À procura de caminhos de Driver do adquiriu resistência à terapia-alvo: geração de Subclone resistentes aos medicamentos e sensibilidade restaurando pelo Gene Knock-down

Resumo

Este é um protocolo de tempo - e cost - effective em vitro investigando os mecanismos de resistência adquirida aos agentes terapêuticos alvo, que é uma necessidade médica altamente insatisfeita na gestão de câncer.

Resumo

Nas últimas duas décadas têm visto a troca de drogas citotóxicas para terapia-alvo em Oncologia Médica. Embora alvo de agentes terapêuticos têm demonstrado eficácia clínica mais impressionante e minimizados os efeitos adversos do que os tratamentos tradicionais, resistência a drogas tornou-se a principal limitação para seus benefícios. Vários modelos pré-clínicos/in vitro/in vivo da resistência adquirida aos agentes alvo na prática clínica foram desenvolvidos principalmente por meio de duas estratégias: i) genéticas para genótipos de resistência adquirida e ii) in vitro de modelagem / vivo em seleção de modelos resistentes. No presente trabalho, propomos um quadro unificador, para investigar os mecanismos subjacentes responsáveis pela resistência adquirida ao alvo agentes terapêuticos, a partir da geração de subclones celulares resistentes à descrição do silenciar os procedimentos utilizados para restaurar a sensibilidade ao inibidor. Este tempo - e cost - effective abordagem simples é amplamente aplicável e pode ser facilmente estendida para investigar mecanismos de resistência a outras drogas terapêuticas alvo no tumor diferente histotypes.

Introdução

Acompanhando as descobertas cruciais em biologia molecular e celular, um número de novas moléculas anticâncer sintetizados foram desenvolvido para alvejar seletivamente vias de sinalização oncogênicas em uma ampla gama de tipos de tumor. Em particular, duas categorias de agentes terapêuticos direcionados com propriedades únicas em Oncologia, os compostos químicos sintéticos ou seja e recombinantes anticorpos monoclonais, são conhecidos por alcançaram sucessos clínicos e tratamento do câncer drasticamente alterado em últimas décadas^1,2,3.

No entanto, apesar de sua impressionante resposta inicial ao tratamento, a maioria dos pacientes com câncer desenvolveram resistência aos medicamentos para todos os agentes terapêuticos direcionados, ambos anticorpos monoclonais e inibidores da quinase. Como consequência, a resistência às drogas, o principal obstáculo para clássico medicamentos anti-câncer⁴, ainda é um grande desafio para emergentes terapias alvo^5,6.

Resistência à terapia-alvo pode ser intrínseca (ou seja, primário) ou adquirido (ou seja, secundário). Resistência intrínseca descreve uma novo de falta de resposta à terapia, Considerando que a resistência secundária ocorre após um período de resposta a drogas tratamento⁷. Este último é causado por surtos de coortes pequenas de células tumorais dentro da massa do tumor primitivo ou aninhado em nichos anatômicos crípticos distais, exibindo até 90% de resistência a um ou mais alvo agentes terapêuticos. Mecanismos moleculares subjacentes a um desenvolvimento de resistência à terapia-alvo principalmente resultam de mutações do gene alvo e redundante ativação de outras vias de sinalização de pro-sobrevivência, cuja compreensão está ainda longe de ser completa⁸.

Neste trabalho, propusemos uma abordagem tempo - e cost - effective para investigar em vitro mecanismos de resistência adquirida aos agentes terapêuticos direcionados, a partir da geração de subclones celulares resistentes para a descrição de silenciamento procedimentos utilizados para restaurar a sensibilidade para o inibidor, uma ferramenta crucial, usado para testar e validar as hipóteses de trabalho. Em particular, a nossa abordagem foi usada para investigar, no câncer gástrico, os mecanismos de resistência ao trastuzumab (por exemplo, Herceptin), um anticorpo monoclonal humanizado, visando o domínio extracelular do HER2 proteína⁹. Trastuzumabe + quimioterapia é amplamente aceito como o tratamento padrão de primeira linha para câncer de mama metastático HER2-positivo. Graças a recentes estudos pré-clínicos mostrando esse anti-HER2 terapias têm atividade significativa em ambas em vitro e em vivo HER2-positivo câncer gástrico modelos^10,11, drogas moleculares visando HER2 têm sido extensivamente examinada em ensaios clínicos, alguns dos quais ainda estão em andamento, em pacientes com câncer de gastroesofágico^12,13,14,15.

Estes estudos têm enfatizado o número crescente de pacientes enfrentando resistência ao Trastuzumabe¹⁶, semelhante ao que é observado por outros inibidores alvo terapêuticos. Em particular, a taxa de resposta de Trastuzumabe foi de 47%, e a sobrevivência global mediana para os pacientes na Trastuzumabe + quimioterapia foi apenas 2,7 meses mais do que para pacientes em quimioterapia só¹⁷. Isto sugere que enquanto resistência primária Trastuzumabe é prevalente, resistência secundária Trastuzumabe é inevitável. Por esta razão, há uma urgente necessidade de esclarecer os mecanismos causando resistência terapia HER2-alvo em câncer gástrico, que é ainda mais problemático, dada a heterogeneidade genética intra-tumoral desta neoplasia¹⁸.

Além disso, mecanismos de resistência ao Trastuzumabe no câncer gástrico provaram-se difíceis de explicar, parcialmente devido à dificuldade na obtenção de representante confiável modelos pré-clínicos desta condição. Oshima et al relataram um método de seleção em vivo de linhas de células de câncer gástrico trastuzumab-resistente, consistindo de uma cultura repetida de uma pequena metástase peritoneal residual após o tratamento com Trastuzumabe¹⁹. No entanto, a necessidade de um gabinete, de conhecimentos de manipulação de animais específicos e da aprovação do Comitê de ética Animal contribuiu para torná-lo um método demorado e custo. A abordagem que descrevemos neste trabalho é simples e amplamente aplicável e pode ser facilmente estendida para investigar os mecanismos de resistência a outras drogas terapêuticas em diferentes tumor histotypes²⁰.

Protocolo

Nota: Este protocolo foi especificamente ajustado para a análise dos mecanismos subjacentes a resistência adquirida ao Trastuzumabe de linhas de células de câncer gástrico HER-positivo. Todos os instrumentos de laboratório necessários são relatados na Tabela de materiais.

1. geração de alvo Subclones resistente à terapia

Nota: Este é o mais crítico e difícil padronizar passo no protocolo, devido ao fato de que linhagens celulares diferentes podem apresentar diferentes sensibilidades ao alvo terapêutico inibidor independentemente de sua concentração de histotype ou drogas de tumor usado.

1. Cultura NCI-N87 célula linha em meio RPMI suplementado com soro fetal de bezerro (10%) e glutamina (2 mM, 1%), como uma monocamada a 37 ° C e isso de sementes em frascos de cultura 25 cm² .
2. Adicione ao meio de cultura em cada balão 10 µ g/mL de trastuzumab como a dose inicial. Expor as células para a dose inicial até eles continuar crescendo.
   Nota: A dose inicial do inibidor terapia-alvo deve ser 10-fold inferior a sua concentração plasmática de pico. Concentração plasmática de pico é o mais alto nível de concentração do fármaco detectado no sangue de pacientes habitualmente após múltiplas doses de terapia padrão. Esse valor pode ser obtido em estudos de farmacocinética.
3. Monitorar o crescimento de células com o método de exclusão trypan azul; Quando o crescimento celular é reiniciado (normalmente após um período de duas a três semanas), expor as células a uma concentração de dose 10 vezes maior de Trastuzumabe.
4. Expor as células a uma dose gradualmente crescente de trastuzumab (a partir de 100 µ g/mL a 400 µ g/mL) até manter células crescendo (após cerca de 2 semanas), apesar da presença de uma concentração elevada de drogas (pelo menos 2,5 - 4-fold maior do que o pico de plasma).
5. Realizar um ensaio de clonogenic para avaliar o nível de resistência à terapia-alvo em todas as alterações da concentração do inibidor terapia alvo em meio de cultura e definir o índice de₅₀ de IC de resistência relativo (RR IC₅₀) como segue.
   1. 500 células em 24 placas de cultura multi bem as sementes.
      Nota: 5 poços devem estar preparados para cada conjunto de condições.
   2. Expor as células para o aumento das concentrações de inibidor (trastuzumabe) de terapia de alvo de 100 µ g/mL até 400 µ g/mL.
   3. Incube as células numa incubadora de CO₂ a 37 ° C por 15 dias.
   4. Após a incubação, corrigir e manchar as amostras como segue.
      1. Remova células médio e enxágue com 10 mL 1X PBS. Remover 1X PBS e adicionar 2-3 mL de solução de fixação (ácido acético: metanol, 1:7, (vol/vol)). Remover a solução de fixação e adicionar 0,5% solução de cristal violeta. Incubar a temperatura ambiente por 2 h
      2. Remover a solução de cristal violeta cuidadosamente por aspiração com uma pipeta e mergulhe as placas em água da torneira para enxaguar os resíduos de solução de cristal violeta. Secar em temperatura ambiente por até 2 dias.
   5. Contagem das colónias de mais de 50 células usando um microscópio invertido (ampliação de 4x).
      Nota: Dois observadores independentes são necessários para isso.
   6. Calcule o RR IC₅₀ como a relação entre o valor de IC₅₀ de células alvo-terapia-resistente subclone e o valor das células original/ingênuo.

2. validação protocolo para o candidato alvo terapia resistência o Gene (R)

Nota: Após a caracterização da expressão do gene, assinaturas associadas a resistência adquirida a terapia alvo e qualquer gene candidato como condutor de resistência será investigado por meio de: a) RT-PCR e b) Western blot-análise.

1. RT-PCR em tempo real
   1. Extrair o RNA total de linhas celulares usando a mistura de ácido guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio (ver Tabela de materiais).
   2. Realizar reações de transcrição reversa (RT) utilizando primers aleatórios hexâmero e defina o termociclador como segue: escorva a 25 ° C por 5 min, RT a 46 ° C por 20 min e inativação de RT a 95 ° C por 1 min.
   3. Uso 400 ng de RNA total para uma reação de 20 µ l. Prepare a mistura de reação para amostra da seguinte forma: 7 µ l RNase livre H₂O, 2 µ l cDNA (10 ng / µ l), 1 µ l 20 x sonda fluorescente-etiquetadas do destino-específicos e 10 µ l 2 x mistura contendo tampão, dNTPs e DNA polimerase (ver Tabela de materiais).
   4. Adicionar 20 µ l da mistura de reação para cada prato bem e executar o programa a seguir: segurando o palco a 50 ° C por 2 min, a 95 ° C por 10 min (1 ciclo); Então 40 ciclos a 95 ° C por 15 s e 60 ° c, durante 1 min.
2. Borrão ocidental
   1. Recupere suspensões celulares, adicionar 2 mL de solução de tripsina/EDTA 0,05% e permitindo que 2-3 min para tripsina trabalhar.
   2. Adicione 2 volumes de médio com 10% fetal bovino soro para neutralizar a tripsina (por exemplo, 2 mL do meio para cada 1ml de tripsina) e centrifugar a 1.200 x g, durante 5 min. Discard sobrenadante e lavar as células com frio 1X PBS.
   3. Centrifugar a 1.200 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células com Lise e incubar um basculante a 4 ° C por 30 min.
      1. A quantidade de Lise depende do número de células (por exemplo, 100 µ l de 1 x 10⁶ células); Certifique-se de preparar a Lise fresco cada vez. Para 1 mL da preparação de tampão de lise (deixe no gelo): usar µ l 975 M-por buffer de lisado mamíferos, 15 inibidores de protease e fosfatase µ l e 10 µ l 100 µM PMSF os inibidores.
   4. Recupere a proteína sobrenadante por centrifugação de lisado celular a 13.000 x g a 4 ° C por 15 min.
   5. Determine as concentrações de proteína por meio de um ensaio da proteína do BCA.
   6. Adicione 4 x LaemmLi Sample Buffer de amostras da proteína (pelo menos 20-30 µ g de proteína) e calor a 100 ° C por 3 min.
   7. Geles de pré-moldado 4-20% de usar e carregar 20-30 µ g de solução de proteína LaemmLi e 5-10 µ l de proteína padrão por amostra.
   8. Encher o anel do Western blot com buffer de 1x TRIS/GLICYNE /SDS e funcione o gel em 110 V para 30-60 min (quando o tempo para verificar que o corante chegou ao final do gel, caso contrário, correr por alguns minutos adicionais)
   9. Electroblot para transferir a proteína em uma membrana PVDF (ver Tabela de materiais), usando um sistema semi-seco.
   10. Bloquear a membrana por imersão em solução da proteína adequada (5% de leite/BSA) no agitador à temperatura ambiente durante 1 h.
   11. Faça uma solução de 1: 400 com anticorpo primário anti-IQGAP1 em uma solução de leite de 5% (ver Tabela de materiais).
   12. Lugar da membrana em solução de anticorpo primário em um shaker em uma sala fria durante a noite.
   13. No dia seguinte, descartar a solução de anticorpo e mergulhe numa solução de 1 x T-TBS (1 x T-TBS: 1x tampão salino Tris adicionado por Tween20 0,1%) um agitador, à temperatura ambiente por 7 min.
   14. Descarte o T-TBS 1 x solução e substituir. Repeti 3 vezes.
   15. Fazer uma solução de rato-anticorpo secundário de 1:10,000 pela adição de anticorpos para o padrão ocidental borre deteção (ver Tabela de materiais) e coloque a membrana num agitador; Deixe em temperatura ambiente por 2 h.
   16. Descartar a solução de anticorpo e mergulhe em solução de 1 x T-TBS num agitador, à temperatura ambiente por 7 min.
   17. Descarte o T-TBS 1 x solução e substituir. Repeti 3 vezes.
   18. Mergulhe a membrana por 5 min em uma solução quimioluminescente e imagem a membrana em uma imagem de quimioluminescência.

3. restaurando a sensibilidade de inibidor de terapia-alvo pelo candidato R-gene Knock-down

1. Preparação da pilha
   1. Prepare a suspensão de célula única por tripsinização. Execute a transfeccao no dia em que as células são banhadas.
      1. ICN-N87 lavar as células com PBS e incubar a 37 ° C, com solução de tripsina/EDTA 0,05% de 5-10 min.. adicionar 2 volume de RPMI médio com 10% fetal bovino soro para neutralizar a tripsina (por exemplo, 2 mL do meio para cada 1ml de tripsina).
      2. Contar as células com um hemocytometer usando trypan azul coloração. Semente de 2.5 x 10⁵ células (60% confluência) para um balão de² cm T25 para cada condição.
         Nota: O número adequado de células para semeadura é determinado pelo tempo de duplicação da linha da célula e a duração do experimento. O objectivo é conseguir o gene alvo knock-down para toda a duração do experimento. Nove T25 frascos de² cm são ideais para condições de transfecção e o ensaio de clonogenic (3 frascos para controles, 3 frascos para transfeccao negativo controles, 3 frascos para transfecção do gene-alvo).
2. Reversa do transfection
   1. Prepare-se gene-alvo e negativo mistura de Transfeccao de controle para cada frasco de² cm T25 como segue.
      1. Dilua a 12,5 µ l de cada gene-direcionamento siRNA oligonucleotides ou oligonucleotídeos de siRNA controlo negativo no mínimo essencial transfeccao (proporção 01:55; ver Tabela de materiais).
      2. Adicione um reagente de Transfeccao de lipossomas catiônicos (proporção de 1:1 com gene-direcionamento siRNA oligonucleotides; ver Tabela de materiais). Incube a temperatura ambiente por 20 min.
         Nota: O volume total da mistura do transfection é 700 µ l.
      3. Adicione 700 µ l da mistura do transfection para cada balão de² cm T25. Incube as células a 37 ° C durante 1-3 dias.
   2. Verifique se o gene knock-down por RT-PCR e análise ocidental do borrão. Verifica o impacto do putativo R-gene batida para baixo sobre a restauração de sensibilidade ao agente alvo terapêutico através de experiências de formação de Colônia (repetir passo 1.5).

Resultados

A Figura 1 descreve a estrutura do procedimento experimental. Linhas de células de câncer gástrico de três expressando um alto nível de HER2 e sensível ao trastuzumab (IC₅₀ < nível plasmático de pico do gráfico de drogas, Figura 2A, à esquerda) foram cultivadas em meio de cultura contendo o agente alvo terapêutico. Uma dose 10-fold inferiores a concentração plasmática de pico de trastuzumab (10 µ g/mL) f...

Discussão

Enquanto personalizado e direcionado terapias têm suscitou entusiasmo crescente, estas terapias 'inteligentes' so-called enfrentam o obstáculo principal mesmo como drogas de quimioterapia tradicional, ou seja, a aquisição rápida e imprevisível de resistência às drogas. Para melhorar os resultados da terapia-alvo, os problemas de resistência aos medicamentos devem ser resolvidos através de uma melhor compreensão dos mecanismos que os provocam. Aqui, apresentamos uma metodologia amplamente acessível

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection