posible, desconecte el músculo atado hueso.
   3. Corte todos los ligamentos de la rodilla y desmontar la articulación.
   4. Cortar la cápsula de la articulación de la cadera.
   5. Limpiar el hueso sin quitar los pasadores de rosca por la mitad. Eliminar todo el tejido blando con un bisturí.
6. El fémur contralateral Repita los pasos de 3.5.1 a 3.5.5.
7. Radiografía de fémur distraído y contralateral. Retire los 4 pernos de media rosca y almacenar todos los fémures a-20 ° C para el análisis micro-CT scan (resolución de 10 μm).

Resultados

Las imágenes de rayos x tomadas desde el final del procedimiento quirúrgico hasta el final de la consolidación no demostraron ningún aflojamiento de los pernos de rosca por la mitad en el fémur, indicando el anclaje estable. Los pasadores eran paralelos y bien conservado. Las extremidades osteotomized estaban bien alineadas a lo largo del eje longitudinal del hueso durante el proceso de (figura 2). Al final del período de latencia, áreas calcificadas n...

Discusión

Este estudio describe un protocolo reproducible que comprende un diseño adecuado de fijador externo para rata miembro alargamiento, con una técnica quirúrgica detallada que permite carga fisiológica por el animal después del retiro del fijador externo. Nuestro protocolo condujo a un funcional del hueso regenerado. Después de 47 días de consolidación, retiro del fijador externo casero de 2 días de carga fisiológica por el animal no indujo cualquier fractura del regeneración del callo. Gracias a la reconstrucci?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kétamine	Renaudin	578 540-2	Supply by animal house
Médétomidine	Virbac	6799091	Supply by animal house
Sevoflurane	Centravet	567 477-2	Supply by animal house
Buprenorphine	Indivor France	3400932731060	Supply by animal house
Enrofloxacine	ChannelPharmaceutical Facturing	FR/V/4955220	Supply by animal house
Piezotome	Satelec Acteon	F57510
Heating pet pad	Therasage	AL8365936	Supply by the animal house
Dental X-ray	S.A.R.L Innovation médicales et dentaires	WYZ - BLUEX
Winiwix Software	Softys Dental	PFT
Micro-CT system	nanoScan SPECT/CT	GEIT-31105EN (05/14)	Subcontract by IVTV central Lyon
Micro-CT analysis Software	phoenix datos X2 reconstruction	none	Free software
Electric razor	Brawn	GT415	Supply by animal house
Senn’s retractors	Word Precision Instruments	501718	Blunt version
Betadine Solution	Mundipharma Medical Company	D08AG02	Supply by animal house
Resorbable suture thread (5.0)	Ethicon	JV1023	Supply by animal house
Rugine	Word Precision Instruments	503406
Mayo-Hegar needle holder	Word Precision Instruments	V503382
Metal drill	Beuterlock	V020944018003
Micro Olsen-Hegar Needle-holder	Word Precision Instruments	501989
Mayo scissor	Word Precision Instruments	501752
Scalpel	Word Precision Instruments	500236
Sprague-Dawley	Janvier	none	12 weaks and male