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Resumen

El método presentado aquí pretende explorar la agregación de proteínas durante el envejecimiento normal en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. El protocolo representa una poderosa herramienta para el estudio de los agregados grandes altamente insolubles que se forman con la edad y determinar cómo cambios en proteostasis impactan de agregación de la proteína.

Resumen

En las últimas décadas, la prevalencia de trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y enfermedad de Parkinson (EP), ha crecido. Estos trastornos asociados con la edad se caracterizan por la aparición de agregados de proteínas de estructura fibrilar en los cerebros de estos pacientes. Exactamente por qué proteínas solubles normalmente se someten a un proceso de agregación sigue siendo mal entendido. El descubrimiento que la agregación de la proteína no se limita a procesos de la enfermedad y en su lugar parte del proceso normal de envejecimiento permite el estudio de los mecanismos moleculares y celulares que regulan la agregación de proteínas, sin utilizar ectopically expresado humana proteínas asociadas a la enfermedad. Aquí se describen metodologías para examinar la agregación de proteínas inherentes en elegans de Caenorhabditis a través de enfoques complementarios. En primer lugar, examinamos cómo cultivar grandes cantidades de edad-que sincronizados C. elegans para la obtención de animales y presentamos los procedimientos bioquímicos para aislar altamente insoluble en grandes agregados. En combinación con una caída genética dirigida, es posible diseccionar el papel de un gen de interés en la promoción o prevención de la agregación de proteínas dependientes de la edad usando ya sea un análisis exhaustivo con espectrometría de masas cuantitativo o una Análisis basado en el candidato con los anticuerpos. Estos resultados son luego confirmados por análisis en vivo con animales transgénicos expresando con etiquetas fluorescentes propensas a la agregación de proteínas. Estos métodos deberían ayudar a aclarar por qué ciertas proteínas son propensos a agregado con la edad y, en definitiva, cómo mantener estas proteínas completamente funcional.

Introducción

Agregación y mal plegamiento de proteínas son reconocidas como una seña de identidad de varias enfermedades neurodegenerativas tales como AD, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (FTD) y muchos otros. Por ejemplo, asambleas de α-sinucleína en fibrillas amiloides que se acumulan como los cuerpos de Lewy particularmente en el nigra del substantia de los pacientes con EP, mientras que en misfold de TDP-43 o FUS de pacientes ALS para formar agregados citoplasmáticos en degeneración de las neuronas motoras. En cada uno de estos trastornos neurodegenerativos, mecanismos de mantenimiento de la homeostasis de proteínas o proteostasis no evitar la acumulación de proteínas mal plegadas, por lo tanto conduce a la enfermedad.

Proteostasis es crucial para las funciones celulares y bajo condiciones normales estos mecanismos controlan firmemente la tasa de síntesis de proteínas, plegamiento y degradación. Varios estudios demuestran que con el envejecimiento, la capacidad de muchas células y órganos para mantener la homeostasis de proteínas poco a poco se ve comprometida y el deterioro fisiológico de las redes proteostasis con la edad es un factor agravante importante para enfermedades neurodegenerativas (revisadas en las referencias1,2,3). El hecho de que el control de calidad de la proteína y la respuesta celular al estrés proteínas desplegadas se comprometen con la edad sugiere que el mal plegamiento de proteínas y agregación podrían ser una general consecuencia del envejecimiento. De hecho, nosotros y otros hemos demostrado que la agregación de la proteína no se limita a la enfermedad y en cambio parte del proteoma se convierte en altamente insoluble en detergente en animales envejecidos4,5,6,7 ,8,9,10. Análisis computacional e in vivo revelaron que estos agregados relacionados con la edad fisiológicos se asemejan a agregados de la enfermedad en varios aspectos5. El descubrimiento de la agregación de proteína endógena, dependiente de la edad nos da la oportunidad de diseccionar los mecanismos moleculares y celulares que regulan la agregación de proteínas, sin utilizar ectopically expresadas proteínas humanas asociadas a la enfermedad. En la actualidad, solamente poca información existe sobre la regulación de la insolubilidad de la proteína generalizada y sobre los efectos de esta disregulación en la salud del organismo.

El nematodo C. elegans es uno de los organismos modelo más extensamente estudiados en la investigación del envejecimiento ya que estos animales tienen una vida útil relativamente corta y muestran muchas características de envejecimiento característico observados en organismos superiores. Los efectos del envejecimiento en la insolubilidad de la proteína han sido estudiados en C. elegans por fraccionamiento bioquímico secuencial basado en la solubilidad diferencial, que es ampliamente utilizado para extraer áridos de la enfermedad en el campo de la investigación neurodegeneración11 . Por espectrometría de masa cuantitativa, varias cientos proteínas fueron demostradas para ser agregación-propensa en C. elegans en la ausencia de enfermedad5. Aquí describimos en detalle el protocolo para cultivar grandes cantidades de gusanos en cultivo líquido y la extracción secuencial para aislar proteínas agregadas para la cuantificación por espectrometría de masas y el análisis por Western blot. Porque las proteínas mal plegadas y propensas a la agregación se acumulan en mayores cambios de gónadas y máscaras de C. elegans en otros tejidos somáticos5,12,13, utilizamos un mutante de la gónada menos centrarse el análisis de proteínas insolubilidad en los tejidos no reproductivos. El método permite el análisis de los agregados altamente insoluble, grandes que son insolubles en 0,5% SDS y sedimentados por la relativamente baja velocidad centrífuga. Por otra parte, un protocolo de extracción menos riguroso para recoger también agregados más pequeños y más solubles ha sido publicado en otra parte10. Además, se describe el método utilizado para evaluar la agregación en vivo en C. elegans.

En general, estos métodos en combinación con el ARN de interferencia (ARNi) pueden evaluar la función de un gen de interés en la modulación de agregación de la proteína depende de la edad. Para ello se describe el análisis de extractos de gusanos jóvenes y mayores con y sin precipitación de una proteína específica de interés utilizando RNAi. Estos métodos deben ser una herramienta poderosa para determinar que los componentes de la red proteostasis regulan insolubilidad de la proteína. Varias intervenciones tales como reducción la insulina/insulina-like growth factor (IGF) 1 señalización (IIS) se ha demostrado que retrasar dramáticamente C. elegans envejecimiento14. Vías de longevidad a menudo inducen mecanismos de control de calidad de la proteína y así estas vías podrían ser activamente influir en la tasa de agregación de la proteína. Por ejemplo, nos demuestran agregación reducida proteína inherente en animales de larga vida sobre la inhibición de la vía IIS7.

Protocolo

Nota: Para una mejor comprensión del procedimiento, se adjunta un esquema del flujo de trabajo (figura 1).

1. crecimiento de grandes números de jóvenes y de C. elegans sometidos a ARNi dirigido a un gen de interés

Nota: Uso de C. elegans por temperatura estéril gon-2(q388) mutantes (CF2253) para obtener grandes poblaciones de crianza sincronizada. Durante todos los pasos, es importante trabajar bajo condiciones semi estériles con una llama abierta y comprobar que no hay contaminación (por ejemplo, con hongos o bacterias). Realice los pasos (también centrifugados) a temperatura ambiente si la temperatura no se describe.

  1. Preparación de los mutantes de C. elegans gon-2(-) para obtener animales de menos de gónada
    Nota: Para obtener animales estériles que carecen de gónadas, la mutación de la pérdida de función debe ser inducida en los parentales cambiando en el último estadio larvario (L4) a 25 ° C para evitar la contribución materna.
    1. Primera expansión de los gon-2(-) animales para recoger generación parental para el cambio de la temperatura
      1. Racha Escherichia coli OP50 escurrir en un plato de caldo de lisogenia (LB) e incubar durante una noche a 37 ° C.
      2. Al día siguiente inocular medio 200 mL LB con un clon de OP50 e incubar durante una noche a 37 ° C.
      3. El próximo día semilla 15 alto crecimiento (HG) placas de medio (diámetro 9 cm) con 0,5 mL OP50 y distribuir OP50 con una espátula. Mantener las placas a temperatura ambiente durante dos días.
      4. Pedazo gon-2(-) animales (no hambrientos de las últimas dos generaciones) en placas de medio de 15 HG con OP50 y mantenerlas a 20 ° C hasta que las placas son confluentes con los adultos y algunos OP50 todavía está disponible.
      5. Mientras tanto, placas de medio de HG 60 semillas con OP50 como se describe en paso 1.1.1.3 y mantienen las placas a temperatura ambiente. Cuidado: Las placas sembradas deben no guardarse durante más de una semana se agrietará el agar a temperatura ambiente.
      6. Bleach las placas confluentes de una vez que la mayoría de los adultos comienza a poner huevos como se describió previamente15. Recoger los huevos en dos 15 mL tubos y colocar en un mezclador oscilante durante la noche a 20 ° C.
      7. El lavado día siguiente tramado L1s con buffer M9 (85 mM NaCl, 42 m m de Na2HPO4·7H2O, 22 m m KH2PO4): centrifugar a 3.000 x g durante 30 s, descartar el sobrenadante y llenar hasta la marca de 15 mL con M9. Centrifugar, descartar el sobrenadante y repetir 1.1.1.6. Llene los tubos con los pellets resultantes del gusano hasta la marca de 15 mL con M9.
      8. Evaluar el número total de L1s con un microscopio de disección contando la presente en 2 gotas μl colocadas en placas de agar sembradas no L1s. Promedio de los números obtenidos de por lo menos nueve gotas.
      9. Añadir 6.500 L1s por dejar que las gusanos crecen y placa de HG a 20 ° C hasta etapa de L4.
    2. La segunda expansión de los gon-2(-) animales para obtener gónada menos animales de experimento
      1. En etapa de L4, cambiar los gusanos de paso 1.1.1.9 a 25 ° C hasta que empiezan a poner huevos y L1s están tramando.
      2. Colección de huevos y L1s por sedimentación
        Nota: Después de la cambio de la temperatura a 25 ° C, es preferible usar sedimentación como una suave técnica para separar los huevos frágiles y L1s de los adultos.
        1. Lavar las placas con M9 usando 5 mL M9 por cinco placas. Transferencia de los gusanos en tubos de 50 mL.
        2. Llenar todos los tubos hasta la marca de 45 mL con M9, dejó el sedimento de adultos durante aproximadamente 10 minutos, recoger cada sobrenadante en un tubo de 50 mL y repetir este paso con el diábolo. Centrifugar el sobrenadante que contiene huevos y L1s a 3.000 x g durante 1 min, dejar el sedimento L1s durante aproximadamente 10 minutos y retirar el sobrenadante hasta que quedan 15 mL.
          Nota: Este es un paso crítico. No retire el sobrenadante demasiado temprano, para recoger L1s tantos como sea posible.
        3. Colocar los tubos que contienen huevos y L1s en un mezclador oscilante durante la noche a 25 ° C.
  2. Cultivo de líquido de la gónada menos animales para recoger animales jóvenes y envejecidos sometidos a ARNi dirigido a un gen de interés
    Nota: La respuesta de algunos genes a ARNi puede ser temperatura dependiente como se describió anteriormente16. Como alternativa a ARNi, un gen mutante podría incorporarse en el fondo de gon-2(-) .
    1. Preparación de bacterias por cultivo líquido
      1. Preparar OP50 y ARNi bacterias (bacterias que producen las bacterias con el vector vacío como control y dsRNA deseado) al inocular medio LB de 4 L con 12 mL del cultivo bacteriano respectivo (añadir una concentración final de 50 carbenicilina μg/mL y de 1 mM IPTG a la RNAi cultivos bacterianos) e incubar a 37 ° C durante la noche a 180 rpm.
      2. Al día siguiente cosecha de los cultivos a 6.700 x g por 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender cada precipitado en 60 mL helado S basal media (100 mM NaCl, 50 mM potasio Fosfato pH 6, mantenido en hielo). Mantener las tres pelotillas resuspendidas (OP50, control de bacterias de ARNi y ARNi para el gen de interés) a 4 ° C hasta el paso 1.2.2 o 1.2.3.
        Nota: Gusanos pueden cultivarse en ARNi de fase L1 (ver paso 1.2.3) o para evitar defectos de desarrollo de la última etapa larval L4 (ver paso 1.2.2).
    2. Cultivo líquido para el tratamiento con ARNi a partir en el último estadio larvario L4
      1. Añadir media basal S de 200 mL en un matraz de cultivo Fernbach (capacidad 2.800 mL). Para un volumen de cultivo final de 300 mL (véase 1.2.2.4), añadir citrato de potasio de 10 mM, pH 6, 3 mL de solución de metales traza (ácido de 5 mM etilendiaminotetracético (EDTA), 2,5 mM FeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, m a 0,1 m de CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL carbendazim y 5 μg/mL colesterol). Cerrar el matraz con un tapón de membrana. Consulte la tabla 1 para recetas de buffers.
      2. Tomar el L1s de 25 ° C (paso 1.1.2.2.3) y transferirlas a tubos de 15 mL. Centrifugue a 1.900 x g durante 3 min, eliminar el sobrenadante y cuenta L1s por μl 2 como en el paso 1.1.1.8. Añadir 500.000 L1s en el frasco de cultura Fernbach preparado en el paso anterior.
      3. Añadir OP50 (del paso 1.2.1) proporcionalmente al número de gusanos. Por ejemplo, 500.000 gusanos agregar 60 mL OP50.
      4. Gusano completo cultura s basal para llevar el volumen total a 300 mL. Incubar el cultivo de gusano hasta L4 fase a 25 ° C en un incubador de agitación con 150 rpm.
      5. Al día siguiente, los gusanos deben ser del tamaño de L4s de tipo salvaje. Para cambiar de OP50 ARNi bacterias, recoger animales en seis 50 mL tubos dejan sedimento y eliminar el sobrenadante. Lavar los L4s con M9 para eliminar bacterias residuales de OP50: centrifugar a 1900 x g durante 3 min, eliminar el sobrenadante y transferir todas L4s un 50 mL-tubo. Contar los L4s por 5 μl (por lo menos nueve veces). Dos veces 50.000 L4s son necesarios para la colección de gusano joven y dos veces 100.000 L4s son necesarios para la colección de gusano.
      6. Preparar cuatro Fernbach de frascos de cultivo como se describe en 1.2.2.1. Añadir también una concentración final de 50 μg/mL de carbenicilina y 1 mM IPTG en cada matraz.
      7. Agregar control ARNi bacterias y ARNi para el gen de interés (del paso 1.2.1) proporcional a la cantidad de gusanos: agregar 7 mL de la bacteria respectiva cada frasco para gusanos jóvenes y 14 mL cada frasco para los gusanos de.
      8. Añadir 50.000 lombrices por frasco para la recogida del gusano joven y 100.000 lombrices por frasco para la recogida del gusano de y completar las culturas s basal para completar hasta 300 mL. Incubar los cultivos de gusano (cuatro en total) a 25 ° C y 150 rpm.
    3. Cultivo líquido para el tratamiento con ARNi a partir de fase L1
      1. Preparar cuatro Fernbach de frascos de cultivo como se describe en 1.2.2.1 y añadir una concentración final de 50 carbenicilina μg/mL y de 1 mM IPTG.
      2. Continuar con la preparación de L1s como se describe en 1.2.2.2. En total, 300.000 lombrices se necesitan para dividir en cuatro frascos.
      3. Agregar control ARNi bacterias y ARNi para el gen de interés (del paso 1.2.1) proporcional al número de gusanos como se describe en paso 1.2.2.7 y considerar también la fase de crecimiento entre la fase L1 y L4: Añadir 13 mL de las respectivas bacterias cada frasco para jóvenes w ORM y 26 mL cada frasco para los gusanos envejecidos.
      4. Continuar como se describe en el paso 1.2.2.8.
    4. Mantenimiento de cultivos líquidos de C. elegans
      1. Recoger periódicamente una alícuota de cada cultivo líquido y el lugar en un portaobjetos de vidrio (o bien sobre una placa de agar) para verificar que no hay ninguna contaminación. Usando un microscopio de disección, compruebe los niveles de alimentación bacteriana en la cultura especialmente durante la fase de crecimiento. Prepara con antelación cultivos de 2 L de control ARNi bacterias y ARNi para el gen de interés como se describe en el paso 1.2.1. Agregar a C. elegans culturas líquidas si es necesario y mantener el resto a 4 ° C.
      2. Revise periódicamente que los animales son estériles. La mayoría de los animales no tendrán una gónada. Dependiendo de la penetrancia de la mutación de gon-2 , algunos pueden haber abortado estructuras gonadales pero no animales con huevos deben ser observados.
  3. Colección de gusanos jóvenes y envejecidos sometidos a ARNi en cultivo líquido
    Nota: Todos los pasos siguientes son para un frasco de cultivo líquido pero ambas culturas de la misma edad con ARNi bacterias y control para el gen de interés deben ser procesados juntos.
    1. Recoger gusanos jóvenes en día 2 ó 3 para medir los niveles basales de insolubilidad de la proteína. De gusanos deben ser recogidas (en más último) cuando la mitad de la población ha muerto. Para determinar esto, los gusanos muertos y vivos se cuentan en varias gotas de cultivo líquido a una placa de agar. Proporciones son promediadas en al menos nueve gotas.
    2. Preparar los reactivos siguientes: 1 M9 L, 1 L M9 con 0.01% octoxinol-9 (M9 + octoxinol-9) y 40 mL 60% de sacarosa en el ddH2O. mantienen los reactivos en el hielo.
    3. Verter los gusanos de un matraz a un embudo de separación y dejar el sedimento de gusanos por 10 min a temperatura ambiente. Abrir la llave de paso y caer los gusanos en un tubo de 50 mL.
    4. Dividir los pellets de lombriz en dos 15 mL tubos y centrifugue a 1.900 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Para limpiar los gusanos, quite el sobrenadante y completar hasta 15 mL con M9. Repetir la centrifugación. Finalmente transferir los gusanos a dos tubos de 50 mL y llenar al volumen total de 20 mL con M9 helada.
    5. Para eliminar las bacterias y los gusanos muertos, añadir las dos pastillas de gusano de 20 mL diluido a dos 50 mL tubos llenan con 20 mL helada 60% de sacarosa. Centrifugar rápidamente a 2.700 x g durante 5 min a temperatura ambiente, 9 de aceleración y desaceleración 7. Retire con cuidado la capa superior de gusano con una pipeta grande (25 mL). Tomar 15 mL (pero menos si obviamente hay un montón de gusanos muertos). Ponerlo directamente en 37 mL de M9 + octoxinol-9 (3 tubos por el tubo de la sacarosa) preparan en el hielo. Centrifugue a 2.700 x g durante 3 min a temperatura ambiente, aceleración 9 y desaceleración 7.
      Nota: Ambas necesitan estar helada; de lo contrario no funcionará la separación. ¡No mezcle! Porque la sucrosa es tóxica para las lombrices es importante ser rápido para el siguiente paso.
    6. Dividir la pastilla en cuatro 15 mL tubos y lavar dos veces con helada M9 + octoxinol-9: centrífuga a 1.900 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante, llene hasta la marca de 15 mL con helada M9 + octoxinol-9 y repetición del procedimiento.
    7. Lavar una vez con helada M9 y combinar los cuatro tubos a dos tubos. Llenan de M9 a temperatura ambiente para un volumen total de 4 mL en los tubos de 15 mL y girar en un mezclador oscilante a 25 ° C durante 40 minutos.
      Nota: Esto ayuda a los gusanos para digerir cualquier bacteria residual en el intestino. Compruebe los gusanos bajo el microscopio para ver que hay no hay muertos.
    8. Lave los gusanos dos veces con helada M9 + octoxinol-9, como se describe en 1.3.5. Lavar dos veces con la M9 y transferir los gusanos a un tubo.
    9. Lave los gusanos una vez en el tampón de extracción de sal de rearmado (RAB) sin inhibidores (ácido 4-morpholineethanesulfonic de 0,1 M (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic ácido (EGTA), 0.1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0.75 M de NaCl, 0.02 M fluoruro sódico (NaF)) antes de colección. Quite el sobrenadante hasta que no haya ningún líquido encima de los pellets de lombriz.
      Nota: Este paso y el siguiente deben hacerse rápidamente para evitar artefactos en los gusanos causados por la alta concentración de sal en el búfer.
    10. Estimar el volumen de pellets de lombriz y añadir un volumen idéntico de RAB con inhibidores (2 x Cóctel de inhibidor de la proteasa). Con una pipeta Pasteur, elaborará los gusanos y gotear lentamente en un tubo de 50 mL que la mitad lleno con nitrógeno líquido en hielo seco. Que el nitrógeno líquido se evapore y almacenar los gusanos congelados a-80 ° C hasta el procesamiento posterior.
      PRECAUCIÓN: Nitrógeno líquido está a una temperatura extremadamente baja; usar protección adecuada.

2. extracción de la proteína insoluble con animales jóvenes y envejecidos sometidos a ARNi dirigido a un gen de interés

  1. Interrupción de los animales recogidos en el paso 1.3
    Nota: Es importante evitar cualquier descongelación de las muestras del gusano. Enfriar el mortero con nitrógeno líquido y realizar el procedimiento completo en hielo seco.
    PRECAUCIÓN: Nitrógeno líquido está a una temperatura extremadamente baja; usar protección adecuada.
    1. Transferir los gusanos congelados al mortero previamente enfriado y moler durante 2,5 minutos.
      Nota: Tenga cuidado durante la molienda: en principio, los gusanos congelados en balas pequeñas y es fácil perderlos.
    2. Añadir nitrógeno líquido (aproximadamente 100 mL) para el polvo para enfriar otra vez y moler min 2,5 otra comprobación con el microscopio que los cuerpos del gusano se rompen. Transferir el polvo en los tubos de 2 mL y guardar a-80 ° C.
  2. Extracción de proteínas insolubles rápido para análisis de Western blot
    Nota: Utilice este método para comparar los niveles de proteína insoluble y de contenido de proteína total entre los diferentes días con y sin ARNi contra el gen de interés. ¡Realizar todos los pasos hasta el paso 2.2.3 en el hielo!
    1. Solubilizar 50 mg de gusanos de tierra en el paso 2.1 con 150 μL de tampón de ensayo (RIPA) radioinmunoprecipitación (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% sodio dodecil sulfato (SDS), desoxicolato de sodio 0.5% (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 1 x Cóctel de inhibidor de la proteasa). Homogeneizar la suspensión usando una jeringa de 1 mL con aguja gris (27 x ½", 0,4 mm x 13 mm); elaborar la suspensión 10 veces.
    2. Centrifugar a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante.
    3. Resuspender el precipitado en 100 μl de tampón de RIPA y centrifugar a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante centrifugado breve y tenga cuidado eliminar sobrenadante las sobras.
    4. Para solubilizar las proteínas altamente insolubles, Resuspender el precipitado en 75 μl de tampón de Urea/SDS (8 M urea, 2% SDS, 50 mM Ditiotreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) e incubar 10 min a temperatura ambiente.
    5. Para analizar el contenido de proteína total, combinar el RIPA primer sobrenadante del paso 2.2.2 y la resuspensión de sedimento de Urea/SDS. Para tener en cuenta los volúmenes utilizados para la extracción, la fracción total debe contener dos tercios de RIPA sobrenadante y una tercera parte de la fracción de sedimento de Urea/SDS. En gel de gradiente pequeño 4-12%, verificar los niveles de proteína insoluble por la carga de 9 μl de la fracción de Urea/SDS y 4 μL total proteína combinada. Realizar una tinción de blot de proteína total para controlar los niveles de proteína. Por Western Blot utilizando anticuerpos específicos, verificar cambios en la insolubilidad de proteínas individuales cuantificados por espectrometría de masa (ver sección 3).
  3. Extracción de proteína insoluble para aislar proteínas SDS-insoluble para espectrometría de masas
    Nota: Realice todos los pasos en el hielo.
    1. En hielo seco pesa dos veces a los gusanos de tierra 350 mg por momento y bacterias de RNAi (gusanos jóvenes y mayores, control de bacterias de ARNi y ARNi para el gen de interés) en tubos de 2 mL.
    2. Para extraer las proteínas solubles de la sal, añadir dos volúmenes de RAB por peso (700 μL) con inhibidores, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNasa I y 100 μg/mL Rnasa A cada tubo y solubilizar el polvo en el hielo. Elaboración de la suspensión en una jeringa de 1 mL (aguja gris 27 x ½", 0,4 mm x 13 mm) 15 veces e incubar en hielo durante 10 minutos la centrifugadora a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Ir a través de la capa de grasa y recoger el sobrenadante que contiene proteínas solubles de la sal en un tubo de 2 mL por condición (cuatro tubos en total). Quitar la grasa y deseche. Proteínas solubles de alícuotas sal para congelar a-80 ° C.
    3. Para descartar los lípidos, solubilizar el precipitado con 700 μl de RAB con inhibidores que contienen sacarosa de 1 M (sin DNasa y Rnasa A). Elaboración de la suspensión en una jeringa 10 veces e incubar en hielo por 5 min la centrifugadora a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Tenga cuidado de quitar todo el sobrenadante y lípidos y deshacerse de ellos.
    4. Para extraer las proteínas solubles en SDS, solubilizar el precipitado con 700 μl de tampón de RIPA. Elaborar la suspensión en una jeringa 10 veces e incubar durante 10 minutos en hielo. Centrifugar a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante que contiene proteínas solubles en SDS y la alícuota para la congelación a-80 ° C.
    5. Piscina dos muestras de cada condición junto después de cada pellet con 500 μl de tampón de RIPA de solubilización. Elaborar la suspensión en una jeringa 10 veces. Centrifugar a 18.400 x g por 20 min a 4 ° C. Tenga cuidado de quitar todos sobrenadante y deséchelo.
      Nota: El objetivo de la extracción es separar las proteínas solubles de las proteínas insolubles. Por lo tanto, es importante quitar todo residual RIPA sobrenadante antes de agregar el ácido fórmico en el paso siguiente.
    6. Solubilizar el precipitado final que contiene proteínas altamente insolubles con 400 μL 70% de ácido fórmico y elaborar la suspensión en una jeringa de 20 veces. Incubar por 20 min en hielo. Centrifugue a 50.000 x g por 20 min a 4 ° C, 3 de aceleración y desaceleración 5, para eliminar los restos de la cutícula del gusano. Recoger el sobrenadante que contiene proteínas altamente insolubles y congelar a-80 ° C.
    7. Diálisis de fracciones de proteína insoluble para espectrometría de masas
      Nota: Dializo a 4 ° C.
      1. Preparar 8 L de tampón de diálisis (50 mM Tris, 1 mM TDT, 0,1 mM PMSF, pH 7,5) y dividirla en ocho vasos de precipitado de 1 L. Coloque tres membranas (filtros de membrana = 0.025 μm) en la superficie de amortiguamiento para cada vaso de precipitados de 1 L.
      2. Por membrana, cuidadosamente cargar 65 μl de proteína insoluble, solubilizada en ácido fórmico, obtenido en el paso 2.3.6. Cada Estado se divide en seis de las membranas.
      3. Compruebe el pH de una muestra por eliminar 5 μl y agregar en una tira de pH. Si el pH es entre 7 y 8 (después de aproximadamente 2 h), recoger la muestra mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo suavemente. Finalmente, use 10 μl de tampón de diálisis para lavar el precipitado de cada membrana. Congelar las muestras a-80 ° C.

3. completa identificación y cuantificación de los cambios en la insolubilidad de la proteína con la edad inducida por ARNi dirigido a un gen de interés

  1. Preparación para el análisis de espectrometría de masa
    1. Evaluar la cantidad de proteínas insolubles en las muestras de dializado por la carga de una alícuota en un gel de gradiente de 4-12% junto con una muestra de referencia de concentración conocida. Realizar una tinción del gel de proteína total y cuantificar la cantidad de proteína con un software de análisis de imagen. Este paso es necesario para estimar la cantidad de tripsina, necesaria para la digestión (paso 3.1.4).
    2. Concentrar las muestras usando un evaporador centrífugo y solubilizar las proteínas insolubles en una concentración final de 8 M de urea.
    3. Alquilación y la reducción de
      1. Añadir Tris(2-carboxyethyl) clorhidrato de fosfina (TCEP) a una concentración final de 4 mM para las muestras. Incubar durante 1 h a 57 ° C con 300 rpm. Poner las muestras a temperatura ambiente.
      2. Añadir Yodoacetamida a una concentración final de 8.4 mM. Incubar durante 45 minutos (pueden ser incubados por 2 h) en la oscuridad a temperatura ambiente.
      3. Diluir las muestras en bicarbonato de amonio 150 mM para obtener una concentración final de urea de 2 M.
    4. Digerir proteínas con un 5% w/w modifican tripsina durante la noche a 37 ° C y 400 rpm.
    5. Una muestra de las proteínas digeridas en un gel de la SDS de 12% de la carga y realizar una tinción de gel de proteína total para analizar si la digestión trabajado. Si todavía hay algunas bandas presentes, repita los pasos 3.1.4 y 3.1.5.
    6. Péptidos de joven y de control y ARNi tratado C. elegans están marcados con etiquetas isobáricos para cuantificación absoluta y relativa, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      Nota: Como alternativa, utilizar otros métodos para el etiquetado de los péptidos o proteínas podrían para la cuantificación como etiquetas masa tándem.
      Nota: Análisis de espectrometría de masas: para reducir la complejidad de la muestra, péptidos deben estar separados por cromatografía de intercambio catiónico fuerte en diferentes fracciones para análisis de espectrometría de masas5. Varios espectrómetros de masas son capaces de analizar etiquetas isobáricos para cuantificación absoluta y relativa como se describe en otra parte17. Los datos obtenidos deben ser procesados con el software apropiado. En general este análisis permite la identificación de proteínas altamente insolubles y sus cambios en edad y en proteostasis modulación.

4. en Vivo evaluación de la influencia de un gen de interés en el patrón de agregación durante el envejecimiento

  1. En el análisis de espectrometría de masas en la sección 3, seleccione una proteína propensas a la agregación depende de la edad que se acumula a un diverso grado en los animales sometidos a ARNi. Generar transgénicos C. elegans líneas de expresión de esta proteína con la etiqueta con una proteína fluorescente y bajo el control de su respectivo promotor o promotora de tejidos específicos (véase la discusión para la elección de un apropiado promotor). Mantener la tensión a 15 ° C por técnicas estándar en placas de crecimiento de nematodos (NG) con OP50. Por ejemplo, elegimos una cepa de gusano expresan la proteína de enlace de Poliadenilato (PAB-1) fundida en la N-terminal a tagRFP bajo el control del promotor muscular faríngea pmyo-2.
  2. Evaluación in vivo de los cambios de agregación con la edad sobre la inhibición del gen de interés
    1. Uno a dos días de antelación, preparar NG/carbenicilina (Carb) / IPTG las placas con un control (vacío RNAi vectores L4440) bacterias y RNAi para inhibir el gen de interés. (Para un protocolo detallado sobre RNAi en la C. elegans ver base de datos educación ciencia de Zeus. Fundamentos de Biología 1: levadura, Drosophila y C. elegans. RNAi en la C. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. Para el tratamiento de ARNi de L1, lugar puesta de huevos de gusanos en varias separan pequeñas placas NG/Carb/IPTG (6 cm diámetro) sembradas con ARNi, o bacterias de RNAi para el gen de interés a 20 ° C. Eliminar a los adultos después de 2 h, manteniendo la progenie a 20 ° C. Para evitar defectos de desarrollo, tratamientos de RNAi pueden iniciarse después de la etapa larval L4.
    3. Una vez que las crías alcanza la etapa larval L4, transferir estos L4s en nuevas placas NG/Carb/IPTG sembradas con ARNi, o bacterias de RNAi para el gen de interés. Configurar placas de nueve con 15 transgénicos para ambas condiciones y mantener a 20 ° C. Los gusanos de envejecimiento deben transferirse de su progenie para nuevas placas cada dos días hasta el final de su período reproductivo para poder distinguirlos de sus crías.
    4. Evaluar los cambios en la distribución de la proteína propensos a agregación marcada con una etiqueta fluorescente en un estéreo microscopio de fluorescencia con 24 aumentos en la edad adulta, todos los días.
      Nota: La acumulación depende de la edad de la proteína propensas a la agregación en puncta brillante se utiliza como una indicación para la agregación. Estos puncta debe ser estructuras muy inmóviles a caracterizarse como agregados. Esto debe determinarse por la recuperación de la fluorescencia, después de photobleaching (FRAP), usando microscopia confocal. Para la proteína agregada, no recuperación debe observarse en la región de blanqueado después de al menos 4 min5,18. Para cuantificar los cambios con la edad, marcamos los patrones de distribución en los gusanos de edad-que sincronizados overexpressing PAB-1 en el día 2, día 5 y 7 días de la edad adulta como el siguiente: bajos niveles de agregación (0-10 tagRFP::PAB-1 orificio en el bulbo faríngeo posterior), medio de la agregación (orificio más de 10 en el bulbo faríngeo posterior) y alta agregación niveles (más de 10 orificio en el bulbo faríngeo anterior).

Resultados

Utilizamos los métodos aquí presentados para evaluar cómo longevos animales con menor IIS modulan la agregación de proteínas dependientes de la edad. Por Western blot (vea el paso 2.2, rápida extracción de la proteína insoluble para el análisis de Western blot), analizamos el total y el contenido de proteína insoluble de jóvenes (día 3 de la edad adulta) y de gusanos (día 18 de la edad adulta) control de RNAi y de ARNi a la insulina / Receptor de IGF-1-como daf-2. Ob...

Discusión

Aquí se presenta una metodología para aislar a agregados de proteína altamente insoluble de envejecimiento C. elegans sometidos a ARNi para análisis por espectrometría de masas y Western blotting. Mostramos que mejorar proteostasis reduciendo grandemente IIS previene la agregación de proteínas dependientes de la edad. Por selección de proteínas específicas propensas a la agregación que sobreexpresan en C. elegans, es posible disecar más los mecanismos de modulación de agregación de la prot...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por fondos de la DZNE y una beca de reinserción Marie Curie Internacional (322120 a D.C.D.)

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Fernbach culture flask Corning4425-2XLPyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap Schott1088655GL45
Nutating MixerVWR444-0148
Separatory funnelNalgene4300-1000Capacity 1,000 ml
1 ml syringe BD Plastipak300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Membrane filters 0.025 µMMilliporeVSWP04700
pH stripMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylphenylpolyethylenglycolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001recombinant, RNase free
RNaseAPromegaA7973solution
Total protein blot stainingThermofisherS11791Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel stainingThermofisherS12001Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Serva36970
IodoacetamideServa26710
AmmoniumbicarbonateSigma-Aldrich09830
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitationSciex4352135iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
Ultracentrifuge Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
Centrifuge 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40RThermo Scientific75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC LeicaWith Planapo 2.0x objective
Dissection microscopeLeica Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1ZeissWith PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis softwareImageJ
Analysis of mass spectrometry dataProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50CGC
RNAi bacteria
L4440Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253CGC, strain name: EJ1158 Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

Referencias

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