Un protocole efficace et reproductible pour Distraction ostéogénèse dans un modèle de Rat conduisant à un fémur régénéré fonctionnel

Résumé

Cette étude décrit un protocole reproductible et détaillé à l’aide un fixateur externe nouvellement mis au point pour l’ostéogenèse distraction (DO), chez un rat fémorale, modèle qui autorise physiologiques supportant le poids de l’animal après l’ablation du fixateur externe.

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation d’un fixateur externe nouvellement mis au point pour l’ostéogenèse distraction dans un modèle de rat fémorale. Ostéogenèse distraction (DO) est une technique chirurgicale permettant la régénération après une ostéotomie osseuse. Les extrémités osteotomized sont déplacées de l’autre par distraction progressive pour atteindre l’allongement souhaité. Cette procédure est largement utilisée chez l’homme pour le membre inférieur et supérieur, allongeant, traitement après un os non syndiqué, ou la régénération d’un défect osseux suite à une chirurgie pour excision tumeur osseuse, ainsi que dans la reconstruction maxillo-faciale. Seules quelques études démontrent clairement l’efficacité de leur protocole à obtenir un OS régénéré fonctionnelle, c'est-à-dire, OS qui soutiendra portantes physiologique sans fracture après l’ablation du fixateur externe. En outre, les protocoles pour varier et reproductibilité est limitée par le manque d’information, en faisant la comparaison entre les études difficiles. Le but de cette étude était d’élaborer un protocole reproductible comprenant une conception appropriée de fixateur externe pour rat allongement de membre, avec une technique chirurgicale détaillée qui permet physiologique supportant le poids de l’animal après l’ablation de l’externe fixateur.

Introduction

Ostéogenèse distraction (DO) est qu'une technique chirurgicale utilisée cliniquement^1,2,3,4 chez les humains pour basse^1,2 et allongement de membre supérieur³ , traitement après un os non syndiqué, ou la régénération d’un défect osseux suite à une chirurgie pour excision tumeur osseuse ainsi que dans la reconstruction maxillo-faciale⁴. NE mène à la régénération osseuse après mise en place d’un fixateur externe dans l’os et l’ostéotomie. Les extrémités osteotomized sont déplacées de l’autre par distraction progressive² pour atteindre l’allongement souhaité. S’ensuit une période de consolidation, au cours de laquelle il n’y a aucune élongation plus.

La procédure est divisée en trois phases distinctes : latence, distraction et consolidation. Généralement, une période de latence de 7 jours commence juste après ostéotomie⁴. Cela permet de commencer l’étape initiale du processus guérison⁴la réparation osseuse. La période de latence est suivie d’une période de distraction où les forces de traction sont appliqués aux cals régénérée et entourant les tissus mous^1,2,4. Lorsque l’allongement souhaité est atteint, arrêts de la distraction et la période de codification commence. Durant cette période, le fixateur externe est maintenue jusqu'à ce que l’OS régénéré est assez fonctionnel pour appuyer son retrait.

Divers paramètres d’influencent-elles la réparation osseuse comme longueur et taux d’allongement, type de fixateur externe, fréquence de distraction, de la longueur de la période de consolidation, ou le type de stress mécanique appliqué à la Cal distrait. À titre d’exemple, le taux et la fréquence du rallongement peuvent conduire à consolidation prématurée⁵ ou perturbation du processus en créant des dommages non récupérable comme les tissus nécrosés ou kystes au sein du cal^6,7.

Beaucoup protocoles ont été appliqués à différents modèles animaux^8,9,10 pour étudier les processus de réparation osseuse et à optimiser la consolidation osseuse. Chez le rat, la plupart des études^{11,12,13,14,15} axée sur comment raccourcir le protocole en accélérant les cals consolidation. Certaines de ces études expérimentales utilisées des fixateurs externes déjà commercialement disponibles pour des applications cliniques humaines^5,13,15,16. Toutefois, ces types de fixateur externe ne conviennent pas pour DO sur le fémur de rat, qui présente différentes caractéristiques anatomiques du fémur humain. En outre, seules quelques études démontrent clairement l’efficacité de leurs protocoles à obtenir un OS régénéré fonctionnelle^7,16. Il est donc difficile de comparer les résultats de diverses études, en raison de leurs différents protocoles et le manque d’information concernant le fixateur externe^12,13,14,17.

