Ищет пути водитель приобрела устойчивость к таргетной терапии: лекарственно Subclone поколения и чувствительность, восстановление генов нокдаун

Резюме

Это время - и экономичным в vitro протокол, изучение механизмов приобретенных сопротивление целевых терапевтических агентов, который является весьма неудовлетворенный медицинского управления рака.

Аннотация

В последние два десятилетия стали свидетелями перехода от цитотоксических препаратов для целенаправленной терапии в медицинской онкологии. Хотя целевых терапевтических агентов показали более впечатляющим клинической эффективности и минимизация побочных эффектов, чем традиционные методы лечения, лекарственной устойчивости стал основным ограничением для их преимущества. Были разработаны несколько доклинических/в пробирке/в естественных условиях модели приобретенных сопротивления целевых агентов в клинической практике главным образом с помощью двух стратегий: i) генетические манипуляции для моделирования генотипов приобретенных сопротивления, и ii) в пробирке / в естественных условиях выбор устойчивых моделей. В настоящей работе мы предлагаем объединяющей основы, для изучения основных механизмов, ответственных за приобретенные сопротивление целевых терапевтических агентов, начиная от поколения лекарственно-клеточных subclones к описанию глушителей процедуры, используемые для восстановления чувствительности к ингибитор. Этот простой времени и экономичным подход широко применяется и может быть легко расширена для изучения механизмов сопротивления для других целевых лечебных препаратов в различных опухолевых histotypes.

Введение

Вслед за важнейших открытий в области молекулярной и клеточной биологии, был разработан ряд Роман синтезированных молекул противораковые выборочно целевой онкогенные сигнальные пути в широкий спектр типов опухолей. В частности две категории целевых терапевтических агентов с уникальными свойствами в онкологии, а именно синтетические химические соединения и рекомбинантного моноклональные антитела, известны достигли клинических успехи и значительно изменены рака уход в последние десятилетия^1,2,3.

Тем не менее несмотря на их впечатляющие первоначальный ответ на лечение, большинство больных раком разработали лекарственной устойчивости для всех целевых терапевтических агентов, моноклональных антител и ингибитора киназы. Как следствие лекарственной устойчивости, основным препятствием для⁴классические противораковых лекарств, по-прежнему является большой проблемой для новых целевых терапии^5,6.

Сопротивление для целенаправленной терапии может быть внутренней (то есть, основной) или приобретенных (т.е., среднее). Внутренние сопротивления описывает de novo , отсутствие ответа на терапию, тогда как среднее сопротивление происходит после периода ответ наркотиков лечения⁷. Последний вызванных вспышки небольшой когорты опухолевых клеток в основную часть примитивные опухоли или расположенный в дистальной загадочные анатомические нишах, экспонирования до 90% сопротивление одного или более целевых терапевтических агентов. Молекулярные механизмы, лежащие в основе развития резистентности к таргетной терапии главным образом в результате мутации гена целевой и избыточных активация других про выживание сигнальных путей, чьё понимание все еще далека от полной⁸.

В этой работе мы предложили времени и экономичным подход к расследованию в vitro механизмы приобретенных сопротивления целевых терапевтических агентов, начиная от поколения лекарственно-клеточных subclones к описанию глушителей процедуры, используемые для восстановления чувствительности к ингибитор, одним из важнейших инструментов, используемых для тестирования и проверки рабочей гипотезы. В частности наш подход был использован для расследования, в рак желудка, сопротивление механизмы (например, Герцептин), трастузумаб гуманизированные моноклональные антитела против внеклеточного домена белок HER2⁹. Трастузумаб + химиотерапии широко признается как стандарт первой линии лечения для HER2-позитивных метастатическим раком молочной железы. Благодаря последние доклинические исследования, показывающие, что анти HER2 терапии имеют значительную активность в обоих в пробирке и в естественных условиях HER2-положительным раком желудка моделей^10,11, молекулярной ориентации HER2 наркотиков были подробно рассмотрены в клинических испытаниях, некоторые из которых еще продолжаются, на больных с гастроэзофагеальной рака^12,13,14,15.

Эти исследования подчеркивается рост числа пациентов, которые испытывают сопротивление трастузумаб¹⁶, подобно к что характерно для других целевых терапевтических ингибиторов. В частности ответ трастузумаб составлял 47%, а средний общей выживаемости пациентов на трастузумаб + химиотерапии был только 2.7 месяца дольше, чем для пациентов химиотерапия только¹⁷. Это свидетельствует о том, что хотя преобладает первичной трастузумаб сопротивление, сопротивление вторичной трастузумаб неизбежна. По этой причине существует настоятельная необходимость уточнить механизмы, вызывая HER2-целевой терапии сопротивление в рак желудка, которая еще более проблематичным, учитывая интра опухолевой генетической гетерогенностью данного неоплазии¹⁸.

Кроме того механизмы сопротивления трастузумаб в рак желудка оказались сложно объяснить, частично из-за трудностей в получении надежных доклинических моделей представитель этого состояния. Осима et al. сообщили в естественных условиях выбора метода трастузумаб стойкие рака желудка клеточных линий, состоящий из повторяющихся культуры малых остаточных перитонеальных метастазов после лечения с трастузумаб¹⁹. Однако необходимость корпуса, конкретных животных обработки знаний и одобрения Комитета по этике животных способствовали его времени и стоимости метод. Подход, который мы расскажем в этой работе является простым и широко применимы и может быть легко расширена для изучения механизмов сопротивления для других лечебных препаратов в различных опухолевых histotypes²⁰.

протокол

Примечание: Этот протокол специально настроен для анализа механизмов, лежащих в основе приобретенных сопротивление трастузумаб HER-положительным раком желудка клеточных линий. Все лабораторные инструменты сообщается в Таблице материалов.

1. поколение целенаправленной терапии устойчивостью Subclones

Примечание: Это наиболее критический и трудно стандартизировать шаг в протоколе, с тем, что различных клеточных линий могут демонстрировать различные чувства в целевых терапевтических ингибитор независимо от их опухоли histotype или наркотиков концентрации используется.

1. Культура клеток NCI-N87 линия в среде RPMI, дополненная плода телячьей сыворотки (10%) и глютамин (2 мм, 1%), как монослоя при 37 ° C и семени его на 25 см² культуры колбы.
2. Добавьте на носитель культуры в каждом колбе 10 мкг/мл трастузумаб как стартовая доза. Разоблачить клетки в начальной дозе до тех пор, пока они возобновить рост.
   Примечание: Начальная доза ингибитора таргетная терапия должна быть в 10 раз ниже, чем его пик концентрации в плазме. Пик концентрации в плазме является высокий уровень концентрации препарата в крови пациента обычно после нескольких доз стандартной терапии. Это значение можно получить из исследования фармакокинетики.
3. Контролировать рост клеток с методом исключения Трипановый синий; При возобновлении роста клеток (обычно после периода от двух до трех недель) предоставляют клетки в 10 раз выше концентрации дозы трастузумаб.
4. Разоблачить клетки постепенно увеличивая дозу трастузумаб (от 100 мкг/мл до 400 мкг/мл) до клетки держать растущий (примерно через 2 недели), несмотря на наличие наркотиков высокой концентрации (по крайней мере 2,5 - 4 раза выше, чем пик плазмы).
5. Выполните колониеобразования пробирного оценить уровень сопротивления для целенаправленной терапии на каждое изменение концентрации ингибитора целевой терапии в среде культуры и определить относительную устойчивость IC₅₀ индекс (ОР IC₅₀) следующим образом.
   1. Семя 500 клеток в 24 несколькими хорошо культуры пластин.
      Примечание: 5 скважин должны быть готовы для каждого состояния набора.
   2. Подвергайте увеличение концентрации ингибитора (трастузумаб) целевой терапии клетки от 100 мкг/мл до 400 мкг/мл.
   3. Инкубируйте клетки в инкубатор CO₂ при 37 ° C на 15 дней.
   4. После инкубации исправить и пятен образцы следующим образом.
      1. Удаление средних и промыть клетки с PBS 1 x 10 мл. Удаление ПБС и добавить 2-3 мл раствора фиксации (уксусной кислоты: метанол, 1:7, (vol/vol)). Удаление решения фиксации и добавить 0,5% раствор Фиолетовый Кристалл. Инкубации при комнатной температуре на 2 ч
      2. Тщательно удалите решение Фиолетовый Кристалл, аспирационных с пипеткой и погрузить плиты в водопроводной воды, чтобы смыть остатки раствора Фиолетовый Кристалл. Просушите при комнатной температуре до 2 дней.
   5. Граф колонии более чем 50 клеток с помощью инвертированного микроскопа (4 X увеличение).
      Примечание: Для этого необходимы два независимых наблюдателей.
   6. Вычислить RR IC₅₀ как соотношение между значением₅₀ IC целевой терапии-устойчивых к subclone клеток и значения ячеек оригинал/наивными.

2. Проверка протокола для кандидата целевой терапии сопротивление ген (R-гена)

Примечание: После характеристика экспрессии генов, подписи связанные с приобретенных сопротивление целевой терапии и любой кандидат ген как водитель сопротивления будут расследоваться через: RT-PCR) и b) западного анализа помаркой.

1. RT-ПЦР в реальном времени
   1. Извлечение всего РНК из клеточных линий, с помощью кислоты Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ смеси (см. Таблицу материалы).
   2. Выполнение обратной транскрипции (RT) реакции с использованием случайных hexamer грунты и установите тепловая велосипедист следующим: грунтовка при 25 ° C за 5 мин, RT на 46 ° C в течение 20 мин и инактивации RT на 95 ° C в течение 1 мин.
   3. Использование 400 нг всего РНК реакции 20 мкл. Подготовьте смесь реакции для образца следующим: 7 мкл РНКазы бесплатно H₂O 2 мкл cДНК (10 нг/мкл), 1 мкл 20 x помечены флуоресцентных зондов целевой объект специфического и 10 мкл 2 x Mix содержащие буфер, дНТФ и ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалы).
   4. 20 мкл реакционной смеси каждый хорошо пластины и запустите следующую программу: проведение этапа при 50 ° C на 2 мин., на 95 ° C в течение 10 мин (1 цикл); затем в 40 циклов при 95 ° C 15 s и при 60 ° C за 1 мин.
2. Западная помарка
   1. Восстановите клеточных суспензий, добавив 2 мл 0,05% раствора трипсина/ЭДТА и позволяя 2-3 мин для трипсина работать.
   2. Добавьте 2 тома средних содержащий 10% плода бычьим сывороточным нейтрализовать трипсина (например, 2 мл среды для каждого 1 мл трипсин) и центрифуги на 1200 x g для 5 минут удалить супернатант и вымыть клетки с холодной ПБС.
   3. Центрифуга на 1200 x g 5 минут и удалить супернатант. Ресуспензируйте клетки лепешка с буфера lysis и инкубировать на рокер на 4 ° C на 30 мин.
      1. Объем буфера lysis зависит количество клеток (например, 100 мкл для 1 х 10⁶ клеток); Убедитесь, что готовить свежие литического буфера каждый раз. 1 мл препарата буфера lysis (отпуск на льду): используйте 975 мкл М-за млекопитающих lysate буфер, 15 мкл ингибиторы протеазы и фосфатазы и 10 µL 100 мкм PMSF ингибиторов.
   4. Восстановите супернатанта белка центрифугированием lysate клетки на 13 000 x g при 4 ° C на 15 мин.
   5. Определите концентрацию белка, используя assay протеина BCA.
   6. Добавьте 4 x буфер Лэмли образца образцы протеина (по крайней мере 20-30 мкг белка) и тепла при 100 ° C на 3 мин.
   7. Использование сборного 4-20% гели и загрузить 20-30 мкг Лэмли белка раствора и 5-10 мкл белка стандарта на сэмпл.
   8. Заполните иммуноблоттинга кольцо с буфера TRIS/GLICYNE /SDS 1 x и Побегите гель на 110 V за 30-60 мин (когда время останавливается, убедитесь, что краска достиг конца геля, в противном случае баллотироваться на несколько дополнительных минут)
   9. Electroblot для передачи белка в PVDF мембрану (см. Таблицу материалы) с помощью полусухие системы.
   10. Блокировать мембраны путем замачивания в решении соответствующих белков (5% молока/BSA) шейкер при комнатной температуре за 1 ч.
   11. Сделайте раствор 1: 400 с основного антитела анти IQGAP1 в 5% растворе молока (см. Таблицу материалы).
   12. Место мембрану в раствор первичных антител на шейкер в холодной комнате на ночь.
   13. На следующий день, удалить раствор антител и Замочите в растворе T-TBS 1 x (1 x T-TBS: 1 х добавлен физиологический буфера Tris Tween20 0,1%) на шейкер при комнатной температуре за 7 мин.
   14. Отказаться от T-TBS 1 x решения и заменить. Повторите 3 раза.
   15. Сделать мэм раствор вторичных мыши антител, добавив антитела для стандартной западной помарки обнаружения (см. Таблицу материалы) и мембраны на шейкер; Оставьте при комнатной температуре в течение 2 ч.
   16. Отменить раствор антител и Замочите в растворе 1 x T-TBS на шейкер при комнатной температуре за 7 мин.
   17. Отказаться от T-TBS 1 x решения и заменить. Повторите 3 раза.
   18. Замочите мембрана для 5 минут в растворе хемилюминесцентный и изображение мембраны на тепловизор хемилюминесценции.

3. Восстановление целевой терапии ингибитором чувствительность, кандидат R-генов нокдаун

1. Подготовка клетки
   1. Подготовьте одну ячейку подвеска, trypsinization. Выполняют трансфекции в день, что покрытие клетки.
      1. Вымойте NCI-N87 клетки с PBS и инкубировать при 37 ° C с 0,05% раствор трипсина/ЭДТА на 5-10 минут добавить 2 объем RPMI средних содержащий 10% плода бычьим сывороточным для нейтрализации трипсина (например, 2 мл среды для каждого 1 мл трипсин).
      2. Подсчет количества ячеек с Горяева, с помощью окрашивания Трипановый синий. Семян 2,5 x 10⁵ клеток (60% слияния) на колбе T25 см² для каждого условия.
         Примечание: Соответствующее количество клеток для заполнения определяется время удвоения клеток линии и продолжительность эксперимента. Цель заключается в достижении целевых генов нокдаун для всей продолжительности эксперимента. Девять T25 см² фляги идеальны для transfection условий и пробирного колониеобразования (3 колбы для элементов управления, 3 колбы для отрицательных трансфекции элементов управления, 3 колбы для transfection ген целевой).
2. Обратный Трансфекция
   1. Подготовить ген целевой и негативные управления трансфекции смесь для каждого T25 см² настой следующим.
      1. Разбавьте 12,5 мкл каждого олигонуклеотиды гена ориентации малых интерферирующих РНК или отрицательный контроль siRNA олигонуклеотиды в среде минимальным необходимым трансфекции (соотношение 1:55; см. Таблицу материалы).
      2. Добавление реагента трансфекции Катионный липосомы (соотношение 1:1 с олигонуклеотиды гена таргетинг siRNA; см. Таблицу материалы). Инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин.
         Примечание: Общий объем трансфекции смеси составляет 700 мкл.
      3. Мкл 700 трансфекции смеси для каждой T25 фляга² см. Инкубируйте клетки при 37 ° C 1-3 дней.
   2. Проверка генов нокдаун RT-PCR и Западный анализ помаркой. Перепроверить воздействия предполагаемого R-Джин НОК Даун на восстановление чувствительности целевой терапевтического агента через эксперименты формирования колонии (повторите шаг 1.5).

Результаты

Рисунок 1 излагаются основы экспериментальной процедуры. Три рака желудка-линии клетки выражая высокий уровень HER2 и чувствительны к трастузумаб (IC₅₀ < пик плазменный уровень препарата, рисунок 2A, левый график) были выращены в питат?...

Обсуждение

В то время как персонализированные и целевой терапии вызвали рост энтузиазм, эти так называемые «умные» терапии лицом же главным препятствием как традиционных химиотерапевтических препаратов, т.е., быстрых и непредсказуемых приобретение лекарственной устойчивости. Чтобы улучши?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection