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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo del metodo qui presentato è quello di esplorare l'aggregazione di proteine durante l'invecchiamento normale nell'organismo modello di c. elegans. Il protocollo rappresenta un potente strumento per studiare i grandi aggregati altamente insolubili che formano con l'età e per determinare l'impatto di cambiamenti nel proteostasis aggregazione proteica.

Abstract

Negli ultimi decenni, la prevalenza dei disordini neurodegenerative, quali il morbo di Alzheimer (annuncio) e malattia di Parkinson (MDP), è cresciuta. Queste malattie età-associate sono caratterizzate dalla comparsa di aggregati di proteine con struttura fibrillare nei cervelli di questi pazienti. Esattamente perché normalmente solubili proteine subiscono un processo di aggregazione rimane capito male. La scoperta che l'aggregazione proteica non è limitato ai processi di malattia e invece parte del normale processo di invecchiamento consente lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano l'aggregazione proteica, senza l'utilizzo di ectopically espresso umano proteine associate a malattia. Qui descriviamo metodologie per esaminare l'aggregazione proteica inerente in Caenorhabditis elegans attraverso approcci complementari. In primo luogo, esaminiamo come far crescere un numero elevato di età-sincronizzato elegans del c. di ottenere animali invecchiati e presentiamo le procedure biochimiche per isolare altamente insolubile grandi aggregati. In combinazione con un atterramento di genetico mirato, è possibile sezionare il ruolo di un gene di interesse nel promuovere o prevenire l'aggregazione proteica età-dipendente utilizzando sia un'analisi completa con spettrometria di massa quantitativa o un analisi basata su candidati con gli anticorpi. Quindi, questi risultati sono confermati dall'analisi in vivo con animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti-etichettate aggregazione-incline. Questi metodi dovrebbero aiutare a chiarire perché alcune proteine sono inclini ad aggregarsi con l'età e, in definitiva, come mantenere queste proteine completamente funzionale.

Introduzione

Misfolding e aggregazione sono riconosciuti come un marchio di garanzia di parecchie malattie neurodegenerative quali AD, PD, sclerosi laterale amiotrofica (ALS), la demenza frontotemporale (FTD) e molti altri. Per esempio, α-synuclein assembly in fibrille amiloidi che si accumulano come i corpi di Lewy specialmente nel nigra di substantia dei pazienti del Palladio, mentre in misfold di TDP-43 o FUS di pazienti ALS a formare aggregati citoplasmatici a degenerazione dei neuroni di motore. In ciascuno di questi disordini neurodegenerative, meccanismi di mantenimento omeostasi della proteina o proteostasis non riescono ad impedire l'accumulo di proteine misfolded, conseguenza che conducono alla malattia.

Proteostasis è fondamentale per garantire le funzioni cellulari e in condizioni normali questi meccanismi regolatori sotto stretto controllano il tasso di sintesi proteica, pieghevole e degradazione. Parecchi studi dimostrano che con l'invecchiamento, la capacità di molte cellule e organi per mantenere l'omeostasi della proteina è gradualmente compromessa e il deterioramento fisiologico delle reti proteostasis con l'età è un importante fattore aggravante per malattie neurodegenerative (rivisto in riferimenti1,2,3). Il fatto che il controllo di qualità di proteina e la risposta cellulare allo stress spiegata della proteina sono compromessi con l'età suggerisce che misfolding e aggregazione potrebbe essere una conseguenza di invecchiamento generale. Infatti, noi ed altri abbiamo dimostrato che l'aggregazione proteica non è limitato alla malattia e invece parte del proteoma diventa altamente detersivo-insolubili in animali invecchiati4,5,6,7 ,8,9,10. Analisi computazionale e in vivo ha rivelato che questi aggregati relativi all'età fisiologici simili aggregati di malattia in diversi aspetti5. La scoperta di aggregazione della proteina endogena, età-dipendente ci dà la possibilità di sezionare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano l'aggregazione proteica, senza l'utilizzo di ectopically espressi proteine umane di malattia-collegati. Allo stato attuale, solo informazioni limitate esistono circa il regolamento di insolubilità di proteina diffusa e circa gli effetti di questa disregolazione sulla salute dell'organismo.

Il nematode c. elegans è uno dei microrganismi più estesamente studiati nella ricerca di invecchiamento come questi animali hanno una durata relativamente breve e mostrano molte caratteristiche di invecchiamento caratteristica osservate negli più alti organismi. Gli effetti dell'invecchiamento sull'insolubilità di proteina sono stati studiati in c. elegans di frazionamento biochimico sequenziale basato sulla solubilità differenziale, che è ampiamente usato per estrarre aggregati di malattia nel campo della ricerca di neurodegenerazione11 . Mediante spettrometria di massa quantitativa, parecchie centinaia di proteine sono stati indicati per diventare incline aggregazione in c. elegans in assenza di malattia5. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo per crescere un numero elevato di vermi in coltura liquida e l'estrazione sequenza per isolare aggregati proteici per quantificazione mediante spettrometria di massa e analisi mediante Western blot. Perché le proteine misfolded e aggregazione-incline si accumulano in età di c. elegans gonadi e maschere cambiamenti in altri tessuti somatici5,12,13, usiamo un mutante di gonade-meno mettere a fuoco l'analisi della proteina insolubilità in tessuti non riproduttiva. Il metodo presentato consente l'analisi di aggregati altamente insolubile, grandi, che sono insolubili in 0,5% SDS e pellettato di relativamente bassa velocità centrifuga. In alternativa, un protocollo di estrazione meno rigoroso a raccogliere anche aggregati più piccoli e più solubili è stato pubblicato altrove10. In più, descriviamo il metodo utilizzato per valutare l'aggregazione in vivo in c. elegans.

Nel complesso, questi metodi in combinazione con interferenza del RNA (RNAi) possono valutare il ruolo di un gene di interesse nel modulare l'aggregazione proteica età-dipendente. Per questo abbiamo descrivere l'analisi di estratti da vermi giovani e invecchiati con e senza atterramento di una specifica proteina di interesse mediante RNAi. Questi metodi dovrebbero essere un potente strumento per determinare quali componenti della rete proteostasis regolano insolubilità di proteina. Diversi interventi ridotti come fattore di crescita dell'insulina/insulino-simile (IGF) 1 segnalazione (IIS) hanno dimostrato di ritardare notevolmente c. elegans invecchiamento14. Vie di longevità spesso inducono meccanismi di controllo di qualità di proteina e così queste vie potrebbero essere attivamente influenzare il tasso di aggregazione della proteina. Ad esempio, dimostriamo l'aggregazione di proteine intrinseche ridotta in animali longevi all'inibizione del pathway IIS7.

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Protocollo

Nota: Per una migliore comprensione della procedura, è associato uno schema del flusso di lavoro (Figura 1).

1. crescita di grandi numeri di giovani e invecchiati di c. elegans sottoposti a RNAi Targeting un Gene di interesse

Nota: Uso di c. elegans temperatura-indotta sterile gon-2(q388) mutanti (CF2253) per ottenere grandi popolazioni invecchiato-sincronizzato. Durante tutti i passaggi, è importante lavorare in condizioni semi-sterile con una fiamma aperta e per controllare che nessun contaminazioni (ad esempio con funghi o batteri) sono presenti. Se la temperatura non è descritto, eseguire la procedura (anche centrifugazioni) a temperatura ambiente.

  1. Preparazione di c. elegans gon-2(-) mutanti per ottenere gonade-meno animali
    Nota: Per ottenere animali sterili privi di gonadi, la mutazione di perdita-de-funzione deve essere indotta in animali riproduttori spostando questi presso l'ultimo stadio larvale (L4) a 25 ° C al fine di evitare il contributo materno.
    1. Prima espansione di gon-2(-) animali per raccogliere generazione parentale per spostamento di temperatura
      1. Striatura Escherichia coli OP50 colare su un piatto di brodo Lisogenesi (LB) e incubare per una notte a 37 ° C.
      2. Il giorno successivo inoculare mL 200 LB liquido con un clone di OP50 e incubare per una notte a 37 ° C.
      3. Il prossimo giorno seme 15 alta crescita (HG) piastre di terreno (diametro 9cm) con 0,5 mL OP50 e distribuire OP50 con una spatola. Tenere le piastre a temperatura ambiente per due giorni.
      4. Pezzo gon-2(-) animali (non affamati per le ultime due generazioni) su piastre di terreno di 15 HG seminati con OP50 e mantenerli a 20 ° C fino a quando le piastre sono confluenti con adulti e alcuni OP50 è ancora disponibile.
      5. Nel frattempo, piastre di terreno di seme HG 60 con OP50 come descritto nel passo 1.1.1.3 e tenere le piastre a temperatura ambiente. Attenzione: Piastre seminati non dovrebbero essere tenuti per più di una settimana come l'agar si crepa a temperatura ambiente.
      6. Una volta che la maggior parte degli adulti iniziano a deporre le uova come descritto in precedenza15, candeggina le placche confluenti. Raccogliere le uova in due 15 mL-tubi e posto su un mixer nutante durante la notte a 20 ° C.
      7. Il lavaggio di giorno successivo covato L1s con buffer di M9 (85 mM NaCl, 42mm Na2HPO4·7H2O, 22mm KH2PO4): centrifuga a 3.000 x g per 30 s, scartare il surnatante e riempire fino al segno di 15ml con M9. Centrifugare, scartare il surnatante e ripetere il passaggio 1.1.1.6. Riempire le provette con le palline di verme risultante all'altezza del marchio 15ml con M9.
      8. Valutare il numero totale di L1s con un microscopio di dissezione contando il L1s presente in 2 µ l gocce, posizionati sulle piastre di agar non teste di serie. Media dei numeri ottenuti da almeno nove gocce.
      9. Aggiungere 6.500 L1s per teste di serie HG piastra e lasciare che i vermi crescono a 20 ° C fino allo stadio di L4.
    2. Seconda espansione di gon-2(-) animali per ottenere animali gonade-meno per esperimento
      1. In fase di L4, spostare i vermi dal passaggio 1.1.1.9 a 25 ° C fino a quando cominciano a deporre le uova e L1s sono cova.
      2. Raccolta di uova e L1s di sedimentazione
        Nota: Dopo lo spostamento di temperatura a 25 ° C, è preferibile utilizzare sedimentazione come una tecnica dolce per separare le uova fragili e L1s dagli adulti.
        1. Lavare le piastre con M9 utilizzando 5ml M9 per cinque piastre. Trasferire i vermi in provette da 50 mL.
        2. Riempire in su tutti i tubi fino alla tacca di 45 mL con M9, lasciate che il sedimento di adulti per circa 10 min, raccogliere ogni surnatante in una provetta da 50 mL e ripetere questo passaggio con il pellet. Centrifugare il supernatante contenente uova e L1s a 3.000 x g per 1 min, lasciare il sedimento L1s per circa 10 minuti e rimuovere il supernatante fino a 15 mL sono sinistra.
          Nota: Questo è un passo fondamentale. Non rimuovere il surnatante troppo presto, per raccogliere L1s come molti come possibile.
        3. Disporre le provette contenenti uova e L1s su un mixer nutante durante la notte a 25 ° C.
  2. Coltura liquida di gonade-meno animali per raccogliere gli animali giovani e invecchiati, sottoposti alla RNAi targeting un gene di interesse
    Nota: La risposta di alcuni geni per il RNA può essere temperatura dipendente come descritto in precedenza16. Come alternativa alla RNAi, un gene mutante poteva essere inserito in background gon-2(-) .
    1. Preparazione di batteri per coltura liquida
      1. Preparare OP50 e RNAi batteri (batteri che producono il dsRNA desiderata e batteri con il vettore vuoto come controllo) inoculando 4L LB medium con 12 mL di coltura batterica rispettiva (aggiungere una concentrazione finale di 50 carbenicillina µ g/mL e 1 mM IPTG per il RNAi le colture batteriche) e li Incubare a 37 ° C durante la notte a 180 giri/min.
      2. Il giorno successivo raccogliere le culture a 6.700 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere i surnatanti e ogni risospendere in media di S ghiacciata 60ml di basale (NaCl 100 mM, 50 mM potassio fosfato pH 6, tenuta su ghiaccio). Mantenere le tre palline di sedimento (OP50, controllare i batteri RNAi e RNAi batteri per il gene di interesse) a 4 ° C fino al punto 1.2.2 o 1.2.3.
        Nota: Vermi possono essere coltivate su RNAi dalla fase L1 (Vedi punto 1.2.3) o per evitare difetti di sviluppo dall'ultimo stadio larvale L4 (Vedi punto 1.2.2).
    2. Coltura liquida per trattamento con RNAi a partire all'ultimo stadio larvale L4
      1. Aggiungere 200 mL S basale media in un matraccio di cultura Fernbach (capienza 2.800 mL). Per un volume finale di cultura da 300 mL (Vedi 1.2.2.4), aggiungere il citrato di potassio 10 mM, pH 6, 3 mL di soluzione di metalli traccia (acido di 5mm etilendiamminotetraacetico (EDTA), 2,5 mM FeSO4, 1mm MnCl2, 1mm ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM di MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL carbendazim e colesterolo di 5 µ g/mL). Tappare il recipiente con un tappo a vite di membrana. Fare riferimento alla tabella 1 per le ricette del buffer.
      2. Prendere la L1s fuori di 25 ° C (fase 1.1.2.2.3) e trasferirli in provette da 15 mL. Centrifugare a 1.900 x g per 3 min, rimuovere il supernatante e contare il L1s a 2 µ l As in passaggio 1.1.1.8. Aggiungere 500.000 L1s nel pallone di cultura Fernbach preparato nel passaggio precedente.
      3. Aggiungere OP50 (dal punto 1.2.1) proporzionalmente al numero di vermi. Ad esempio, per 500.000 worm aggiungere 60 mL OP50.
      4. Completo di vite senza fine cultura con S basale per portare il volume totale a 300 mL. Incubare la cultura della vite senza fine fino allo stadio di L4 a 25 ° C in un incubatore di agitazione con 150 giri/min.
      5. Il giorno successivo, i vermi dovrebbero essere la dimensione del selvaggio-tipo L4s. Per cambiare da OP50 ai batteri di RNAi, raccogliere gli animali in sei 50 mL-tubi, far loro sedimenti e rimuovere il surnatante. Lavare il L4s con M9 per rimuovere residui OP50 batteri: Centrifugare a 1900 x g per 3 min, rimuovere il supernatante e trasferire tutti i L4s in one 50 mL-tubo. Contare il L4s a 5 µ l (almeno nove volte). Due volte 50.000 L4s sono necessari per la raccolta di giovani vite senza fine e due volte 100.000 L4s sono necessari per la raccolta di verme invecchiato.
      6. Preparare quattro matracci di cultura di Fernbach come descritto in 1.2.2.1. Aggiungere anche una concentrazione finale di 50 µ g/mL carbenicillina e 1 mM IPTG in ciascuno dei palloni.
      7. Aggiungere controllo RNAi RNAi batteri per il gene di interesse (dal punto 1.2.1) proporzionalmente al numero di vermi e batteri: aggiungere 7 mL di batteri rispettivi per fiaschetta per piccoli vermi e 14 mL per fiaschetta per i vermi invecchiati.
      8. Aggiungere 50.000 worm al pallone per la raccolta di giovani vite senza fine e 100.000 worm al pallone per la raccolta di verme invecchiato e completare le culture con S basale a riempire fino a 300 mL. Incubare le colture di vite senza fine (quattro in totale) a 25 ° C e 150 giri/min.
    3. Coltura liquida per trattamento con RNAi a partire in fase L1
      1. Preparare quattro matracci di cultura di Fernbach come descritto in 1.2.2.1 e aggiungere una concentrazione finale di 50 carbenicillina µ g/mL e 1 mM IPTG.
      2. Continuare con la preparazione di L1s come descritto in 1.2.2.2. In totale, 300.000 vermi sono necessari per dividerli in quattro boccette.
      3. Aggiungere controllo RNAi batteri e batteri di RNAi per il gene di interesse (dal punto 1.2.1) proporzionale al numero di vermi come descritto nel passo 1.2.2.7 e considera anche la fase di crescita tra la fase L1 e L4: aggiungere mL 13 dei rispettivi batteri per fiaschetta per giovani w ORM e 26 mL per fiaschetta per i vermi invecchiati.
      4. Proseguire come descritto al passo 1.2.2.8.
    4. Manutenzione delle colture liquide di c. elegans
      1. Periodicamente raccogliere un'aliquota da ciascuna coltura liquida e posto su un vetrino (in alternativa su una piastra di agar) per verificare che non vi siano senza contaminazioni. Utilizzando un microscopio di dissezione, controllare i livelli di cibo batterica nella cultura soprattutto durante la fase di crescita. Preparare in anticipo culture 2L di controllo RNAi batteri e batteri di RNAi per il gene di interesse come descritto al punto 1.2.1. Aggiungere questi elementi al C. elegans colture liquide se necessario e mantenere il resto a 4 ° C.
      2. Controllare periodicamente che gli animali sono sterili. La maggior parte degli animali non avrà una gonade. A seconda la penetranza della mutazione gon-2 , alcuni possono abortito gonadiche strutture ma nessun animale con le uova devono essere osservato.
  3. Collezione di worms giovani e invecchiati, sottoposto a RNAi in coltura liquida
    Nota: Tutti i passaggi seguenti sono per un matraccio di cultura liquido ma entrambe le culture della stessa età con controllo e RNAi batteri per il gene di interesse devono essere elaborate insieme.
    1. Raccogliere piccoli vermi al giorno 2 o 3 per misurare i livelli basali di insolubilità di proteina. Invecchiato vermi vanno raccolti (al più tardi) quando la metà della popolazione è morto. Per determinare questo, vermi morti e vivi sono contati in qualche goccia di coltura liquida posizionato su una piastra di agar. I rapporti sono media almeno nove gocce.
    2. Preparare i seguenti reagenti: 1 M9 L, 1 L M9 con 0.01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) e 60% di saccarosio per mL 40 ddH2O. conservare i reagenti sul ghiaccio.
    3. Versare i vermi da una boccetta in un imbuto separatore e lasciare il sedimento di vermi per 10 min a temperatura ambiente. Aprire il rubinetto e i vermi in un tubo da 50 mL a goccia.
    4. Dividere il pellet di vite senza fine in due 15 provette mL e centrifugare a 1.900 x g per 5 min a temperatura ambiente. Per lavare i vermi, rimuovere il supernatante e riempire fino a 15 mL con M9. Ripetere la centrifugazione. Infine, trasferire i vermi a due provette da 50 mL e riempire il volume totale 20 mL con M9 ghiacciata.
    5. Per rimuovere i batteri e vermi morti, aggiungere i pellet di verme di 20 mL diluito due a due 50 mL-tubi riempiti con 20ml ghiacciata 60% di saccarosio. Rapidamente Centrifugare a 2.700 x g per 5 min a temperatura ambiente, 9 di accelerazione e decelerazione 7. Rimuovere con attenzione lo strato superiore del verme con una pipetta da grande (25 mL). Richiedere fino a 15 mL (ma meno se ci sono ovviamente un sacco di vermi morti). Mettere questo direttamente in 37 mL di M9 + Octoxynol-9 (3 tubi per tubo di saccarosio) preparato sul ghiaccio. Centrifugare a 2.700 x g per 3 min a temperatura ambiente, accelerazione 9 e decelerazione 7.
      Nota: Entrambi devono essere ghiacciata; in caso contrario la separazione non funzionerà. Non mescolare! Perché il saccarosio è tossico per i vermi è importante essere veloci per il passaggio seguente.
    6. Dividere il pellet in quattro 15 mL-tubi e lavare due volte con gelida M9 + Octoxynol-9: Centrifugare a 1.900 x g per 1 min a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante, riempire al segno di 15ml con gelida M9 + Octoxynol-9 e ripetere la procedura.
    7. Lavare una volta con M9 ghiacciata e combinare i quattro tubi a due tubi. Riempire con M9 a temperatura ambiente per un volume totale di 4 mL 15 mL-provette e ruotare su un mixer nutante a 25 ° C per 40 min.
      Nota: Questo aiuta i vermi per digerire qualsiasi residui batteri nell'intestino. Controllare i vermi sotto il microscopio per vedere che non ci sono nessun ones guasti.
    8. Lavare i vermi due volte con gelida M9 + Octoxynol-9 come descritto in 1.3.5. Lavare due volte con M9 e trasferire i vermi in una provetta.
    9. Lavare una volta i vermi nel buffer di estrazione del alto-sale del rimontaggio (RAB) senza inibitori (0,1 M 4-morpholineethanesulfonic acido (MES), 1 millimetro di acido ethyleneglycoltetraacetic (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0,75 M di NaCl 0,02 M fluoruro di sodio (NaF)) prima collezione. Rimuovere il surnatante finché non ci sarà nessun liquido in cima il pellet di verme.
      Nota: Questo passaggio e quello successivo deve essere fatto rapidamente per evitare artefatti nei vermi causati da alta concentrazione di sale nel buffer.
    10. Stimare il volume di pellet di vite senza fine e aggiungere un volume identico di RAB con inibitori (2 x Cocktail di inibitore di proteasi). Utilizzando una pipetta Pasteur, redigere i vermi e lentamente gocciolare in un tubo da 50 mL riempito a metà con azoto liquido messo in ghiaccio secco. Lasciate che l'azoto liquido evaporare e conservare i vermi congelati a-80 ° C fino al momento di un'ulteriore elaborazione.
      Attenzione: L'azoto liquido è ad una temperatura estremamente bassa; indossare una protezione appropriata.

2. estrazione della proteina insolubile con animali giovani e invecchiati, sottoposti a RNAi Targeting un Gene di interesse

  1. Rottura degli animali raccolti nel passaggio 1.3
    Nota: È importante evitare qualsiasi scongelamento dei campioni verme. Raffreddare il mortaio con azoto liquido ed eseguire la procedura completa su ghiaccio secco.
    Attenzione: L'azoto liquido è ad una temperatura estremamente bassa; indossare una protezione appropriata.
    1. Trasferire i vermi congelati nel mortaio pre-raffreddato e macinare per 2,5 min.
      Nota: Fare attenzione durante la rettifica: all'inizio, i vermi congelati sono in piccole pallottole ed è facile perderle.
    2. Aggiungere azoto liquido (circa 100 mL) per la polvere per raffreddare nuovamente e macinare per un altro min 2,5 Check con il microscopio che i corpi di vite senza fine sono rotti. Trasferire la polvere in provette da 2 mL e conservarli a-80 ° C.
  2. Estrazione di proteine insolubili rapido per l'analisi Western blot
    Nota: Utilizzare questo metodo per confrontare i livelli di proteina insolubile e contenuto proteico totale tra i giorni differenti con e senza RNAi targeting per il gene di interesse. Eseguire tutti i passaggi fino al punto 2.2.3 sul ghiaccio!
    1. Solubilizzare 50mg di vermi di terra dal passaggio 2.1 con 150 µ l di Radioimmunoprecipitation tampone di dosaggio (RIPA) (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% sodio dodecil solfato (SDS), 0,5% sodio desossicolato (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), 1 x Cocktail di inibitore di proteasi). Omogeneizzare la sospensione usando una siringa da 1 mL con ago grigio (27 x ½", 0,4 mm x 13 mm); redigere la sospensione 10 volte.
    2. Centrifuga a 18.400 x g per 20 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante.
    3. Risospendere il pellet in 100 µ l di tampone RIPA e centrifugare a 18.400 x g per 20 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante, gira poco e fare attenzione a rimuovere le rimanenze surnatante.
    4. Per solubilizzare le proteine altamente insolubile, risospendere il pellet in 75 µ l di tampone di Urea/SDS (8m urea, 2% SDS, 50 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Per analizzare il contenuto proteico totale, combinare il primo RIPA surnatante dal punto 2.2.2 e la risospensione del pellet di Urea/SDS. Per tenere conto i volumi utilizzati per l'estrazione, la frazione totale dovrebbe contenere due terzi di RIPA surnatante e un terzo della frazione di pellet Urea/SDS. Su un gel di piccola 4-12% di pendenza, controllare i livelli di proteina insolubile caricando 9 µ l della frazione Urea/SDS e 4 µ l di proteina totale combinato. Eseguire una colorazione della macchia della proteina totale per monitorare i livelli della proteina. Mediante Western blotting usando anticorpi specifici, verificare le modifiche in insolubilità per singole proteine quantificato mediante spettrometria di massa (Vedi sezione 3).
  3. Estrazione di proteine insolubili per isolare proteine insolubili in SDS per spettrometria di massa
    Nota: Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio.
    1. Il ghiaccio secco pesare fuori due volte 350mg vermi di terra al punto di tempo e per i batteri di RNAi (vermi giovani e invecchiati, controllare i batteri RNAi e RNAi batteri per il gene di interesse) in provette da 2 mL.
    2. Per rimuovere le proteine solubili del alto-sale, aggiungere due volumi di RAB per peso (700 µ l) con inibitori, 1 mM PMSF, 200 U/mL dnasi ho e 100 µ g/mL RNasi A ciascun tubo e solubilizzare la polvere sul ghiaccio. Aspirare la sospensione in una siringa da 1 mL (ago grigio, 27 x ½", 0,4 mm x 13 mm) 15 volte e incubare in ghiaccio per 10 min. centrifuga a 18.400 x g per 20 min a 4 ° C. Passare attraverso lo strato di grasso e raccogliere il surnatante contenente proteine solubili del alto-sale in una provetta da 2 mL a condizione (quattro tubi in totale). Rimuovere il grasso e scartarlo. Aliquotare alto-sale proteine solubili a congelare a-80 ° C.
    3. Per scartare i lipidi, solubilizzano il pellet con 700 µ l RAB con inibitori contenenti saccarosio 1m (senza dnasi I e RNasi A). Aspirare la sospensione in una siringa 10 volte e incubare in ghiaccio per 5 min. centrifuga a 18.400 x g per 20 min a 4 ° C. Fare attenzione a rimuovere tutto il supernatante e lipidi e gettarli.
    4. Per rimuovere le proteine SDS-solubili, solubilizzano il pellet con 700 µ l di tampone RIPA. Aspirare la sospensione in una siringa 10 volte e incubare per 10 minuti in ghiaccio. Centrifuga a 18.400 x g per 20 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante contenente proteine SDS-solubili e aliquota per il congelamento a-80 ° C.
    5. Piscina due campioni di ciascuna condizione insieme dopo solubilizzanti ogni pallina con 500 µ l di tampone RIPA. Aspirare la sospensione in una siringa 10 volte. Centrifuga a 18.400 x g per 20 min a 4 ° C. Fare attenzione a rimuovere tutti supernatante e scartarlo.
      Nota: L'obiettivo dell'estrazione è di separare le proteine solubili da proteine insolubili. Pertanto, è importante rimuovere tutti i residui RIPA surnatante prima di aggiungere l'acido formico nel passaggio successivo.
    6. Solubilizzare il pellet finale contenenti proteine altamente insolubile con 400 µ l di acido formico 70% e redige la sospensione in una siringa 20 volte. Incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Centrifugare a 50.000 x g per 20 min a 4 ° C, accelerazione 3 e decelerazione 5, per rimuovere i detriti di cuticola del verme. Raccogliere il surnatante contenente proteine altamente insolubile e congelarlo a-80 ° C.
    7. Dialisi di frazioni proteiche insolubili per spettrometria di massa
      Nota: Dializzare a 4 ° C.
      1. Preparare la soluzione di dialisi 8 L (50mm Tris, 1 millimetro DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7.5) e dividerlo per otto Coppe di 1L. Posizionare tre membrane (filtri a membrana = 0,025 µM) nell'area di buffer per ciascun becher da 1 litro.
      2. A membrana, accuratamente caricare 65 µ l di proteina insolubile solubilizzata in acido formico ottenuta al passaggio 2.3.6. Ogni condizione è divisa in sei membrane.
      3. Controllare il pH di un campione rimuovendo 5 µ l e aggiungerlo su una striscia di pH. Se il pH è tra 7 e 8 (dopo circa 2 h), raccogliere il campione pipettando su e giù delicatamente. Infine, è possibile utilizzare 10 µ l di tampone di dialisi per lavare il precipitato fuori ogni membrana. Congelare i campioni a-80 ° C.

3. completa identificazione e quantificazione dei cambiamenti in proteina insolubilità con età indotta da RNAi Targeting un Gene di interesse

  1. Preparazione per l'analisi di spettrometria di massa
    1. Valutare la quantità di proteine insolubili nei campioni di dializzato caricando un'aliquota su un gel di pendenza di 4-12% e un campione di riferimento di concentrazione nota. Eseguire una colorazione di gel di proteina totale e quantificare la quantità di proteine con un software di analisi di immagine. Questo passaggio è necessario per stimare la quantità di tripsina necessaria per la digestione (punto 3.1.4).
    2. Concentrare i campioni utilizzando un evaporatore centrifugo e solubilizzare le proteine insolubili in una concentrazione finale di 8 M urea.
    3. Alchilazione e riduzione
      1. Aggiungi Tris(2-carboxyethyl) cloridrato di fosfina (TCEP) ad una concentrazione finale di 4 mM per i campioni. Incubare per 1 h a 57 ° C con 300 giri/min. Mettere i campioni a temperatura ambiente.
      2. Aggiungere iodoacetamide ad una concentrazione finale di 8,4 mM. Incubare per 45 min (possono essere incubate per 2 h) al buio a temperatura ambiente.
      3. Diluire i campioni in bicarbonato di ammonio di 150 mM per ottenere una concentrazione di urea 2 M finale.
    4. Digerire proteine con 5% w/w modificato tripsina durante la notte a 37 ° C e 400 giri/min.
    5. Caricare un campione delle proteine digerite su un gel di SDS 12% ed eseguire una macchiatura del gel della proteina totale per analizzare se la digestione ha funzionato. Se ci sono ancora alcune bande presenti, ripetere i passaggi 3.1.4 e 3.1.5.
    6. Peptidi da controllo giovane e invecchiato e trattati di RNAi c. elegans sono etichettati con tag Isobarico per quantificazione relativa e assoluta, seguendo le istruzioni del produttore.
      Nota: In alternativa, possono essere utilizzati altri metodi per etichettare i peptidi o proteine per quantificazione come i tag di massa tandem.
      Nota: Analisi di spettrometria di massa: per ridurre la complessità di campione, peptidi devono essere separati mediante cromatografia a scambio cationico forte in diverse frazioni per analisi di spettrometria di massa5. Spettrometri di massa diversi sono in grado di analizzare tag Isobarico per quantificazione relativa e assoluta come descritto altrove17. I dati ottenuti devono essere elaborati con il software appropriato. Nel complesso questa analisi permette l'identificazione di proteine altamente insolubile ed i loro cambiamenti su età e sulla modulazione proteostasis.

4. valutazione in Vivo dell'influenza di un Gene di interesse sul modello di aggregazione durante l'invecchiamento

  1. Selezionare l'analisi di spettrometria di massa nella sezione 3, una proteina di aggregazione-inclini di età-dipendente che si accumula in misura diversa negli animali sottoposti a RNAi. Transgenici c. elegans di generare linee che esprimono questa proteina taggati con una proteina fluorescente e sotto il controllo del suo rispettivo promotore o un promotore tessuto-specifici (Vedi la discussione per la scelta di un appropriato promotore). Mantenere il ceppo a 15 ° C mediante tecniche standard il Nematode crescita (NG) piastre inoculate con OP50. Ad esempio, abbiamo scelto un ceppo di vite senza fine che esprimono la proteina polyadenylate nel-associazione (PAB-1) fusa al N-terminale di tagRFP sotto il controllo del promotore muscolo pharyngeal pmyo-2.
  2. In vivo valutazione dei cambiamenti nell'aggregazione con l'età all'inibizione del gene di interesse
    1. Uno o due giorni in anticipo, preparare NG/carbenicillina (Carb) / IPTG piastre con un controllo (vettore di RNAi vuoto L4440) batteri e batteri di RNAi per inibire il gene di interesse. (Per un protocollo dettagliato su RNAi in c. elegans vedere Giove Science Education Database. Essentials di biologia 1: lievito, Drosophila e Elegans del c. RNAi in c. elegans. Giove, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. Per il trattamento di RNAi da L1, posto-deposizione delle uova di vermi su diversi separano piccole piastre NG/Carb/IPTG (6 cm di diametro) seminati con controllo RNAi o batteri di RNAi per il gene di interesse a 20 ° C. Rimuovere gli adulti dopo 2 h, mantenendo la progenie a 20 ° C. Per evitare i difetti inerenti allo sviluppo, RNAi trattamenti possono essere avviati dopo la fase larvale di L4.
    3. Una volta che la prole raggiunge la fase larvale L4, trasferire questi L4s sulle nuove piastre NG/Carb/IPTG seminati con controllo RNAi o batteri di RNAi per il gene di interesse. Nove piatti con 15 transgenetica ogni per entrambe le condizioni e li tiene a 20 ° C. I vermi di invecchiamento devono essere trasferiti dalla loro progenie a nuove piastre ogni secondo giorno fino alla fine del loro periodo riproduttivo al fine di essere in grado di distinguerli dalla loro prole.
    4. Valutare i cambiamenti nella distribuzione della proteina aggregazione-incline etichettata con un tag fluorescente sotto un stereo-microscopio a fluorescenza con 24 ingrandimenti durante l'età adulta, ogni altro giorno.
      Nota: L'accumulazione età-dipendente della proteina aggregazione-inclini in puncta luminoso viene utilizzato come una lettura per l'aggregazione. Questi puncta dovrebbe essere altamente immobile strutture a caratterizzarsi come aggregati. Questo dovrebbe essere determinato dal recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) che usando la microscopia confocal. Per aggregati della proteina, nessun recupero dovrebbe essere osservato nella regione sbiancata dopo almeno 4 min5,18. Per quantificare i cambiamenti con l'età, abbiamo segnato i modelli di distribuzione nei vermi età-sincronizzati che overexpressing PAB-1 a giorno 2, giorno 5 e 7 ° giorno dell'età adulta come indicato di seguito: bassi livelli di aggregazione (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta nel bulbo pharyngeal posteriore), livelli di aggregazione medio (più di 10 puncta nel bulbo pharyngeal posteriore) e livelli di aggregazione alta (più di 10 puncta nel bulbo della faringe anteriore).

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Risultati

Abbiamo usato i metodi presentati qui per valutare animali come longevi con IIS ridotta modulano l'aggregazione proteica età-dipendente. Mediante Western blot (Vedi punto 2.2, rapida estrazione di proteine insolubili per l'analisi Western blot), abbiamo analizzato il totale e il contenuto di proteina insolubile di young (3 giorno dell'età adulta) e dai vermi (giorno 18 di età adulta) sul controllo RNAi e su RNAi targeting l'insulina / Recettore IGF-1-like daf-2. Abbiamo non os...

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Discussione

Qui segnaliamo una metodologia per isolare gli aggregati altamente insolubili della proteina da invecchiamento di c. elegans sottoposti a RNAi per l'analisi mediante spettrometria di massa e Western blotting. Mostriamo che miglioramento proteostasis riducendo notevolmente IIS impedisce l'aggregazione proteica età-dipendente. Selezionando specifiche proteine di aggregazione-inclini a iperesprimono in c. elegans, è possibile sezionare ulteriormente i meccanismi che modulano l'aggregazione proteica inere...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del DZNE e un Marie Curie International Reintegration Grant (322120 a D.C.D.)

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Fernbach culture flask Corning4425-2XLPyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap Schott1088655GL45
Nutating MixerVWR444-0148
Separatory funnelNalgene4300-1000Capacity 1,000 ml
1 ml syringe BD Plastipak300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Membrane filters 0.025 µMMilliporeVSWP04700
pH stripMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001Complete Mini EDTA-free tablets 
Octoxynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylphenylpolyethylenglycolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001recombinant, RNase free
RNaseAPromegaA7973solution
Total protein blot stainingThermofisherS11791Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel stainingThermofisherS12001Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Serva36970
IodoacetamideServa26710
AmmoniumbicarbonateSigma-Aldrich09830
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitationSciex4352135iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
Ultracentrifuge Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
Centrifuge 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40RThermo Scientific75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC LeicaWith Planapo 2.0x objective
Dissection microscopeLeica Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1ZeissWith PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis softwareImageJ
Analysis of mass spectrometry dataProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50CGC
RNAi bacteria
L4440Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253CGC, strain name: EJ1158 Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

Riferimenti

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