Buscando vías de controlador de adquirir resistencia a la terapia dirigida: sensibilidad restaurar por Gene Knock-down y generación Subclone resistente a los medicamentos

Resumen

Se trata de un protocolo de tiempo y costo efectiva en vitro investigando los mecanismos de resistencia adquirida a agentes terapéuticos dirigidos, que es una gran necesidad médica en el manejo del cáncer.

Resumen

Las últimas dos décadas han visto un cambio de fármacos citotóxicos a terapia dirigida en oncología médica. Aunque agentes terapéuticos dirigidos han demostrado eficacia clínica más impresionante y minimizado los efectos adversos de los tratamientos tradicionales, resistencia a las drogas se ha convertido en la principal limitación para sus beneficios. Han desarrollado varios modelos preclínicos/in vitro/in vivo de resistencia adquirida a agentes dirigidos en la práctica clínica principalmente mediante el uso de dos estrategias: i) genética manipulación para el modelado de genotipos de resistencia adquirida y ii) en vitro / vivo en selección de modelos resistentes. En el presente trabajo, proponemos un marco unificador para la investigación de los mecanismos subyacentes responsables de la resistencia adquirida a agentes terapéuticos dirigidos, a partir de la generación de subclones celulares resistente a los medicamentos a la descripción de procedimientos utilizados para restaurar la sensibilidad a los inhibidores de silenciamiento. Este tiempo y costo efectiva enfoque simple es ampliamente aplicable y podría ampliarse fácilmente para investigar mecanismos de resistencia a otras drogas terapéuticas específicas en diferentes tumor histotypes.

Introducción

Después de los cruciales descubrimientos en biología molecular y celular, se han desarrollado una serie de novela sintetizadas moléculas contra el cáncer para atacar selectivamente las vías de señalización oncogénicas en una amplia gama de tipos de tumores. En particular, compuestos de químicos sintéticos es decir, de dos categorías de agentes terapéuticos dirigidos con propiedades únicas en oncología, y anticuerpos monoclonales recombinantes, se sabe que han logrado éxitos clínicos y atención del cáncer dramáticamente alterada en las últimas décadas^1,2,3.

Sin embargo, a pesar de su impresionante respuesta inicial al tratamiento, la mayoría de los pacientes con cáncer ha desarrollado resistencia a los medicamentos a todos los agentes terapéuticos específicos, anticuerpos monoclonales y los inhibidores de la cinasa. Como consecuencia, resistencia a las drogas, el gran obstáculo para medicamentos contra el cáncer clásico⁴, sigue siendo un gran desafío para nuevas terapias dirigidas^5,6.

Resistencia a la terapia dirigida puede ser intrínseca (es decir, primario) o adquirido (es decir, secundaria). Resistencia intrínseca describe de nuevo la falta de respuesta a la terapia, mientras que resistencia secundaria se produce después de un período de respuesta a drogas tratamiento⁷. Esta última es causada por brotes de cohortes pequeñas de las células del tumor dentro de la mayor parte del tumor primitivo o ubicada en lugares anatómicos crípticos distales, exhibiendo hasta el 90% resistencia a uno o más dirigidos a agentes terapéuticos. Mecanismos moleculares que subyacen a un desarrollo de la resistencia a la terapia dirigida principalmente resultan de mutaciones en el gen blanco y redundante activación de otras vías de señalización de supervivencia Pro, cuya comprensión todavía está lejos de completo⁸.

En este trabajo, propone un enfoque de tiempo y costo efectiva para investigar en vitro los mecanismos de resistencia adquirida a agentes terapéuticos dirigidos, a partir de la generación de subclones celulares resistente a los medicamentos a la descripción de silenciamiento procedimientos utilizados para la restauración de la sensibilidad al inhibidor, una herramienta crucial para probar y validar las hipótesis de trabajo. En particular, nuestro acercamiento fue utilizado para investigar, en el cáncer gástrico, los mecanismos de resistencia al trastuzumab (por ejemplo, Herceptin), un anticuerpo monoclonal humanizado contra el dominio extracelular de HER2 proteína⁹. Trastuzumab + quimioterapia es ampliamente aceptado como el tratamiento estándar de primera línea para cáncer de mama metastásico HER2-positivo. Gracias a recientes estudios preclínicos demostrando anti-HER2 terapias tienen actividad significativa en ambos en vitro y en vivo positivo para HER2 cáncer de estómago modelos^10,11, fármacos moleculares dirigidas a HER2 han sido examinado extensamente en ensayos clínicos, algunos de los cuales están todavía en curso, en pacientes con cáncer gastroesofágico^12,13,14,15.

Estos estudios han hecho hincapié en el creciente número de pacientes que experimentan resistencia a trastuzumab¹⁶, similar a lo observado por otros inhibidores de la terapéuticas específicas. En particular, la tasa de respuesta de trastuzumab fue de 47% y la mediana de supervivencia global para pacientes con trastuzumab + quimioterapia fue superior para los pacientes en quimioterapia solo¹⁷sólo 2,7 meses. Esto sugiere que mientras que la resistencia al trastuzumab primaria predomina, la resistencia al trastuzumab secundaria es inevitable. Por esta razón, hay necesidad urgente de aclarar los mecanismos que causan la resistencia de la terapia dirigida HER2 en cáncer gástrico, que es aún más problemático dada la heterogeneidad genética intra tumoral de esta neoplasia¹⁸.

Además, mecanismos de resistencia al trastuzumab en el cáncer gástrico han probado difíciles de explicar, parcialmente debido a la dificultad en la obtención de representante de modelos preclínicos confiable de esta condición. Oshima et al reportó un método de selección en vivo de líneas celulares de cáncer gástrico trastuzumab-resistente, que consiste en una cultura repetida de una pequeña metástasis peritoneal residual después del tratamiento con trastuzumab¹⁹. Sin embargo, la necesidad de un recinto, de conocimientos específicos manejo de animales y de la aprobación del Comité de ética Animal contribuyó a lo que es un método de consumo de tiempo y costo. El enfoque se describe en este trabajo es simple y ampliamente aplicables y podría ampliarse fácilmente para investigar los mecanismos de resistencia a otras drogas terapéuticas en el tumor diferentes histotypes²⁰.

Protocolo

Nota: Este protocolo ha sido ajustada específicamente para el análisis de los mecanismos subyacentes de resistencia adquirida a trastuzumab de líneas de células de cáncer gástrico HER positivo. Todos los instrumentos de laboratorio necesitados son informados en la Tabla de materiales.

1. generación de Subclones resistentes a terapia específicas

Nota: Este es el más crítico y difícil de estandarizar el paso en el protocolo debido a que diferentes líneas celulares pueden exhibir diferentes sensibilidades para el inhibidor de la terapéutico dirigido independientemente de su concentración de tumor histotype o drogas utilizado.

1. Cultivo celular NCI-N87 línea en Medio RPMI suplementado con suero de ternera fetal (10%) y glutamina (2 mM, 1%), como una monocapa a 37 ° C y semillas en frascos de cultivo de 25 cm² .
2. Añadir al medio de cultivo en cada frasco 10 μg/mL de trastuzumab como la dosis inicial. Exponer las células a la dosis inicial hasta que reanudar el crecimiento.
   Nota: La dosis inicial de inhibidor de la terapia dirigida debe ser 10 veces menor que su concentración máxima del plasma. Concentración máxima del plasma es el más alto nivel de concentración de la droga detectada en sangre paciente generalmente después de múltiples dosis de la terapia estándar. Este valor puede ser obtenido de estudios sobre farmacocinética.
3. Monitor de crecimiento de la célula con el método de exclusión azul de tripano; Cuando se reanuda el crecimiento celular (típicamente después de un período de dos a tres semanas), exponer las células a una 10 veces mayor concentración de la dosis de trastuzumab.
4. Exponer las células a una progresiva dosis de trastuzumab (de 100 μg/mL a 400 μg/mL) hasta las células seguir creciendo (después de 2 semanas) a pesar de la presencia de una concentración alta de drogas (por lo menos 2.5 - 4 más alto que el pico de plasma).
5. Realizar un análisis clonogenic para evaluar el nivel de resistencia a la terapia dirigida en cada cambio en la concentración de inhibidor de la terapia de destino en el medio de cultivo y definir resistencia relativa IC₅₀ índice (RR IC₅₀) como sigue.
   1. La semilla 500 células en placas de varios pocillos cultura 24.
      Nota: 5 pozos deben estar preparados para cada conjunto de condiciones.
   2. Exponer las células a concentraciones de inhibidor (trastuzumab) de terapia de destino cada vez mayor de 100 μg/mL hasta 400 μg/mL.
   3. Incubar las células en una incubadora de CO₂ a 37 ° C durante 15 días.
   4. Después de la incubación, fijar y teñir las muestras como sigue.
      1. Eliminar las células medio y enjuague con 10 mL 1 x PBS. Quite 1 x PBS y agregue 2-3 mL de solución de fijación (ácido acético: metanol, (vol/vol) y 1:7). Retirar la solución de fijación y agregue solución de violeta cristal 0,5%. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h
      2. Retire con cuidado la solución de cristal violeta por aspiración con una pipeta y sumergir las placas en agua del grifo para enjuagar los residuos de la solución de cristal violeta. Secar a temperatura ambiente hasta por 2 días.
   5. Contar las colonias de más de 50 células usando un microscopio invertido (4 aumentos).
      Nota: Dos observadores independientes necesarios para ello.
   6. Calcular el RR IC₅₀ como el cociente entre el valor de IC₅₀ de células subclone blanco-terapia-resistente y el valor de las células originales/ingenuo.

2. validación protocolo para el candidato dirigidos terapia gen de resistencia (genes R)

Nota: Después de la caracterización de la expresión génica, firmas asociadas con la resistencia adquirida a la terapia de destino y cualquier gene del candidato como conductor de la resistencia se investigarán a través de: a) RT-PCR y b) Western blot análisis.

1. RT-PCR en tiempo real
   1. Extraiga el ARN total de las líneas celulares usando ácido Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo mezcla (véase Tabla de materiales).
   2. Realizar reacciones de transcripción inversa (RT) usando random hexamer primers y termociclador del siguiente manera: cebado a 25 ° C por 5 min, RT a 46 ° C por 20 min y la inactivación de RT a 95 ° C durante 1 minuto.
   3. Uso 400 ng de RNA total para una reacción de 20 μl. Preparar la mezcla de reacción para la muestra como sigue: 7 μl Rnasa free H₂O, 2 μl cADN (10 ng/μL), 1 μl 20 x fluorescente marcado específico del destino sonda y 10 μl 2 x Mix que contiene tampón dNTPs y polimerasa de la DNA (véase Tabla de materiales).
   4. Añadir 20 μl de la mezcla de reacción a cada placa de la pozo y ejecutar el siguiente programa: que etapa a 50 ° C por 2 min, a 95 ° C por 10 min (1 ciclo); luego de 40 ciclos a 95 ° C por 15 s y a 60 ° C durante 1 minuto.
2. Mancha blanca /negra occidental
   1. Recupera las suspensiones celulares, añadir 2 mL de solución de tripsina/EDTA 0.05% y permitiendo que el 2-3 min para la tripsina trabajar.
   2. Añadir 2 volúmenes de medio con 10% suero fetal bovino para neutralizar la tripsina (p. ej., 2 mL de medio por cada 1 mL de tripsina) y centrifugar a 1.200 x g por 5 min descartar sobrenadante y lavar las células con PBS 1 x fría.
   3. Centrifugar a 1.200 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante. Resuspender el sedimento celular con tampón de lisis y se incuba en un eje de balancín a 4 ° C por 30 min.
      1. La cantidad de tampón de lisis depende del número de células (e.g., 100 μl de 1 x 10⁶ células); Asegúrese de preparar el tampón de lisis fresco cada vez. Para 1 mL de la preparación de buffer de lisis (deje en el hielo): utilizar 975 μl M-por tampón lisado mamífero, 15 inhibidores de proteasa y fosfatasa μl y 10 μl 100 μm PMSF inhibidores.
   4. Recuperar la proteína sobrenadante por centrifugación lisado celular a 13.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos.
   5. Determinar las concentraciones de proteína mediante un análisis de proteína BCA.
   6. Añadir 4 x LaemmLi Sample Buffer para muestras de proteína (por lo menos 20-30 μg de la proteína) y el calor a 100 ° C durante 3 minutos.
   7. Usar geles prefabricados 4-20% y de carga 20-30 μg proteína de solución de LaemmLi y 5-10 μl de proteína estándar por muestra.
   8. Llenar el anillo de Western blot con tampón de TRIS/GLICYNE /SDS x 1 y ejecuta gel a 110 V por 30-60 min (cuando el tiempo detiene Verifique que el tinte ha llegado al final del gel, de lo contrario correr unos minutos adicionales)
   9. Electroblot para transferir proteínas a una membrana PVDF (véase Tabla de materiales) usando un sistema semiseco.
   10. Bloquear la membrana remojando en la solución de proteína adecuada (leche/BSA 5%) en el agitador a temperatura ambiente durante 1 hora.
   11. Hacer una solución de 1: 400 con el anticuerpo primario anti-IQGAP1 en una solución de leche de 5% (véase Tabla de materiales).
   12. Colocar la membrana en solución de anticuerpo primario en un agitador en un cuarto frío durante la noche.
   13. Al día siguiente, eliminar la solución de anticuerpo y remojar en la solución de TBS T 1 x (1 x T-TBS: 1 x Tris Buffer salina añadido por Tween20 0.1%) en un agitador a temperatura ambiente durante 7 minutos.
   14. Descartar T-TBS 1 x solución y volver a colocar. Repita 3 veces.
   15. Hacer una solución de anticuerpo secundario de ratón de 1: 10,000 mediante la adición de anticuerpos para el estándar occidental blot detección (véase Tabla de materiales) y colocar la membrana en una coctelera; dejar a temperatura ambiente durante 2 h.
   16. Deseche la solución de anticuerpo y sumerja en solución de 1 x T-TBS en un agitador a temperatura ambiente durante 7 minutos.
   17. Descartar T-TBS 1 x solución y volver a colocar. Repita 3 veces.
   18. Remoje la membrana 5 minutos en una solución quimioluminiscente y la membrana en un toner de la quimioluminescencia de la imagen.

3. restauración objetivo tratamiento inhibidor de la sensibilidad por candidato R-gene Knock-down

1. Preparación de la célula
   1. Preparar suspensión unicelular por tripsinización. Realizar la transfección en el día en que las células se platean.
      1. Lavar NCI-N87 células con PBS e incubar a 37 ° C con la solución de tripsina/EDTA 0,05% durante 5-10 min 2 añadir volumen de RPMI medio con 10% suero fetal bovino para neutralizar la tripsina (p. ej., 2 mL de medio por cada 1 mL de tripsina).
      2. Contar celdas con un hemocitómetro con tinción de azul de tripano. Semilla de 2.5 x 10⁵ las células (confluencia del 60%) en un matraz de² cm T25 para cada condición.
         Nota: El número adecuado de células para la siembra está determinado por el tiempo de duplicación de la línea celular y de la duración del experimento. El objetivo es lograr el gene de la blanco de la precipitación para toda la duración del experimento. Nueve frascos de² de cm T25 son ideales para condiciones de transfección y el análisis clonogenic (3 frascos de controles, 3 frascos para controles de transfección negativo, 3 frascos de transfección de genes objetivo).
2. Inversa de la transfección
   1. Preparar el gene blanco y negativos control mezcla de transfección para cada frasco de² cm T25 como sigue.
      1. Diluir 12,5 μl de cada gene targeting siRNA OLIGONUCLEÓTIDOS oligonucleótidos de siRNA Control negativo en medio mínimo esencial transfección (relación 1:55; Véase Tabla de materiales).
      2. Añadir un reactivo de transfección de liposoma catiónico (proporción 1:1 con oligonucleótidos gene targeting de siRNA; véase Tabla de materiales). Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
         Nota: El volumen total de la mezcla de la transfección es 700 μl.
      3. Añadir 700 μl de la mezcla de transfección a cada frasco de² cm T25. Incube las células a 37 ° C durante 1-3 días.
   2. Verificar gene knock-down por RT-PCR y análisis de Western blot. Vuelva a verificar el impacto de la supuesta gen R de la precipitación en la restauración de la sensibilidad al agente terapéutico dirigido a través de experimentos de formación de Colonia (repetir paso 1.5).

Resultados

Figura 1 describe el marco del procedimiento experimental. Tres cáncer gástrico-líneas celulares expresan un alto nivel de HER2 y sensible al trastuzumab (IC₅₀ < nivel del plasma del pico del gráfico izquierdo drogas, figura 2A,) fueron cultivadas en medio de cultivo que contiene el agente terapéutico específico. Una dosis 10 veces menor que la concentración máxima del plasma de trastuzumab (10 μg/mL) como dos...

Discusión

Personalizado y dirigido terapias han suscitado entusiasmo creciente, estas supuestas terapias 'inteligentes' enfrentan el mismo obstáculo importante como drogas de la quimioterapia tradicional, es decir, la adquisición rápida e impredecible de la farmacorresistencia. Para mejorar los resultados de la terapia dirigida, deben resolverse problemas de resistencia a los fármacos a través de una mejor comprensión de los mecanismos que las causan. Aquí, presentamos una metodología ampliamente accesible en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection