Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

Özet

Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.

Özet

Son yıllarda, nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer hastalığı (Ah) ve Parkinson hastalığı (PD), gibi yaygınlığı büyüdü. Bu yaş ilişkili bozuklukları protein toplamları bu hastaların beynindeki fibrillary yapısı ile görünümünü ile karakterizedir. Tam olarak normal çözünür proteinler tabi neden bir toplama işlemi kötü anlaşılır kalır. Protein toplama hastalık süreçlerine sınırlı değildir ve bunun yerine normal yaşlanma sürecinin bir parçası protein toplama, ectopically kullanmadan düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları çalışma sağlar keşif insan ifade hastalık ilişkili proteinler. Burada Caenorhabditis elegans doğal protein toplamada tamamlayıcı yaklaşımlar ile incelemek için yöntemleri açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yaşlı hayvanlar elde etmek için çok sayıda yaş senkronize C. elegans yetiştirmeyi incelemek ve biz son derece-çözünmez-büyük toplamları ayırmak için biyokimyasal yordamlar mevcut. Hedeflenen genetik nakavt ile birlikte, teşvik ya da yaş bağımlı protein toplama nicel kütle spektrometresi ile ya da kapsamlı bir çözümlemesini kullanarak engelleyen bir gen rolünü incelemek mümkündür veya bir aday tabanlı analiz antikorlar ile. Bu bulgular sonra toplama eğilimli proteinler floresan öğesini ifade Transjenik hayvanlar ile vivo içinde analiz tarafından onaylanır. Bu yöntemler belirli proteinler topluluğu ile yaş ve sonuçta bu proteinler tamamen işlevsel tutmayı yatkındır neden açıklamak yardımcı olmalıdır.

Giriş

Protein misfolding ve toplama bir hallmark reklam, PD, amyotrofik lateral skleroz (ALS), da demans (FTD) ve diğerleri gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıkların kabul edilmektedir. Örneğin, α-synuclein derlemeler amiloid liflerinde içine bu PD hastalarında ALS hastalar TDP-43 veya FUS misfold iken motor nöronların oluşan bozucu formu sitoplazmik toplamları için özellikle de gözlemliyorum nigra Lewy organları olarak birikir. Her bu nörodejeneratif hastalıklar, protein homeostazı veya proteostasis Bakımı mekanizmaları hastalık için sonuç olarak lider misfolded proteinlerin birikimi önlemek başarısız.

Normal şartlar altında düzenleyici mekanizmaların sıkı bir şekilde denetlemesi protein sentezi, katlama ve bozulma oranını ve Proteostasis hücresel işlev görmesini sağlamak için önemlidir. Çeşitli çalışmalarda ile yaşlanma, protein homeostazı korumak yeteneği birçok hücre ve organların yavaş yavaş açığa ve yaş proteostasis ağlarıyla fizyolojik bozulma için önemli bir ağırlaştırıcı faktör olduğunu göstermek nörodejeneratif hastalıklar (başvurular^1,2,3' te gözden). Protein kalite kontrol ve gelişeceğini protein stres hücresel yanıt yaşla birlikte tehlikeye protein misfolding ve toplama yaşlanma genel bir sonucu olabilir gösteriyor. Nitekim, biz ve diğerleri protein toplama hastalığı için sınırlı değildir ve bunun yerine Proteom parçası çok deterjan-yaşlı hayvanlar^4,5,6'^{,7 çözünmez olur göstermiştir ,8,9,10}. Hesaplamalı ve in vivo analizi bu fizyolojik yaşı ile ilgili toplamları çeşitli yönleri⁵hastalık toplamları benzer saptandı. Endojen, yaş-bağımlı protein toplama keşfi bize protein toplama, ectopically ifade insan hastalık ilişkili proteinler kullanmadan düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için fırsat verir. Şu anda, bu bozukluk organizmanın sağlık üzerine etkisi ve yaygın protein insolubility düzenlenmesi hakkında sadece sınırlı bilgi bulunmaktadır.