Ainsi, le but de cette étude était de décrire, dans un modèle de rat, un protocole efficace et reproductible pour DO sur le fémur qui mène à un OS fonctionnel régénéré. À cette fin, nous avons conçu un fixateur externe fait maison et facile à utiliser, surtout pour le fémur de rat, dont nous avons décrit en détail dans le présent protocole. Dans la rédaction de la fiche technique de ce dispositif, nous avons tenu compte de toutes les contraintes fondamentales pour une bonne répartition des contraintes mécaniques et d’éviter la production de contraintes résiduelles. La spécification technique inclus une géométrie appropriée pour le périphérique autorisant la force de traction pure sur les os et les tissus environnants, un poids approprié pour l’allure de l’animal, le contrôle de la longueur de l’allongement de l’os et un bon alignement des segments osseux sans production de contrainte de cisaillement à l’intersection de pins et d’os. En outre, ce dispositif devait être utilisable sans sédation de l’animal au cours de la distraction, biocompatible et stérilisable sans dommage. Après 7 semaines de consolidation, ce protocole pour DO sur le fémur de rat a conduit à un OS régénéré fonctionnel, démontré par portantes physiologique des animaux sans fracture du cal régénéré après l’ablation du fixateur externe. La démarche physiologique des animaux était conforme aux paramètres architecturaux obtenus à partir de l’analyse micro-CT de cals régénérée et analyse par rayons x.

Protocole

toutes les procédures décrites ont été approuvées par l’Université d’Aix-Marseille animaux soins et utilisation Commission institutionnelle et le ministère de la recherche Français et réalisées dans l’animalerie conventionnelle de faculté de médecine de Marseille ( France).

1. définir les spécifications fonctionnelles de la fixateur externe basé sur les lignes directrices suivantes

1. ancrage osseux Optimize.
   1. Implant moitié-threaded épingles munies de 1 mm de diamètre (de la partie filetée).
2. Choisir un design pour réduire l’inconfort pour l’animal.
   1. Choisir un fixateur externe de petite taille qui s’insère dans un volume de 7 723 mm ³ (32 x 19 x 12,7 mm).
   2. Choisir un fixateur externe à faible poids, moins de 13 g sans les tiges, pour ne pas perturber les animaux ' démarche. Choisissez l’aluminium comme matériau pour les deux blocs en raison de sa faible densité.
      Remarque : Les chanfreins des blocs de diminuent considérablement le poids des deux parties.
3. Contrôler le mouvement du fixateur, telle que la direction de la force de traction est maintenue parallèle à la direction de l’os et de s’assurer que les forces de traction pures.
   1. Utiliser un glissement bar qui passe par les deux blocs. Échancrure et ouvrir les blocs pour que chacun peut supporter deux goupilles.
   2. Utiliser la vis allongement avec un côté lisse qui tourne librement dans le bloc et peut être saisi par les doigts et avec un côté fileté qui déplace le deuxième bloc par rotation. Deux broches pour l’OS, de chaque côté de la fracture, de garder le sens de la force de traction parallèle à la direction de l’os de l’ancre. Maintenir les forces de traction dans l’axe longitudinal afin de permettre la bonne répartition des contraintes sur les broches. Fixez les quatre broches avec vis de blocage.
4. Choisir des matériaux comme l’aluminium, le titane et l’acier qui peut résister à des températures de stérilisation.
5. Veiller à ce que le placement de broche correspond à la géométrie de fixateur externe ( Figure 1 -B).
   1. Utiliser un guide de perçage qui contient une pince serrée sur l’OS pour maintenir la position perçage.
   2. Raccourcir le bras de levier de la pince pour faible force de serrage. Placer la bride au milieu de l’appareil, au-dessus de la future rupture, pour dégager les côtés.
6. Faire la distraction facile à manuel ajuster en ajoutant une vis moletée pour serrer et libérer le bloc mobile.
   1. Utiliser une vis assez large pour manipuler avec doigts seuls.
   2. Ajouter un écrou carré percé dans le milieu de la vis d’élongation entre les deux blocs, afin de permettre la simple distraction.
   3. Faire cet écrou carré (8 mm de chaque côté) plus grand que les deux blocs pour permettre une utilisation manuelle avec une épingle ou un type d’objet. Tourner la vis ¼ de tour pour permettre un allongement de 0,125 mm.

2. Chirurgie

Remarque : l’assistant est requis pour toutes les interventions chirurgicales. Quatre 12 semaines mâles Sprague Dawley recevaient une alimentation de laboratoire standard ad libitum.

1. Préparer les outils chirurgicaux.
   1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux suivants : 1 rugine, 2 Senn ' rétracteurs s, 1 micro Olsen-Hegar-porte-aiguille, 1 porte aiguille de Mayo-Hegar, 1 ciseaux de mayo et 1 scalpel.
   2. Stériliser le fixateur externe, le guide de perçage, 4 broches demi-threaded, 4 vis, la pointe et la chaîne de la perceuse et la pointe et la chaîne de la piezotome. Stérilisation de ces instruments à l’autoclave à 135 ° C pendant 18 min.
   3. Installer un coussin chauffant sous le champ stérile, sur la table d’opération chirurgicale. Placer tous les instruments ou outils sur un autre champ stérile.
2. Anesthésier et préparer l’animal.
   ,
   1. Peser le rat pour préparer l’anesthésique et le mélange analgésique
   2. déterminer et calculer le montant de Bupremorphine et carprofène pour préparer le mélange analgésique extemporanément. Utiliser la buprénorphine (0,03 mg/mL) et le carprofène (5 mg/mL) respectivement à 0,05 mg/kg et de 5 mg/kg
   3. Empêcher le rat par voie sous-cutanée injecter le mélange analgésique. Attendez quelques secondes, puis injecter par voie intrapéritonéale le mélange anesthésique.
   4. Raser le membre postérieur droit avec un rasoir électrique et désinfecter la branche avec la solution de povidone-iode.
   5. Jeter l’animal latéralement (à droite vers le haut) sur un champ stérile pour permettre le positionnement correct du fixateur externe le long de l’axe médiolatérale.
   6. Mettre une compresse stérile sur sa tête pour protéger ses yeux au cours de la chirurgie.
3. Implant le fixateur externe dans le fémur.
   1. Point de repère l’incision cutanée. Un marqueur, dessinez un point de la partie distale (genou) et un deuxième point dans la partie proximale (hanche) suivant la ligne médiane dans le plan sagittal. Puis tracez une ligne entre ces 2 points.
   2. Inciser la peau étirée le long de la ligne de dessin à l’aide d’un scalpel.
   3. Couper en entre le biceps femoris et le vastus lateralis jusqu'à ce que le fémur est totalement exposé, avec l’aide d’un scalpel. Utiliser les 2 Senn ' rétracteurs de s (peut nécessiter un assistant) afin de faciliter l’incision du muscle.
   4. Lever le périoste et débranchez les tissus mous de l’os à l’aide d’une rugine.
   5. Vérifier que le fémur exposé est assez long.
      1. Insérer les goupilles dans les trous les plus proximales et distales du fixateur externe.
      2. Positionnez le fixateur externe et vérifiez que les deux broches peuvent être ancrées dans le fémur.
   6. Implant 4 broches de 1 mm demi de threads dans le fémur en parallèle.
      1. Prendre le guide de perçage et s’éloignent les muscles avec 2 Senn ' rétracteurs de s. Serrer le collier du forage guide au milieu du fémur.
      2. Percer 4 trous préalablement dans le fémur. À l’aide d’une perceuse, percer des trous à une vitesse de 2 000 tr/min en passant un foret métal de 0,6 mm de diamètre à travers les trous de 4 guide. Trous
         1. start avec la plus proximale et distale et terminer par les deux du milieu ceux du guide. Veillez à passer par les deux cortex mais ne pas d’endommager les tissus mous juste en dessous du fémur.
      3. Enlever le guide de forage.
      4. Agrandir les trous pré 4 avec la broche filetée moitié de 0,8 mm.
         1. Travail la broche en arrière à travers le 0,6 mm trous. Veillez à rester perpendiculaire au fémur et évier à travers les deux cortex.
      5. Broches moitié-fileté de 1 mm de l’implant.
         1. Saisir la tête de la broche de moitié-fileté 1 mm avec un porte-aiguille.
         2. Couler le code pin pour agrandir le trou avant. Vérifiez que les broches pénètrent les deux cortex et ne dépassent pas de plus de 1 mm, avec un Senn ' rétracteur de s.
      6. Connecter le fixateur externe aux 4 broches demi-threaded. S’assurer que l’offset (distance entre le fixateur ' s deux blocs et la surface osseuse) est d’environ 6 mm pour permettre à des points de suture faciles et bonne rigidité du système ¹⁸.
      7. Fixer les 4 vis de blocage afin que le fixateur externe est verrouillé aux broches.
4. Osteotomize du fémur.
   1. Réaliser une ostéotomie entre les 2 goupilles centrales avec un piezotome.
   2. Fermer la wound en utilisant un point continu avec un fil de suture résorbable (5.0) et porte aiguille Mayo-Hegar. Assurez-vous que la peau est suturée et pas les muscles.
5. Vérifier les animaux chirurgie et moniteur.
   1. Effectuer une radiographie juste après la chirurgie, alors que l’animal est toujours anesthésié. Vérifier la profondeur de toutes les quilles et osteotomized extrémités alignées suivant l’axe long.
   2. S’assurer que l’analgésie et antibioprophylaxy par voie sous-cutanée de buprénorphine (0,03 mg/mL) et Enrofloxacine (50 mg/mL), respectivement à 0,05 mg/kg et 10 mg/kg.
   3. Déterminer et calculer le montant d’antipamezole pour inverser l’anesthésie. Utilisez antipamezole à 1mg/kg et faire une injection sous-cutanée pour administrer le produit. Laisser l’animal à reprendre conscience et remettez-le dans sa cage :.
   4. Six heures après la chirurgie, injecter une deuxième dose du mélange analgésie (buprénorphine et carprofène) respectivement à 0,05 mg/kg et de 5 mg/kg par voie sous-cutanée.
      Pour les prochains 3 jours au moins, donner ces injections deux fois par jour pour le mélange de l’analgésie et une fois par jour pour l’antibioprophylaxy. Les examens cliniques réguliers doivent être effectués pour évaluer l’efficacité de l’analgésie et doivent être modifiées selon les signes de comportement de chaque animal.
   5. Vérifier que les animaux peuvent marcher à l’aide de leurs membres postérieurs fonctionnant normalement le jour suivant la chirurgie.

3. Distraction

fixation

1. congé le fixateur externe au point mort pendant 1 semaine. Radiologique de la branche à la fin de cette phase. Vérifier le positionnement des broches et l’alignement des segments osseux.
2. Manuellement tourne l’écrou carré un demi-tour (0,25 mm) toutes les 12 h pour effectuer la distraction. Distraire pendant 10 jours, ce qui devrait conduire à un allongement de 5mm OS, ce qui représente 12 % allongement par rapport à la longueur initiale du segment osseux exploités.
   1. Ne pas anesthésier l’animal au cours de cette étape. La branche à mi-chemin à travers et à la fin de cette période pour vérifier le positionnement des broches et alignement des segments osseux de rayons x.
3. Maintenir le fixateur externe pendant 47 jours. Radiologique de la branche chaque semaine pour vérifier l’état d’avancement de la calcification de l’écart distrait. Sur 64 jours, retirez le fixateur externe et laisser l’animale marche librement pendant 2 jours (66 jours). La période de consolidation totale dure 7 semaines.
4. Euthanasier tous les rats après 7 semaines de consolidation avec un surdosage de sévoflurane inhalée.
5. Résection des fémurs distraits et controlatérales sans les tissus environnants.
   1. Faire une incision de la peau sur la cicatrice située sur la ligne médiane après le plan sagittal avec l’aide d’un scalpel. Exécutez l’incision du haut de la hanche vers l’avant du genou.
   2. Couper entre le biceps femoris et le vastus lateralis avec un scalpel, jusqu'à ce que le fémur est entièrement exposé. Autant que possible, débranchez les muscles attachés aux os.
   3. Couper tous les ligaments du genou et de démanteler l’articulation.
   4. Couper la capsule de l’articulation de la hanche.
   5. Nettoyer l’OS sans enlever les tiges de moitié-threaded. Enlever tous les tissus mous avec un scalpel.
6. Recommencez les opérations depuis 3.5.1 à 3.5.5 pour le fémur controlatéral.
7. Aux rayons x des fémurs distraits et controlatérales. Enlever les 4 tiges de moitié de threads et de stocker tous les fémurs à-20 ° C pour l’analyse micro-CT scan (résolution de 10 µm).

Résultats

Les radiographies prises depuis la fin de l’intervention chirurgicale à la fin de la consolidation a montré aucun relâchement des broches moitié de threads dans le fémur, indiquant d’ancrage stable. Les broches sont parallèles et bien conservé. Les extrémités osteotomized étaient bien alignées le long de l’axe longitudinal de l’os au cours du processus (Figure 2). À la fin de la période de latence, aucune des zones calcifiées n’étaien...

Discussion

Cette étude décrit un protocole reproductible comprenant une conception appropriée de fixateur externe pour rat allongement de membre, avec une technique chirurgicale détaillée qui permet physiologique supportant le poids de l’animal après l’ablation du fixateur externe. Notre protocole a conduit à un OS fonctionnel régénéré. Après 47 jours de consolidation, enlèvement du fixateur externe fait maison et 2 jours de poids-roulement physiologique de l’animal n’a pas induit de toute fracture du CAL en r?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kétamine	Renaudin	578 540-2	Supply by animal house
Médétomidine	Virbac	6799091	Supply by animal house
Sevoflurane	Centravet	567 477-2	Supply by animal house
Buprenorphine	Indivor France	3400932731060	Supply by animal house
Enrofloxacine	ChannelPharmaceutical Facturing	FR/V/4955220	Supply by animal house
Piezotome	Satelec Acteon	F57510
Heating pet pad	Therasage	AL8365936	Supply by the animal house
Dental X-ray	S.A.R.L Innovation médicales et dentaires	WYZ - BLUEX
Winiwix Software	Softys Dental	PFT
Micro-CT system	nanoScan SPECT/CT	GEIT-31105EN (05/14)	Subcontract by IVTV central Lyon
Micro-CT analysis Software	phoenix datos X2 reconstruction	none	Free software
Electric razor	Brawn	GT415	Supply by animal house
Senn’s retractors	Word Precision Instruments	501718	Blunt version
Betadine Solution	Mundipharma Medical Company	D08AG02	Supply by animal house
Resorbable suture thread (5.0)	Ethicon	JV1023	Supply by animal house
Rugine	Word Precision Instruments	503406
Mayo-Hegar needle holder	Word Precision Instruments	V503382
Metal drill	Beuterlock	V020944018003
Micro Olsen-Hegar Needle-holder	Word Precision Instruments	501989
Mayo scissor	Word Precision Instruments	501752
Scalpel	Word Precision Instruments	500236
Sprague-Dawley	Janvier	none	12 weaks and male