Un protocollo efficiente e riproducibile per osteogenesi di distrazione in un modello del ratto che conduce a un femore rigenerato funzionale

Riepilogo

Questo studio descrive un protocollo riproducibile e dettagliato usando un fixator esterno di nuova concezione per l'osteogenesi di distrazione () in un ratto femorale modello quali permessi fisiologico del peso-cuscinetto dall'animale dopo la rimozione del fissatore esterno.

Abstract

Questo protocollo descrive l'uso di un fixator esterno di nuova concezione per l'osteogenesi di distrazione in un modello femorale del ratto. L'osteogenesi di distrazione (DO) è una tecnica chirurgica che porta alla rigenerazione dopo un'osteotomia ossea. Le estremità osteotomized vengono spostate da altro tramite la distrazione graduale per raggiungere l'allungamento desiderato. Questa procedura è ampiamente usata in esseri umani per arto inferiore e superiore, allungamento, trattamento dopo un osso non sindacale, o la rigenerazione di un difetto dell'osso dopo la chirurgia per l'asportazione del tumore dell'osso, così come nella ricostruzione maxillo-facciale. Solo pochi studi dimostrano chiaramente l'efficienza del loro protocollo nell'ottenere un osso rigenerato funzionale, vale a dire, osso che fornirà il supporto fisiologico peso-cuscinetto senza frattura dopo rimozione del fissatore esterno. Inoltre, protocolli per variare e riproducibilità è limitata dalla mancanza di informazioni, rendendo il confronto tra studi difficili. Lo scopo di questo studio era di sviluppare un protocollo riproducibile che comprende un design appropriato fixator esterno per ratto allungamento degli arti, con una dettagliata tecnica chirurgica che consente fisiologico peso-cuscinetto dall'animale dopo rimozione dell'esterno fissatore.

Introduzione

L'osteogenesi di distrazione (DO) è che una tecnica chirurgica utilizzata clinicamente^1,2,3,4 in esseri umani per^{2 1,}inferiore e superiore³ allungamento degli arti, trattamento dopo un osso non sindacale, o la rigenerazione di un difetto dell'osso dopo la chirurgia per l'asportazione del tumore dell'osso così come nella ricostruzione maxillo-facciale⁴. FARE porta alla rigenerazione ossea dopo il posizionamento di un fixator esterno in osso e osteotomia. Le estremità osteotomized vicenda vengono allontanate da distrazione graduale² per raggiungere l'allungamento desiderato. Segue un periodo di consolidamento, durante il quale non c'è nessun allungamento più.

La procedura è divisa in tre fasi distinte: latenza, distrazione e consolidamento. In generale, un periodo di latenza di 7 giorni inizia solo dopo osteotomia⁴. Questo permette la riparazione dell'osso iniziare la fase iniziale di guarigione processo⁴. Il periodo di latenza è seguito da un periodo di distrazione dove le forze di trazione vengono applicate per il callo rigenerato e circostanti tessuti molli^1,2,4. Quando l'allungamento desiderato viene raggiunto, fermate di distrazione e il periodo di consolidamento comincia. Durante questo periodo, il fixator esterno viene mantenuto fino a quando l'osso rigenerato è abbastanza funzionale per sostenere la sua rimozione.

Vari parametri di influenzare la riparazione ossea come durata e tasso di allungamento, tipo di fixator esterno, frequenza di distrazione, la lunghezza del periodo di consolidamento, o del tipo di sollecitazione meccanica applicata al callo distratto. Ad esempio, la frequenza e la frequenza di allungamento può portare al consolidamento prematuro⁵ o perturbazione del processo creando danni irreversibili come tessuto necrotico o le cisti all'interno il callo^6,7.

Molti protocolli di sono state applicate a diversi modelli animali^8,9,10 per studiare i processi di riparazione dell'osso e per massimizzare la consolidazione ossea. Nei ratti, maggior parte dei studi^{11,12,13,14,15} focalizzata su come accorciare il protocollo accelerando il consolidamento del callo. Alcuni di questi studi sperimentali utilizzati fissatori esterni già commercialmente disponibili per applicazioni cliniche umane^5,13,15,16. Tuttavia, questi tipi di fixator esterno non sono adeguati per fare il femore di ratto, che esibisce caratteristiche anatomiche diverse dal femore umano. Inoltre, solo pochi studi dimostrano chiaramente l'efficienza dei loro protocolli nell'ottenere un osso rigenerato funzionale^7,16. Quindi è difficile confrontare i risultati di vari studi, grazie alla loro protocolli differenti e la mancanza di informazioni riguardo il fixator esterno^12,13,14,17.

Quindi, lo scopo di questo studio era di descrivere, in un modello del ratto, un protocollo efficiente e riproducibile per sul femore che conduce a un osso rigenerato funzionale. A tal fine, abbiamo progettato un fixator esterno fatti in casa e facile da usare soprattutto per il femore di ratto, che abbiamo descritto in dettaglio nel presente protocollo. Nella stesura di specifiche tecniche di questo dispositivo, abbiamo preso in considerazione tutti i vincoli fondamentali per una buona distribuzione delle sollecitazioni meccaniche ed evitando la produzione di tensioni residue. La specifica tecnica inclusa una geometria appropriata per il dispositivo consentire la forza di trazione pura su ossa e il tessuto circostante, un peso appropriato per l'andatura dell'animale, controllo della lunghezza di allungamento osseo e un buon allineamento dei segmenti ossei senza produzione di sollecitazione di taglio all'incrocio tra perni e osso. Inoltre, questo dispositivo doveva essere utilizzabile senza sedazione dell'animale durante la distrazione, biocompatibili e sterilizzabile senza danni. Dopo 7 settimane di consolidamento, questo protocollo per sul femore del ratto ha condotto ad un osso rigenerato funzionale, dimostrato da cuscinetto di peso fisiologico degli animali senza frattura del callo rigenerato dopo la rimozione del fissatore esterno. Il passo fisiologico degli animali era costante con parametri architettonici ottenuti da analisi micro-CT del callo osseo rigenerato e analisi ai raggi x.

Protocollo

tutte le procedure descritte sono state approvate dal Università di Aix-Marseille istituzionale animale cura e uso Comitato e il Ministero francese di ricerca e celebrate nella casa dell'animale convenzionale della facoltà di medicina di Marsiglia ( Francia).

1. definire le specifiche funzionali del Fixator esterno in base alle seguenti linee guida

1. ancoraggio osseo Optimize.
   1. Dell'impianto di perni filettati a metà con un diametro (di sezione filettata) di 1 mm.
2. Scegliere un disegno per ridurre il disagio per l'animale.
   1. Scegliere un fixator esterno di piccole dimensioni che si inserisce in un volume di 7.723 mm ³ (32 x 19 x 12,7 mm).
   2. Scegli un fixator esterno con basso peso, meno di 13 g senza il PIN, per evitare di disturbare gli animali ' andatura. Scegliere l'alluminio come materiale per i due blocchi a causa della sua bassa densità.
      Nota: Gli smussi dei blocchi di diminuiscono notevolmente il peso delle due parti.
3. Controllare il movimento del fissatore, tale che la direzione della forza di trazione viene mantenuta parallela alla direzione dell'osso e garantire le forze di trazione pure.
   1. Uso una barretta scorrevole che che passa attraverso i due blocchi. Scanalatura e aprire i blocchi così ognuno può sopportare due perni.
   2. Utilizzare una vite di allungamento con un lato liscio che giri liberamente nel blocco e può essere afferrato dalle dita e con un lato filettato che sposta il secondo blocco di rotazione. Ancora due pin per l'osso, su ciascun lato della frattura, per mantenere la direzione della forza di trazione parallela alla direzione dell'osso. Mantenere le forze di trazione nell'asse longitudinale per consentire la buona distribuzione delle sollecitazioni sui perni. Fissare i quattro piedini con viti di bloccaggio.
4. Scegliere materiali come alluminio, titanio e acciaio, che può sopportare temperature di sterilizzazione.
5. Garantire tale posizionamento pin corrisponde alla geometria di fixator esterno ( Figura 1 -B).
   1. Utilizzare una perforazione guida contenente una pinza serrata sull'osso per mantenere la posizione di foratura.
   2. Accorciare il braccio di leva del morsetto per bassa forza di serraggio. Posizionare il morsetto nel centro del dispositivo, sopra la frattura futura, per cancellare i lati.
6. Rendono la distrazione facile manuale regolare aggiungendo una vite a testa zigrinata per stringere e rilasciare il blocco mobile.
   1. Utilizzare una vite abbastanza larga per manipolare con le dita da sola.
   2. Aggiungere un dado quadrato forato al centro la vite di allungamento tra i due blocchi, per consentire la facile distrazione.
   3. Fare questo dado quadrato (8 mm su ciascun lato) più i due blocchi per consentire l'uso manuale con una penna sottile o qualsiasi tipo di oggetto. Ruotare la vite ¼ di giro per consentire un allungamento di 0,125 mm.

2. Chirurgia

Nota: un assistente è necessario per tutte le procedure chirurgiche. Quattro 12 settimana-vecchi ratti Sprague Dawley maschii sono stati alimentati una dieta di laboratorio standard ad libitum.

1. Preparare strumenti chirurgici.
   1. Sterilizzare tutto lo strumentario chirurgico seguente: 1 rugine, 2 Senn ' divaricatori s, 1 Olsen-Hegar ago-supporto micro, 1 porta-aghi Mayo-Hegar, 1 forbice mayo e 1 bisturi.
   2. Sterilizzare il fixator esterno, la Guida di foratura, 4 perni filettati a metà, 4 viti, la punta e la stringa di trapano e la punta e la stringa del piezotome. Questi strumenti di sterilizzare in autoclave a 135 ° C per un minimo di 18
   3. Installare un dissipatore di calore sotto il campo sterile, sul tavolo operatorio. Posizionare tutti gli atti o strumenti su un altro campo sterile.
2. Anesthetize e preparare l'animale.
   1. Pesare il ratto per preparare l'anestetico e la miscela analgesica
   2. determinare e calcolare la quantità di Bupremorphine e Carprofen per preparare la miscela analgesica estemporaneamente. Utilizzare la buprenorfina (0,03 mg/mL) e Carprofen (5 mg/mL) rispettivamente a 0,05 mg/kg e 5 mg/kg.
   3. Trattenere il ratto e sottocute iniettare la miscela analgesica. attendere alcuni secondi, quindi intraperitonealmente iniettare la miscela anestetica.
   4. Radere la destra dell'arto con un rasoio elettrico e disinfettare l'arto con soluzione povidone-iodio.
   5. Laici l'animale lateralmente (verso l'alto a destra) sul campo sterile per permettere il corretto posizionamento del fissatore esterno lungo l'asse mediolateral.
   6. Mettere un impacco sterile sulla sua testa per proteggere gli occhi durante la chirurgia.
3. Implant il fixator esterno nel femore.
   1. Punto di riferimento l'incisione cutanea. Con un pennarello, disegnare un punto dalla parte distale (ginocchio) e un secondo nella parte prossimale (anca) seguendo la linea mediana nel piano sagittale. Quindi tracciare una linea tra questi punti 2.
   2. Incise la pelle tesa lungo la linea di disegno usando un bisturi.
   3. Tagliare tra il bicipite femorale e lateralis vastus finché il femore è completamente esposto, con l'aiuto di un bisturi. Uso il 2 Senn ' retrattori di s (può richiedere un assistente) per facilitare l'incisione del muscolo.
   4. Sollevare il periostio e staccare i tessuti molli l'osso con l'aiuto di un rugine.
   5. Verifica che il femore esposto è abbastanza lungo.
      1. Inserire i perni nei fori più prossimali e distali del fissatore esterno.
      2. Il fixator esterno e verificare che entrambi i pin possono essere ancorati nel femore.
   6. Implant 4 perni filettati a metà di 1 mm nel femore in parallelo.
      1. Prendere la Guida di foratura e si allontanano i muscoli con 2 Senn ' divaricatori s. Stringere il morsetto della Guida foratura nel mezzo del femore.
      2. Trapano 4 pre-fori nel femore. Utilizzando un trapano elettrico, trapano fori ad una velocità di 2.000 giri/min passando una punta di metallo di diametro 0,6 mm attraverso i fori 4 Guida. Fori
         1. start con la più prossimale e distale e finire con le due metà quelli della guida. Fare attenzione a passare attraverso entrambe le cortecce, ma di non danneggiare i tessuti molli appena sotto il femore.
      3. Togliere la Guida di foratura.
      4. Ingrandire i 4 pre-fori con perno filettato a metà di 0,8 mm.
         1. Lavoro il pin avanti e indietro attraverso il 0,6 mm fori. Fare attenzione a rimanere perpendicolare al femore e lavandino attraverso entrambi cortecce.
      5. Implant perni filettati a metà 1 mm.
         1. Afferrare la testa del perno filettato a metà 1 mm con un porta-aghi.
         2. Lavello il pin per allargare il pre foro. Controllare che i perni penetrano entrambi cortecce e non sporgano più di 1 mm, con un Senn ' riavvolgitore s.
      6. Collegare il fixator esterno ai 4 perni filettati a metà. Assicurarsi che l'offset (distanza tra il fissatore ' s due isolati e la superficie dell'osso) è di circa 6 mm per consentire facili punti di sutura e buona rigidità del sistema ¹⁸.
      7. Fissare le 4 viti di bloccaggio in modo che il fixator esterno è bloccato ai pin.
4. Osteotomize femore.
   1. Eseguire un'osteotomia tra i 2 pin centrale con un piezotome.
   2. Chiudere il wound usando un continuo punto con un filo di sutura riassorbibile (5.0) e porta aghi Mayo-Hegar. Assicurarsi che solo la pelle è cucita e non i muscoli.
5. Verificare la chirurgia e monitor animali.
   1. Eseguire una radiografia solo dopo la chirurgia, mentre l'animale è ancora anestetizzato. Controllare la profondità di tutti i birilli e osteotomized estremità sono allineati seguendo l'asse lungo.
   2. Assicurarsi che l'analgesia e antibioprophylaxy per via sottocutanea di buprenorfina (0,03 mg/mL) ed Enrofloxacine (50 mg/mL) rispettivamente a 0,05 mg/kg e 10 mg/kg.
   3. Determinare e calcolare la quantità di antipamezole per invertire l'anestesia. Utilizzare antipamezole a 1mg/kg e fare un'iniezione sottocutanea per somministrare il prodotto. Permettere all'animale di ritrovare la coscienza e restituirlo alla sua gabbia.
   4. Sei ore dopo l'intervento chirurgico, iniettare una seconda dose della miscela l'analgesia (buprenorfina e Carprofen) rispettivamente a 0,05 mg/kg e 5 mg/kg per via sottocutanea.
      Per i prossimi 3 giorni almeno, dare queste iniezioni due volte al giorno per la miscela di analgesia e una volta al giorno per il antibioprophylaxy. Esami clinici periodici devono essere eseguiti per valutare l'efficacia dell'analgesia e devono essere modificati secondo le indicazioni di comportamento di ogni animale.
   5. Controllare che gli animali possono camminare usando loro dell'arto operato normalmente il giorno successivo alla chirurgia.

3. Distrazione

1. lasciare il fixator esterno in folle fissazione per 1 settimana. Raggi x dell'arto alla fine di questa fase. Verificare il posizionamento dei perni e l'allineamento dei segmenti ossei.
2. Attivare manualmente il dado quadrato mezzo giro (0,25 mm) in senso orario ogni 12 h per eseguire la distrazione. Distrarre per 10 giorni, che dovrebbe portare ad un allungamento osseo di 5mm, che rappresenta un 12% allungamento rispetto la lunghezza iniziale del segmento osseo azionato.
   1. Non anestetizzare l'animale durante questo passaggio. L'arto a metà strada attraverso e alla fine di questo periodo per verificare il posizionamento dei perni e allineamento dei segmenti ossei a raggi x.
3. Mantenere il fixator esterno 47 giorni. Raggi x dell'arto settimanale per verificare l'avanzamento della calcificazione divario distratto. Il giorno 64, rimuovere il fixator esterno e lasciare l'animale a piedi liberamente per 2 giorni (giorno 66). Il periodo di consolidamento totale dura 7 settimane.
4. Euthanize tutti i ratti dopo 7 settimane di consolidamento con una overdose di sevoflurano inalato.
5. Resecare distratti e controlaterali femori senza i tessuti circostanti.
   1. Fare un'incisione della pelle sulla cicatrice che si trovano sulla linea mediana seguendo il piano sagittale con l'aiuto di un bisturi. Eseguire l'incisione dalla parte superiore dell'anca alla parte anteriore del ginocchio.
   2. Taglio tra il bicipite femorale e lateralis vastus con un bisturi, fino a quando il femore è completamente esposto. Quanto più possibile, scollegare il muscolo attaccato all'osso.
   3. Tagliare i legamenti del ginocchio e l'articolazione di smantellare.
   4. Tagliare la capsula articolare dell'anca.
   5. Pulire accuratamente l'osso senza rimuovere i perni filettati a metà. Rimuovere tutti i tessuti molli con un bisturi.
6. Ripetere i passaggi da 3.5.1 a 3.5.5 per il femore controlaterale.
7. Raggi x femori distratti e controlaterali. Rimuovere i 4 perni filettati a metà e memorizzare tutti i femori a-20 ° C per l'analisi di micro-TAC (risoluzione 10 µm).

Risultati

Le radiografie prelevate dalla fine della procedura chirurgica per la fine di consolidamento ha mostrato nessun allentamento dei perni filettati a metà nel femore, che indica di ancoraggio stabile. I perni sono stati paralleli e ben conservato. Le estremità osteotomized erano ben allineate lungo l'asse longitudinale dell'osso durante il processo di (Figura 2). Alla fine del periodo di latenza, nessun zone calcificato erano visibili (Fig...

Discussione

Questo studio descrive un protocollo riproducibile che comprende un design appropriato fixator esterno per ratto allungamento degli arti, con una dettagliata tecnica chirurgica che permette fisiologico peso-cuscinetto dall'animale dopo la rimozione del fissatore esterno. Il nostro protocollo ha condotto ad un osso rigenerato funzionale. Dopo 47 giorni di consolidamento, rimozione del fissatore esterno fatti in casa e 2 giorni di peso-cuscinetto fisiologico tramite l'animale non ha indotto alcuna frattura del callo rigene...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kétamine	Renaudin	578 540-2	Supply by animal house
Médétomidine	Virbac	6799091	Supply by animal house
Sevoflurane	Centravet	567 477-2	Supply by animal house
Buprenorphine	Indivor France	3400932731060	Supply by animal house
Enrofloxacine	ChannelPharmaceutical Facturing	FR/V/4955220	Supply by animal house
Piezotome	Satelec Acteon	F57510
Heating pet pad	Therasage	AL8365936	Supply by the animal house
Dental X-ray	S.A.R.L Innovation médicales et dentaires	WYZ - BLUEX
Winiwix Software	Softys Dental	PFT
Micro-CT system	nanoScan SPECT/CT	GEIT-31105EN (05/14)	Subcontract by IVTV central Lyon
Micro-CT analysis Software	phoenix datos X2 reconstruction	none	Free software
Electric razor	Brawn	GT415	Supply by animal house
Senn’s retractors	Word Precision Instruments	501718	Blunt version
Betadine Solution	Mundipharma Medical Company	D08AG02	Supply by animal house
Resorbable suture thread (5.0)	Ethicon	JV1023	Supply by animal house
Rugine	Word Precision Instruments	503406
Mayo-Hegar needle holder	Word Precision Instruments	V503382
Metal drill	Beuterlock	V020944018003
Micro Olsen-Hegar Needle-holder	Word Precision Instruments	501989
Mayo scissor	Word Precision Instruments	501752
Scalpel	Word Precision Instruments	500236
Sprague-Dawley	Janvier	none	12 weaks and male