Nematot C. elegans bu hayvanlar nispeten kısa bir ömrü var ve daha yüksek organizmalarda gözlenen birçok karakteristik yaşlanma özellikleri göstermek gibi araştırma yaşlanma içinde en yoğun olarak çalışılan model organizmalar biridir. Protein insolubility yaşlanma etkilerini C. elegans içinde ateş araştırma^{11 alan hastalık toplamları ayıklamak için yaygın olarak kullanılan farklı çözünürlük göre sıralı biyokimyasal ayırma tarafından incelenmiştir} . Nicel kütle spektrometresi tarafından birkaç yüz proteinler toplama C. elegans eğilimli hastalık⁵yokluğunda olmak için gösterildi. Burada biz ayrıntılı olarak tarif sıvı kültür ve miktar için toplanan proteinler kütle spektrometresi ve analiz tarafından Western blot tarafından izole etmek için sıralı ayıklama solucanlar çok sayıda büyümeye protokolü. Çünkü misfolded ve toplama eğilimli proteinler yaşlı içinde birikir C. elegans gonads ve maskeleri değişikliklerinin diğer somatik dokular^5,12,13, erbezi daha az mutant protein analizi odaklanmak için kullanmak Sigara üreme dokularda insolubility. Yöntemi sunulan % 0.5 SDS çözünmez ve nispeten düşük santrifüj hızlı tarafından pelleted son derece çözünmez, büyük toplamları çözümleme sağlar. Alternatif olarak, aynı zamanda daha küçük ve daha fazla çözünür toplamları toplamak için daha az sıkı bir ayıklama Protokolü oldu başka bir yerde¹⁰yayınlandı. Ayrıca, C. eleganstoplama vivo içinde değerlendirmek için kullanılan yöntem açıklamaktadır.

Genel olarak, bu yöntemleri RNA müdahale (RNAi) ile birlikte bir gen yaş bağımlı protein toplama oransal ilgi rolü değerlendirebilir. Bunun için biz genç ve yaşlı kurt ve nakavt RNAi kullanarak ilgi belirli bir protein olmayan özler analizini açıklar. Bu yöntemler proteostasis ağ bileşenlerini protein insolubility düzenleyen belirlemek için güçlü bir araç olmalıdır. Birkaç müdahaleler gibi insülin/İnsülin benzeri büyüme faktörü (IGF) azaltılmış 1 (IIS) sinyal gösterilmiştir dramatik C. elegans yaşlanma¹⁴geciktirmek için. Uzun ömürlü yolları genellikle protein-kalite kontrol mekanizmaları teşvik ve böylece bu yolları aktif protein toplama oranını etkileyen. Örneğin, sınırlı doğal protein toplama IIS yolu⁷inhibisyonu üzerine uzun ömürlü hayvanlarda göstermektedir.

Protokol

Not: yordamı daha iyi anlamak için bir şematik (şekil 1) iş akışının bağlı olduğu.

1. büyük numaraları genç ve yaşlı C. elegans büyüme RNAi hedefleme için ilgi çekici bir gen tabi

Not: büyük popülasyonlarda yaşlı senkronize elde etmek için kullanım C. elegans steril gon-2(q388) sıcaklık kaynaklı mutantlar (CF2253). Tüm adımları sırasında açık alev ile yarı steril koşullarda çalışmak ve hiçbir contaminations (örneğin, ile mantar veya bakteri) mevcut olup olmadığını kontrol için önemlidir. Sıcaklığını değil anlatılan adımları (de centrifugations) oda sıcaklığında gerçekleştirin.

1. Erbezi daha az hayvan edinmek için C. elegans gon-2(-) mutantlar hazırlanması
   Not: steril hayvanlar gonads eksik elde etmek için işlev kaybı mutasyon üst hayvanlarda Bunlar son larva aşamasında (L4) değişen 25 ° C-anne tarafından katkı önlemek için bağlı olmak gerekir.
   1. Gon-2(-) hayvanların sıcaklığı vardiya için ebeveyn üretimi toplamak için ilk genişleme
      1. Çizgi Escherichia coli OP50 bir Lysogeny suyu (LB) tabağa strain ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
      2. Ertesi gün bir OP50 klon ile 200 mL LB orta aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
      3. Sonraki gün tohum 15 yüksek büyüme (HG) orta plakaları (çapı 9 cm) ile 0.5 mL OP50 ve OP50 bir spatula ile dağıtmak. Tabakları oda sıcaklığında iki gün boyunca tutun.
      4. 15 HG orta plakaları OP50 ile seribaşı üzerine gon-2(-) hayvanlar (son iki kuşak için açlıktan değil) yığın ve onları korumak 20 ° C'de plakaları ile yetişkin Konfluent bazı OP50 hala kullanılabilir hale gelene kadar.
      5. Bu arada, tohum 60 HG orta plakaları ile OP50 açıklandığı gibi 1.1.1.3 adım ve tabakları oda sıcaklığında tutmak. Dikkat: agar oda sıcaklığında çatlamak olacak gibi numaralı seribaşı plakaları bir haftadan fazla tutulmalıdır değil.
      6. Çoğu yetişkin yukarıda açıklanan¹⁵yumurta bırakmaya başlayınca Konfluent tabakları çamaşır suyu. İki 15 mL-tüpler içinde yumurta toplamak ve bir gecede 20 ° C'de nutating Mikser yerleştirin
      7. Sonraki gün yıkama L1s M9 arabellek (85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO₄·7H₂O, 22 mM KH₂PO₄) ile yumurtadan: 3000 x g, santrifüj 30 s, atma süpernatant ve dolgu M9 15 mL işaretiyle kadar için. Santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve 1.1.1.6 adımı yineleyin. Tüpler ile elde edilen solucan granül M9 15 mL işaretiyle kadar doldurun.
      8. L1s toplam sayısı diseksiyon mikroskop ile L1s numaralı seribaşı olmayan agar Tabaklarda yerleştirilen 2 µL damla mevcut sayarak değerlendirin. Ortalama en az dokuz damla elde edilen sayılar.
      9. 6500 L1s numaralı seribaşı HG plaka ve solucanlar büyümeye izin başına 20 ° C'de L4 sahne kadar ekleyin.
   2. Erbezi daha az hayvan deney için elde etmek için gon-2(-) hayvanların ikinci genişleme
      1. L4 aşamada solucanlar adım 1.1.1.9-25 ° C kadar yumurta bırakmaya başlarlar ve L1s yumurtadan kaydır.
      2. Yumurta ve L1s topluluğu tarafından sedimantasyon
         Not: 25 ° c sıcaklık vardiyadan sonra sedimantasyon kırılgan yumurta ve L1s yetişkinlerden ayırmak için nazik bir teknik olarak kullanmak için tercih edilir.
         1. M9 ile plakalar 5 mL M9 beş tabak başı kullanarak yıkayın. Solucanlar 50 mL tüpler içine aktarın.
         2. Tüm tüpler M9 ile 45 mL işaretine kadar doldurun, Yetişkin tortu yaklaşık 10 dakika için izin, bir 50 mL tüp her süpernatant toplamak ve Pelet ile bu işlemi tekrarlayın. 3000 x g 1 dk. için yumurta ve L1s içeren süpernatant santrifüj kapasitesi, yaklaşık 10 dk L1s tortu izin ve 15 mL kaldı kadar süpernatant kaldırın.
            Not: Bu kritik bir adımdır. Süpernatant çok erken, mümkün olduğu kadar çok L1s toplamak için kaldırmaz.
         3. Gecede 25 ° C'de nutating Mikser üzerinde yumurta ve L1s içeren tüpler yerleştirin
2. Genç ve yaşlı hayvanlar bir gen ilgi hedefleme RNAi tabi toplamak için erbezi daha az hayvan sıvı kültür
   Not: Bazı genler cevaben RNAi sıcaklık yukarıda açıklanan¹⁶olarak bağımlı olabilir. RNAi alternatif, bir mutant gen gon-2(-) arka plana dahil.
   1. Sıvı kültür için bakteri hazırlanması
      1. 4 L LB orta ilgili bakteri kültürü 12 mL ile aşı OP50 ve RNAi bakteri (istenen dsRNA ve denetimi olarak boş vektör ile bakteri üreten bakteri) hazırlamak (50 µg/mL carbenicillin ve 1 mM IPTG son bir konsantrasyon için RNAi Ekle Bakteriyel kültürlerde) ve onları gece 180 rpm'de 37 ° C'de kuluçkaya.
      2. Ertesi gün 6.700 x g 4 ° C'de 10 dakika için de kültürler hasat Supernatants kaldırın ve her Pelet 60 mL buz gibi S Bazal medya (100 mM NaCl, 50 mM potasyum fosfat pH 6, buz tuttu) resuspend. Üç resuspended granül tutmak (OP50, RNAi bakteri ve RNAi bakteri gen ilgi için kontrol) 4 ° c kadar adım 1.2.2 ya da 1.2.3.
         Not: Solucanlar üzerinde RNAi L1 Sahne Alanı'ndan yetiştirilen olabilir (bkz. Adım 1.2.3) veya son larva aşamasından L4 gelişimsel kusurlar önlemek için (bkz. Adım 1.2.2).
   2. RNAi en son larva sahne L4 başlangıç ile tedavi için sıvı kültür
      1. Bir Fernbach kültür şişesi 200 mL S Bazal medya ekleyin (kapasite 2.800 mL). 300 mL son kültür hacmi için (bkz: 1.2.2.4), 10 mM potasyum sitrat, pH 6, 3 mL izleme metaller çözüm (5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), 2.5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO_{4 Ekle} , 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL carbendazim ve 5 µg/mL kolesterol). Bir membran vida kapaklı şişe kapatın. Tablo 1 ' e arabellekleri tariflerini bakın.
      2. L1s 25 ° C (Adım 1.1.2.2.3) dışarı almak ve 15 mL tüpler için aktarabilirsiniz. 1.900 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 2 µL olduğu gibi adım 1.1.1.8 başına L1s saymak. 500.000 L1s önceki adımda hazırlanan Fernbach kültür şişesi içine ekleyin.
      3. OP50 (Kimden adım 1.2.1) orantılı olarak solucanlar sayısını ekleyin. Örneğin, 500.000 solucanlar için 60 mL OP50 ekleyin.
      4. Solucan kültür Toplam hacim için 300 mL getirmek için Bazal S ile tamamlayın. L4 sahne titreyen bir kuluçka 150 d/d ile 25 ° c kadar solucan kültür kuluçkaya.
      5. Ertesi gün, solucanlar vahşi tipli L4s boyutunun olması gerekir. RNAi bakteri OP50 değiştirmek için altı 50 mL tüpler hayvanlarda toplamak, tortu izin ve süpernatant kaldırın. L4s kalan OP50 bakteri kaldırmak için M9 ile yıkayın: santrifüj kapasitesi 1900 x g 3 min için de ve tüm L4s bir 50 mL-tüp içine transfer süpernatant çıkarın. 5 µL başına L4s (en az dokuz kez) saymak. İki kez 50,000 L4s genç solucan koleksiyonu için gerekli olan ve iki kez 100.000 L4s yaşlı solucan koleksiyonu için ihtiyaç vardır.
      6. 1.2.2.1 içinde açıklandığı gibi dört Fernbach kültür şişeler hazırlayın. Ayrıca 50 µg/mL Carbenicillin ve 1 mM IPTG son bir konsantrasyon her şişe ekleyin.
      7. Denetimi RNAi eklemek bakteri ve RNAi bakteri gen ilgi (Kimden adım 1.2.1) orantılı olarak solucanlar sayısı için: 7 mL şişesi genç solucanlar için başına ilgili bakterilerin ve şişesi yaşlı kurt için başına 14 mL ekleyin.
      8. Şişesi genç solucan koleksiyonu için başına 50.000 solucanlar ve şişesi yaşlı solucan koleksiyonu için başına 100.000 solucanlar ekleyin ve ilâ 300 mL doldurmak için Bazal S kültürlerle tamamlayın. 25 ° C ve 150 rpm solucan kültürler (Toplam dört) kuluçkaya.
   3. RNAi L1 aşamada başlangıç ile tedavi için sıvı kültür
      1. 1.2.2.1 içinde açıklandığı gibi dört Fernbach kültür şişeler hazırlamak ve 50 µg/mL carbenicillin ve 1 mM IPTG son bir konsantrasyon ekleyin.
      2. 1.2.2.2 içinde açıklandığı gibi L1s hazırlanması ile devam edin. Toplamda, 300.000 solucanlar onları dört şişe bölmek için ihtiyaç vardır.
      3. Denetimi RNAi eklemek bakteri ve RNAi bakteri gen (dan ilgi adım 1.2.1) açıklandığı gibi solucanlar sayısı ile orantılı için adım 1.2.2.7 ve ayrıca L1 ve L4 sahne arasında büyüme aşamasında göz önünde bulundurun: 13 mL ilgili bakteri şişesi genç w için ücret ekleyin ORMS ve şişesi yaşlı kurt için başına 26 mL.
      4. 1.2.2.8 adımda anlatıldığı gibi devam edin.
   4. C. elegans sıvı kültürlerin bakım
      1. Düzenli olarak bir aliquot her sıvı kültür ve yer bir cam slayt üzerinde toplamak (alternatif olarak bir agar plaka üzerinde) hiçbir contaminations doğrulamak için. Diseksiyon mikroskop kullanmadan, bakteriyel gıda düzeyleri kültür özellikle büyüme aşamasında kontrol edin. Önceden kontrol RNAi kültürleri 2 L hazırlamak bakteri ve RNAi bakteri gen 1.2.1 adımda anlatıldığı gibi ilgi için. Bunlar C. elegans sıvı kültürleri için gerekirse ekleyin ve geri kalan 4 ° C'de tutmak
      2. Düzenli olarak hayvanlar steril olduğundan emin olun. Hayvanlarının çoğu erbezi yoktur. Alellerle gon-2 mutasyon bağlı olarak bazı Gonad yapıları iptal ama hiçbir hayvan yumurta ile dikkat edilmelidir.
3. Genç ve yaşlı kurt RNAi için sıvı kültüründe tabi topluluğu
   Not: Tüm aşağıdaki adımları bir sıvı kültür şişesi için ancak kontrolü ve RNAi bakteri ile aynı yaşta ilgi gen için her iki kültürleri birlikte işlenip.
   1. Genç kurt 2 gün veya gün protein insolubility bazal düzeyleri ölçmek için 3 toplama. Nüfusun yarısının ölen yaşlı kurt (en geç), toplanan olmalıdır. Bunu belirlemek için ölü ve canlı solucanlar sıvı kültürünün bir agar plaka üzerine yerleştirilen birkaç damla olarak dikkate alınır. Oranları en az dokuz damla üzerinde ortalama.
   2. Aşağıdaki reaktifler hazırlamak: 1 L M9, 1 L M9 %0.01 ile Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) ve 40 mL % 60 Sükroz GKD₂O. reaktifleri buz üzerinde tutmak.
   3. Bir balonun üzerinden solucanlar bir ayrılık huni içine dökün ve solucanlar tortu oda sıcaklığında 10 dakika izin ver. Stopcock açın ve solucanlar bir 50 mL tüp içine damla.
   4. Solucan Pelet iki 15 mL-tüpler içine split ve oda sıcaklığında 5 min için 1.900 x g, santrifüj kapasitesi. Solucanlar yıkamak için süpernatant çıkartın ve ilâ 15 mL M9 ile doldurun. Santrifüjü yineleyin. Son olarak iki 50 mL tüp solucanları aktarmak ve 20 mL toplam birime buz gibi M9 ile doldur.
   5. Kaldırmak için bakteri ve ölü solucanlar, eklemek iki 20 mL sulandırılmış solucan granül iki 50 mL tüpler için 20 mL buz gibi % 60 Sükroz ile dolu. 2700 x g oda sıcaklığında, 9 hızlanma ve yavaşlama 7, 5 min için de hızlı bir şekilde santrifüj kapasitesi. En iyi solucan katman büyük damlalıklı (25 mL) ile dikkatli bir şekilde çıkarın. 15 mL al (ama az belli ki orada bir sürü ölü solucanlar). Bu M9 + Octoxynol-9 doğrudan 37 mL koymak (sukroz tüp başına 3 tüpler) hazırlanan buzda. 2700 x g 3 dakika oda sıcaklığında, hızlanma, yavaşlama 7 ve 9 santrifüj kapasitesi.
      Not: Her ikisi de buz gibi olmak gerekir; Aksi takdirde ayırma çalışmaz. Karıştırmayın! Sükroz solucanlar için zehirli olduğundan aşağıdaki adım için hızlı olmak önemlidir.
   6. Pelet dört 15 mL-tüpler içine bölmek ve yıkama iki kez buz gibi M9 + Octoxynol-9 ile: 1.900 x g, santrifüj, oda sıcaklığında 1 dk için. Süpernatant kaldırmak için buz gibi M9 + Octoxynol-9 ve tekrar yordamı ile 15 mL işaretine doldur.
   7. Bir kez buz gibi M9 ile yıkayın ve iki tüp için dört tüpler birleştirir. Toplam hacmi 4 mL 15 mL tüpler için oda sıcaklığında M9 ile doldurmak ve a nutating Mikser 40 dk. 25 ° c üzerinde döndürün.
      Not: Bu artık bakterileri gut sindirmek için solucanlar yardımcı olur. Solucanlar hiçbir ölü olanlar görmek için mikroskop altında kontrol edin.
   8. Buz gibi M9 + Octoxynol-9 ile iki kez solucanlar 1.3.5 içinde açıklandığı gibi yıkayın. İki kez M9 ile yıkayın ve bir tüp solucanlar aktarın.
   9. Solucanlar bir kez yeniden bir araya getirme (RAB) yüksek tuz çıkarımı arabellek (0.1 M 4-morpholineethanesulfonic asit (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic asit (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO₄, 0,75 M NaCl, 0,02 M sodyum florür (kaf)) inhibitörleri olmadan yıkayın koleksiyon daha önce. Hiçbir sıvı solucan Pelet üstüne kadar süpernatant kaldırın.
      Not: Bu adımı ve sonraki hızla yüksek tuz konsantrasyonu arabellek neden solucan aktarımında önlemek için yapılmalıdır.
   10. Solucan Pelet hacmi tahmin ve RAB özdeş bir birim inhibitörleri (2 x proteaz inhibitörü kokteyl) ile ekleme. Pasteur pipet kullanarak, solucanlar kadar çizmek ve yavaş yavaş sıvı azot kuru buzun içinde yer yarısı dolu bir 50 mL tüp içine damla. Sıvı azot buharlaşır ve-80 ° C'de donmuş solucanlar daha fazla işleme kadar saklamak izin.
       Dikkat: Son derece düşük bir sıcaklıkta sıvı azot olduğunu; uygun koruma giymek.

2. çözünmez Protein çıkarma ile ilgi bir gen hedefleme RNAi tabi genç ve yaşlı hayvan

1. 1.3. adımda toplanan hayvanların bozulma
   Not: Herhangi bir solucan örnekleri çözme önlemek önemlidir. Sıvı azot ile harç sakin ve kuru buza tam yordamı gerçekleştirin.
   Dikkat: Son derece düşük bir sıcaklıkta sıvı azot olduğunu; uygun koruma giymek.
   1. Donmuş solucanlar için önceden soğutulmuş harç transfer ve 2.5 min için eziyet.
      Not: Taşlama sırasında dikkatli olun: Başlangıçta, donmuş kurt küçük mermi vardır ve onları kaybetmek kolaydır.
   2. Sıvı azot (yaklaşık 100 mL) tekrar serin ve solucan cesetleri kırık mikroskop ile başka bir 2.5 dk. onay için eziyet tozu ekleyin. Toz 2 mL tüpler içine aktarın ve onlara-80 ° C'de depolayın
2. Hızlı çözünmez protein çıkarma Western blot analizi için
   Not: Toplam protein içerik ve çözünmez protein düzeyleri farklı gün ve faiz gen hedefleme RNAi olmayan arasında karşılaştırmak için bu yöntemi kullanın. Adım 2.2.3 buz kadar tüm adımları gerçekleştirin!
   1. Zemin Worms adım 2.1 ile 150'den 50 mg solubilize µL Radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, % 0.5 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 0.5 sodyum deoxycholate (SDO), %1 nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF), 1 x proteaz inhibitörü kokteyl). 1 mL şırınga gri iğneyle (27 G x ½", 0.4 mm x 13 mm); kullanma süspansiyon homojenize süspansiyon kadar 10 kez çizin.
   2. 4 ° C'de 20 dk için 18,400 x g, santrifüj Süpernatant toplamak.
   3. Pelet 100 µL RIPA arabellek ve santrifüj 18,400 x g 4 ° C'de 20 dk için de resuspend Süpernatant atmak, kısa bir süre spin ve artık süpernatant kaldırmak dikkatli olun.
   4. Son derece çözünmez proteinler solubilize için Pelet 75 µL üre/SDS arabellekte (8 M üre, % 2 SDS, 50 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) resuspend ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
   5. Toplam protein içeriği analiz etmek için ilk RIPA 2.2.2 adımından süpernatant ve üre/SDS Pelet resuspension birleştirir. Çıkış için kullanılan birimler için hesap için toplam kesir RIPA süpernatant üçte ikisi ve üre/SDS Pelet kesir üçte biri bulunması gerekmektedir. Küçük 4-%12 degrade jel üzerinde 4 µL toplam kombine protein ve üre/SDS fraksiyonunun 9 µL yükleme çözünmez protein seviyesini kontrol edin. Bir toplam protein leke boyama protein düzeyleri izlemek için gerçekleştirin. Batı tarafından insolubility için bireysel proteinler tarafından kütle spektrometresi sayısal olarak değişiklikleri doğrulamak belirli antikorları kullanarak kurutma (Bölüm 3 bakınız).
3. Kütle spektrometresi SDS çözünmez proteinleri yalıtmak için çözünmez protein çıkarma
   Not: buzda tüm adımları gerçekleştirin.
   1. Kuru buza 350 mg zemin solucanlar her zaman noktası başı RNAi bakteri (genç ve yaşlı kurt, denetim RNAi bakteri ve RNAi bakteri gen ilgi için) 2 mL tüpler içine tartmak dışarı iki kez.
   2. Yüksek tuz çözünür proteinler kaldırmak için RAB iki birim başına ağırlık (700 µL) inhibitörleri, 1 mM PMSF, ben ve 100 µg/mL RNase A her tüp ve buz üzerinde toz solubilize 200 U/mL Dnaz ekleyin. Süspansiyon kadar bir 1 mL şırınga (gri iğne, 27 G x ½", 0.4 mm x 13 mm) 15 kez çizmek ve 10 dk santrifüj 18,400 x g 4 ° C'de 20 dk için de buz üzerinde kuluçkaya Yağ katman sayesinde gidip koşul (Toplam dört tüpler) başına bir 2 mL tüp içine yüksek tuz çözünür protein içeren süpernatant toplamak. Yağ çıkarmak ve bu atın. -80 ° C'de dondurmak için aliquot yüksek tuz çözünür proteinler
   3. Lipidler atmak için 1 M Sükroz içeren inhibitörleri ile Pelet 700 µL RAB ile solubilize (Dnaz olmadan ben ve RNase A). Süspansiyon kadar bir şırınga 10 kez çizmek ve 5 dk. santrifüj 18,400 x g 4 ° C'de 20 dk için de buz üzerinde kuluçkaya Tüm süpernatant ve lipidler kaldırmak ve onları atmak dikkatli olun.
   4. SDS-çözünür proteinler kaldırmak için Pelet 700 µL RIPA arabelleği ile solubilize. Süspansiyon kadar bir şırınga 10 kez çizmek ve buz üzerinde 10 min için kuluçkaya. 4 ° C'de 20 dk için 18,400 x g, santrifüj SDS-çözünür protein ve aliquot-80 ° C'de dondurmak için içeren süpernatant toplamak
   5. Her koşul birlikte iki örnekleri her Pelet 500 µL RIPA arabelleği ile çözücü sonra havuz. Süspansiyon kadar 10 kez bir şırınga çizin. 4 ° C'de 20 dk için 18,400 x g, santrifüj Tüm süpernatant kaldırmak ve onu atmak dikkatli olun.
      Not: Çıkarma amacı çözünür proteinler çözünmez proteinler ayırmaktır. Bu nedenle, tüm kalıntı RIPA formik asit sonraki adımda eklemeden önce süpernatant kaldırmak önemlidir.
   6. 400 µL % 70 formik asit ile son derece çözünmez protein içeren son Pelet solubilize ve süspansiyon kadar bir şırınga 20 kez çizin. Buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya. 50.000 x g 20 dk 4 ° C, 3 hızlanma ve yavaşlama 5, solucan kütikül enkaz kaldırmak için için santrifüj kapasitesi. Son derece çözünmez protein içeren süpernatant toplamak ve-80 ° C'de dondurmak
   7. Çözünmez protein kesirler için kütle spektrometresi diyaliz
      Not: 4 ° C'de diyaliz
      1. 8 L diyaliz arabellek (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7.5) hazırlamak ve sekiz 1 L Şişeler için bölmek. Üç membranlar yer (membran filtreleri 0.025 µM =) her 1 L kabı için arabellek yüzeyi.
      2. Membran dikkatle çözünmez protein formik asit 2.3.6. adımda elde çözündürüldükten 65 µL yükleyin. Her koşul altı membranlar ayrılmıştır.
      3. Bir örnek pH 5 µL kaldırıp bir pH şerit ekleyerek ile kontrol edin. PH (yaklaşık 2 h sonra) 7 ve 8 arasında ise, yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından örnek toplamak. Son olarak, 10 µL diyaliz arabellek her membran kapalı çökelti yıkamak için kullanın. Örnekleri-80 ° C'de dondurmak

3. kapsamlı kimlik ve miktar Protein Insolubility ile ilgi bir gen hedefleme RNAi tarafından indüklenen yaş olarak değişiklikler

1. Kütle spektrometresi analiz için hazırlık
   1. Diyaliz örneklerinde çözünmez protein miktarı % 4-12 degrade jel ile birlikte örneği bilinen konsantrasyon üzerine bir aliquot yükleyerek değerlendirin. Toplam protein jel boyama gerçekleştirmek ve bir görüntü analiz yazılımı ile protein miktarı ölçmek. (Adım 3.1.4) sindirim için gerekli tripsin tahmin etmek bu adım gereklidir.
   2. Santrifüj Evaporatör kullanarak örnekleri konsantre ve 8 M üre son bir konsantrasyon çözünmez protein solubilize.
   3. Alkillenme ve azaltma
      1. Eklemek Tris(2-carboxyethyl) için 4 mM örnekleri için son bir konsantrasyon fosfamin hidroklorür (TCEP). 1s 57 ° c 300 RPM için kuluçkaya. Örnekleri oda sıcaklığına koymak.
      2. İodoacetamide 8.4 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. İçinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 45 dk (2s için inkübe) için kuluçkaya.
      3. Son 2 M üre konsantrasyonu elde etmek için 150 mM amonyum bikarbonat örneklerinde sulandırmak.
   4. Özet proteinler ile % 5 w/w tripsin gecede, 37 ° C ve 400 rpm değiştiren.
   5. Bir örnek % 12 SDS jel üzerinde sindirilir proteinlerin yüklemek ve bir toplam protein jel boyama sindirim işe yaradıysa analiz etmek için gerçekleştirin. Hala bazı grup mevcut yoksa 3.1.4 ve 3.1.5 arasındaki adımları yineleyin.
   6. Genç ve yaşlı kontrol ve tedavi RNAi C. elegans peptidler üreticinin yönergelerini takip göreli ve mutlak Nefelometri için izobarik etiketleri ile etiketlenmiştir.
      Not: Alternatif olarak, tandem kitle Etiketler gibi miktar peptidler veya proteinler etiketleme için diğer yöntemleri kullanılabilir.
      Not: Kütle spektrometresi analizi: örnek karmaşıklığını azaltmak için peptidler güçlü katyon değişim Kromatografi tarafından farklı bölümler için kütle spektrometresi analizi⁵içine ayrılmalıdır. Birkaç Kütle Spektrometreleri başka bir yerde¹⁷açıklandığı gibi göreli ve mutlak Nefelometri için çözümleme izobarik Etiketler yeteneğine sahiptirler. Elde edilen veriler uygun yazılım ile işlenip. Genel olarak bu analiz son derece çözünmez proteinler ve yaş ve proteostasis modülasyon yaptıkları değişiklikleri sağlar.

4. yaşlanma sırasında ilgi bir genin etkisi toplama desen Vivo içinde değerlendirilmesi

1. Kütle spektrometresi analizde Bölüm 3, RNAi için tabi hayvanlarda farklı ölçüde biriken bir yaş bağımlı toplama eğilimli protein seçin. Transgenik C. elegans oluşturmak bu proteinin ifade satır öğesini floresan bir protein ile ve onun ilgili organizatörü veya bir doku özgü organizatörü kontrolü altında (uygun bir organizatörü seçim için konuya bakın). 15 ° C'de zorlanma OP50 ile seribaşı Yuvarlak solucanlar büyüme (NG) plakaları standart teknikleri ile sürdürmek. Örneğin, polyadenylate-bağlayıcı protein (PAB-1) N-terminus faringeal kas promotor kontrol altına tagRFP için erimiş ifade bir solucan yük açmadı pmyo-2.
2. Toplama yaş üzerine gen inhibisyonu ile ilgi değişimler vivo içinde değerlendirilmesi
   1. 1-2 gün önceden hazırlamak NG/carbenicillin (Carb) / IPTG tabaklar bir denetimle (boş RNAi vektör L4440) bakteri ve RNAi bakteri gen ilgi etkisizleştirmek için. ( C. elegans RNAi hakkında detaylı bir iletişim kuralı için Jüpiter bilim eğitim bkz: Database. Biyoloji 1 essentials: Maya, Drosophila ve C. elegans. RNAi C. elegansiçinde. Aman Tanrım, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
   2. L1 üzerinden RNAi tedavi için yer solucanları birkaç üzerine yumurta atarken denetim RNAi veya RNAi bakteri gen 20 ° C'de ilgi ile seribaşı küçük NG/karbonhidrat/IPTG (6 cm çapında) tabaklar ayırın. 20 ° C'de döl tutma 2 h sonra Yetişkin kaldırmak Gelişimsel hataları önlemek için RNAi tedaviler L4 larva aşamadan sonra başlatılabilir.
   3. Belgili tanımlık çoluk çocuk L4 larva sahne ulaştıktan sonra bu L4s kontrol RNAi veya RNAi bakteri gen ilgi ile seribaşı yeni NG/karbonhidrat/IPTG levhalar üzerine aktarın. Dokuz pilakalar ve 15 transgenics her iki koşul için ayarlamak ve 20 ° C'de saklayın Yaşlanma solucanlar onların döl uzak için yeni tabaklar onları--dan onların çoluk çocuk ayırt edebilmek için iki günde onların üreme dönemi sonuna kadar aktarılması gereken.
   4. Dağıtım sırasında yetişkinlik, her gün 24 x büyütme ile floresan bir stereo mikroskop altında floresan bir etiketle etiketlenmiş toplama eğilimli protein değişiklikleri değerlendirin.
      Not: Parlak puncta toplama eğilimli protein yaş bağımlı birikimi toplama için bir okuma kullanılır. Bu puncta son derece hareketsiz yapıları toplamları karakterize edilebilir olmalıdır. Bu floresan kurtarma tarafından photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) sonra confocal mikroskobu kullanılarak tespit edilmelidir. İçin toplanan protein, hiçbir kurtarma sonra en az 4 min^5,18ağartılmış bölgede dikkat edilmelidir. Yaş grubu değişiklikler ölçmek için biz dağıtım desenleri PAB-1 2 gün, 5 gün ve gün 7 aşağıdaki olarak erişkin overexpressing yaş senkronize solucanlar attı: düşük toplama düzeyleri (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta posterior faringeal ampul içinde) Orta toplama düzeyleri (posterior faringeal ampul içinde 10'dan fazla puncta) ve yüksek toplama düzeyleri (anterior faringeal ampul içinde 10'dan fazla puncta).

Sonuçlar

Biz burada ne kadar uzun ömürlü hayvanlarla değerlendirmek için sunulan yöntemleri kullanılan azaltılmış IIS modüle yaş bağımlı protein toplama. Tarafından Western blot (2.2, çabuk çözünmez protein çıkarma Western blot analizi için bkz. adım), toplam ve genç (3. gün erişkin) çözünmez protein içeriği analiz ve yaş (gün 18 yetişkinlik) solucanlar kontrol RNAi ve insülin hedefleme RNAi / IGF-1-benzeri reseptör daf-2. RNAi koşulları (

Tartışmalar

Burada son derece çözünmez protein toplamları RNAi için analiz için kütle spektrometresi ve Western Blot tarafından tabi C. elegans yaşlanma dan izole etmek için bir metodoloji raporu. Biz proteostasis IIS büyük ölçüde azaltarak iyileştirilmesi yaş bağımlı protein toplama engellediğini gösterir. C. elegansiçinde overexpress için belirli toplama eğilimli proteinler seçerek, daha fazla doğal protein toplama oransal mekanizmaları incelemek mümkündür.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1088655	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	300013
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	09830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4352135	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5404000413
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli strain
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158		Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen		Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]