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Resumen

Se presenta un protocolo para el desarrollo de un biosensor electroquímico de ADN que comprende un electrodo de carbono nanopartículas modificadas, serigrafiados oro, estabilizado con ácido del poliláctico para la detección de Vibrio parahaemolyticus .

Resumen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) es un patógeno de los alimentos comunes que contribuye a una gran proporción de problemas de salud pública a nivel mundial, que afecten significativamente a la tasa de morbilidad y mortalidad humana. Los métodos convencionales para la detección de V. parahaemolyticus como métodos basados en la cultura, Ensayos inmunológicos y métodos moleculares requieren manejo muestras complicadas y lentas, tediosas y costosas. Recientemente, biosensores han demostrado para ser un método de detección completa y prometedores con las ventajas de la detección rápida, rentabilidad y practicidad. Esta investigación se centra en el desarrollo de un método rápido de detectar V. parahaemolyticus con alta selectividad y sensibilidad usando los principios de hibridación de ADN. En la obra, caracterización de poliláctico sintetizado estabilizado con ácido nanopartículas de oro (AuNPs de PLA) fue alcanzada usando difracción de rayos x (DRX), Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis), microscopia electrónica de transmisión (TEM), emisión de campo Microscopía electrónica (FESEM) y voltametría cíclica (CV). También llevamos a cabo pruebas de estabilidad, sensibilidad y reproducibilidad de las AuNPs PLA. Encontramos que el PLA-AuNPs había formado una sólida estructura de nanopartículas estabilizadas en solución acuosa. También observamos que la sensibilidad mejoró como resultado el menor valor de resistencia (Rct) de transferencia de carga y un aumento del área superficial activa (0,41 cm2). El desarrollo de los biosensores de ADN se basó en la modificación de un electrodo serigrafiados de carbono (SPCE) con PLA-AuNPs y utilizando azul de metileno (MB) como el indicador de redox. Se evaluaron los acontecimientos de inmovilización e hibridación por voltametría de pulso diferencial (DPV). Encontramos complementarios, no complementarios, y oligonucleótidos no coincidentes específicamente fueron distinguidos por el biosensor fabricado. También se demostró la detección fiable sensible en estudios de reactividad cruzada contra diversos agentes patógenos transmitidos por los alimentos y en la identificación de V. parahaemolyticus en berberechos frescos.

Introducción

Un tema importante de debate público y científico en los últimos años, la intoxicación alimentaria se asocia fundamentalmente con 3 agentes: microorganismos1y química2parásitos3. Alimentos contaminados pueden causar consecuencias graves para la salud en seres humanos, especialmente en el grupo de mayor riesgo aquellos con sistemas inmunes débiles, los ancianos, mujeres embarazadas, bebés y niños pequeños4. Con más de 1 millón de casos de diarrea aguda que ocurre anualmente en niños menores de 5 años en África, Asia y América Latina, la intoxicación alimentaria es una importante enfermedad global5,6 y la Organización Mundial de la salud ha establecido microorganismos como el más importante colaborador7. Vibrio parahaemolyticus se destaca entre las más reconocidas cepas virulentas. Generalmente se encuentran en ambientes marinos, estuarinos y costeros8, es una bacteria gram negativa, que se activa en entornos de alta sal y causa grave gastroenteritis humana cuando está comido en marinos insuficientemente cocidos, maltratados o crudo productos9. Además, las condiciones médicas existentes en algunas personas hacen propensos a la infección de oído, septicemia o infección de V. parahaemolyticus10de la herida. Los factores de virulencia de V. parahaemolyticus hemolisinas se dividen en dos tipos que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad: la hemolisina directa termoestable (TDH) codificadas por los genes tdh y hemolisina relacionada con TDH, codificadas por genes de trh11. Los marcadores de virulencia (genes tdh y trh) de V. parahaemolyticus se encuentran sobre todo en muestras clínicas y no en muestras ambientales.

V. parahaemolyticus posee la capacidad de sobrevivir en un amplio rango de condiciones, responder rápidamente a cambios ambientales12. Su mecanismo de proliferación aumenta su potencial de peligro como su toxicidad aumenta en paralelo con la masa de la celda13. Peor aún, el cambio climático está proporcionando estas bacterias con amplias condiciones para acelerar su célula de crecimiento población14. Debido a su alta frecuencia, V. parahaemolyticus necesita ser monitoreada a lo largo de la cadena alimentaria, particularmente en el comercio y la producción de pescados y mariscos ya que esos productos son donde se encuentran en cantidades enormes de15,16 en todo el mundo. Actualmente se identifican las bacterias y aislados utilizando una variedad de métodos, incluyendo pruebas bioquímicas, enriquecimiento y medios selectivos17, enzima-ligado Inmunomagnética sorbente ensayo (ELISA)18, electroforesis de pulso-campo (PFGE) 19, pruebas de aglutinación de látex y de polimerasa de las pruebas de reacción en cadena (PCR)20. Estos métodos generalmente requieren personal calificado, instrumentos sofisticados y técnicas laboriosas que no proporcionan información sobre la contaminación inmediatamente. Esto limita seriamente la posibilidad de detectar con prontitud contaminación perjudicial y aplicaciones in situ. Herramientas de detección rápida siguen siendo un desafío excepcional.

Biodetección está emergiendo como una opción promisoria para la detección de patógenos alimentarios ya que ofrece un ahorro de tiempo, rentable, práctico y en tiempo real análisis método21,22,23,24 . Sin embargo, aunque ha habido muchos resultados positivos de la detección de analitos en las muestras inoculadas y solución mediante biosensores, todavía hay una falta de investigación aplicada a muestras reales en mezclas acuosas o extractos orgánicos25. Recientemente, biosensores electroquímicos utilizando detección directa y/o indirecta del ácido desoxirribonucléico (ADN) han recibido una atención creciente entre los científicos, debido a su detección específica del objetivo complementario a través de un evento de hibridación26 , 27 , 28 , 29. estos enfoques únicos son más estables en comparación con los biosensores basados en enzimas, ofreciendo así una tecnología prometedora para la miniaturización y comercialización. El objetivo del estudio aquí reportado es construir una herramienta rápida que puede detectar V. parahaemolyticus con alta selectividad, sensibilidad y sentido práctico, basado en la especificidad de secuencia de ADN durante la hibridación. Estrategias de identificación implican la combinación de nanopartículas de oro (AuNPs de PLA) estabilizado con ácido poliláctico30 y electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs) en presencia del indicador de hibridación, azul de metileno (MB). El potencial de la construcción de detección desarrollados es explorado utilizando muestras de berberechos frescos y lisado de ADN de las bacterias.

Protocolo

Nota: Todos los reactivos químicos y bioquímicos para ser utilizado deben ser de grado analítico y utilizan sin purificación adicional. Preparar todas las soluciones utilizando agua desionizada estéril. Autoclave de toda la cristalería antes de la esterilización.

PRECAUCIÓN: Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan actividades de laboratorio, incluyendo el uso de controles (campana, guantera) de ingeniería y equipo de protección personal (gafas, guantes, bata, pantalón largo, cerrados zapatos).

1. fabricación y caracterización de electrodos modificados con PLA-AuNPs

  1. Preparación y caracterización de AuNPs PLA
    1. Rápidamente añadir 10 mL de solución de citrato de sodio (38,8 mM) a 100 mL de solución ácida acuosa de chloroauric (1 mM) de ebullición y enfriar hasta temperatura ambiente. Observar los cambios en el color de la solución preparada de AuNPs que comienza como amarillo, cambios a negruzco y finalmente termina como rojo rubí oscuro.
    2. Los pellets PLA en un molde de acero inoxidable para el proceso de fusión y precaliente a una temperatura de 190 ° C durante 10 minutos sigue con el procedimiento de prensado: ponerlos bajo una presión de 2,2 MPa durante 1 minuto como parte de la preparación de la hoja PLA. La hoja PLA estará lista para su uso después de refrescarse por cerca de 3 horas.
    3. Revolviendo vigorosamente, disolver 0,68 mg de las hojas PLA en 5 mL de cloroformo a temperatura ambiente. El PLA disuelto de la mezcla con 10 mL de la solución previamente preparada de AuNPs y revuélvalo homogéneo a temperatura ambiente. Las mezclas homogéneas se puede denota como PLA-AuNPs y caracterizaron con EDX FESEM, UV-Vis, XRD y TEM.
  2. Preparación y caracterización de electrodos serigrafiados de carbono modificados
    Nota: El SPCE utilizado en este estudio consta de un sistema de tres electrodos: un electrodo de trabajo de carbono y un contraelectrodo y un electrodo de referencia Ag/AgCl.
    1. Rápidamente pipetee 25 μl de la solución homogénea de PLA-AuNPs SPCE y aire secar 24 h antes de su uso.
    2. Electroquímicamente caracterizan los electrodos modificados, SPCE/PLA-AuNPs, en ferro cianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) para medir el área superficial activa, espectroscopía de impedancia electroquímica, repetibilidad, reproducibilidad y estabilidad de30.

2. desarrollo del Biosensor electroquímico ADN

  1. Preparación de la sonda
    Nota: Las secuencias de la sonda de ssDNA y ADN complementario fueron seleccionadas en base a información del Centro Nacional de base de datos de información de biotecnología (NCBI).
    1. Compra de oligonucleótidos sintéticos (20-mer ssDNA sonda ADN complementario 20-mer, 20-mer Lencería desconjunta ADN y ADN no complementario 21-mer) como polvo liofilizado de laboratorios comerciales, basado en las siguientes secuencias:
      sonda de ssDNA thiolated: 5′ - / D/5ThioMC6-CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′
      ADN complementario: 3′ 5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG -
      una base ADN no coinciden: 3′ 5′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      3 bases ADN no coinciden: 3′ 5′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      ADN no complementario: 3′ 5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -
    2. Preparar las soluciones madre de los oligonucleótidos (100 μm) con una estéril solución de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), dividida en porciones analíticas. Conserve este a-4 ° C y luego realizar las diluciones adecuadas justo antes de usar.
  2. Optimización de la inmovilización y la hibridación
    Nota: Un SPCE modificado con PLA-AuNPs, denotado como SPCE-PLA-AuNPs, fue utilizado para este estudio y un método de fundición de gota fue utilizado para la inmovilización de ADN y la hibridación.
    1. En primer lugar, inmovilizar 25 μl de sonda de ssDNA thiolated en las AuNPs/PLA-SPCE y luego aire secará durante 24 h a temperatura ambiente, después de que será denotada por último como SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinar la optimización de la condición de inmovilización mediante tres factores: la concentración de ssDNA (desde 0,2 a 1,4 μm), tiempo (desde 30 hasta 210 min) y temperatura (entre 25 a 75 ° C).
    2. Pipetear 25 μl de ADN complementario en la superficie de SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA para llevar a cabo el evento de hibridación después de que puede ser finalmente denotado como SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determinar la optimización de las condiciones de hibridación por medio de los dos factores de tiempo (entre 5 y 30 min) y temperatura (entre 25 a 75 ° C).
    3. Sumerja el inmovilizado y electrodos hibridados en el μm 20 MB por 30 minutos Retire el ADN no específicamente adsorbida y MB exceso lavando con 0,5 M ABS/20 mM de NaCl (pH 4.5) y luego enjuagar con agua desionizada. Medida la corriente de pico de MB reducción utilizando la técnica de la DPV. Ejecutar la medida de DPV PBS de 0,1 M (pH 7) que contiene ningún indicador.
  3. Caracterización del biosensor de ADN fabricado
    1. Sumerja la SPCE/PLA-AuNPs en μm 20 MB por 30 min, lavar con ABS M 0,5/20 mM de NaCl (pH 4.5) y luego enjuague con agua desionizada antes de medir. Seguir un procedimiento similar para todas las interacciones, incluyendo la sonda DNA, ADN complementario, ADN no coinciden y no complementarios muestras de ADN.
    2. Medida de la reducción electroquímica.
      Nota: Se evaluó la DPV un Autolab comercialmente manufacturado con software de interfaz.
      Las mediciones de la DPV de la reducción electroquímica de MB en un potencial desde -0,5 V a 0,25 V, con un paso potencial de 0.005 V, amplitud de modulación de 0.05 V y una frecuencia de barrido de 7,73 mVs-1 en PBS de 0,1 M (pH 7), que contiene ningún indicador. La selectividad, sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad del biosensor de ADN fabricado al calor fueron más estudiados. Resultados reportados fueron presentados como promedio de las mediciones de valor en tres repeticiones.

3. validación del Biosensor de ADN fabricado con muestras reales

  1. Preparación de las cepas bacterianas
    1. Seleccionar las muestras bacterianas basadas en la contaminación significativa de mariscos31,32 .
      Nota: V. parahaemolyticus como cepas de referencia y 8 otras cepas bacterianas (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella neumonía, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereusy Vibrio alginolyticus) de los comunes transmitidas por los alimentos patógeno fueron empleados para la validación de biosensores de ADN electroquímica en este estudio.
    2. Llevar a cabo una subcultura rutinaria de cepas bacterianas en agar de su respectivo cada dos semanas para mantener su viabilidad, consulte la tabla 1 para las condiciones de cultivo.
    3. Mantener la conservación a largo plazo de las cepas bacterianas en sus respectivos caldos creciente que contiene 20% (v/v) de glicerol a-80 ° C como glicerol protege a las bacterias impidiendo la formación de cristales de hielo que pueden dañar durante el proceso de congelación. A continuación, inocular un bucle de la cultura de célula bacteriana conservadas en las poblaciones de glicerol en los respectivos caldos. Incubar los caldos según su respectivo crecimiento tiempo y temperatura cuando la necesidad de reactivar las bacterias.
    4. Determinar la cantidad de V. parahaemolyticus las células usando una placa de difusión técnica33, un estándar y un método bien conocido para la enumeración de microorganismos derivados de una serie de diluciones.
      1. Cultura de V. parahaemolyticus en caldo de soya tripticasa (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C en un estado de agitación de 140 rpm. Luego, transfiera 1 mL del cultivo celular de las bacterias en 9 mL de TSB + 3% NaCl para obtener un factor de dilución 10-1 .
    5. Repita este paso nueve veces para obtener toda una serie de hasta 10-10 factor de dilución. A continuación, difunda 0,1 mL de cada factor de dilución (a partir de 10-1 a 10-10) en placa de agar selectivo de Vibrio para Colonia de conteo, respectivamente. Incubar las placas se incubaron a 37 ° C durante 24 h.
    6. Usar un contador de colonias para contar colonias individuales y luego back-calcular (cuenta la cantidad de UFC/pipeta x factor de dilución) para obtener una unidad formadora de colonias por mililitro densidad (UFC mL-1). Derivar la concentración de las colonias formando unidades (UFC) en las suspensiones celulares de las bacterias de la parcela de calibración de UFC mL-1 contra absorbancia.
  2. Preparación de la prueba de PCR
    1. Extracto de ADN genómico siguiendo la hervida los lisis procedimiento34. Primero, raya un individuo bacteriano cepa en medios de agar e inocular en medios de caldo, seguidos por incubación en su condición de crecimiento relativo, una 140 rpm agitación condición.
    2. Pipetear una cultura 1 mL de caldo en un tubo de centrífuga micro. Esto centrifugar a 4830 x g y 4 ° C durante 1 min obtener pellets. Utilice cerca de 500 μl de tampón TE estéril para re-suspensiones de la pelotilla. Mantenga la suspensión resultante por 10 min a 98 ± 2 ° C en un bloque de calefacción y enfriarlas inmediatamente a-18 ° C durante 10 min para lyse las células y liberar el ADN.
    3. Centrifugue el ADN genómico a 4830 x g y 4 ° C por 3 min obtener una suspensión clara y mantener el sobrenadante a-20 ° C para su uso posterior. Utilizar una medida biophotometer con absorción UV a una longitud de onda de 260 nm (como los ácidos nucleicos absorben la longitud de onda de la luz) y también en una longitud de onda de 280 nm (como las proteínas absorben la longitud de onda de la luz) para determinar la concentración y pureza de la extraída extracción de ADN genómico y luego identificar las cepas usando análisis bioquímicos estándar35 y verificarlas por 16S rRNA gene secuencia36. Finalmente, desnaturalizar el ADN genómico a 92 ° C por 2 min y enfriar rápidamente en agua con hielo antes de la aplicación para el biosensor.
    4. Además confirmar la presencia de V. parahaemolyticus mediante PCR para el gen toxR de destino. Realizar este procedimiento en un termociclador con un par de primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' y 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Optimizar la amplificación de PCR en un volumen total de reacción de 25 μl de agua estéril (15.5 μl), buffer (5 μl), cartilla (1 μl, 10 μm), mezcla de dNTP (1 μl), plantilla de la DNA (2 μL) y Taq ADN polimerasa (0,2 μl, 10 x).
    5. Mezclar bien los componentes y arreglar la amplificación por PCR de la secuencia de destino en un termociclador programado para 30 ciclos de amplificación. En nuestro estudio, cada ciclo consistió en tres pasos reacciones es decir., desnaturalización inicial (94 ° C, 3 min) seguido de 30 ciclos de desnaturalización (94 º C, 1 min), recocido (63 ° C, 1,5 min) y extensión (72 º C, 1,5 min), seguido de la extensión final (72 ° C, min 7).
    6. Determinar los productos amplificados y sus tamaños mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5%. Capturar las imágenes de gel con un sistema de documentación de gel producidos comercialmente.
  3. Preparación de muestras de conchas
    1. Obtener muestras frescas.
      Nota: Nuestros berberechos frescos (Pacífico occidental Anadara granosa) fueron obtenidos del mercado mojado en Serdang, Selangor y con rapidez al laboratorio en una caja del refrigerador del hielo para el análisis. Las muestras se dividen en 2 grupos, a saber, el grupo de tratados y no tratado, asumiendo que los berberechos se cosecharon uniformemente desde el inicio de la cosecha hasta colocarlos en almacenamiento en frío.
    2. Tratamiento previo de berberechos en el grupo tratado por almacenar a-20 ° C durante 24 h, seguido por la exposición a la luz UV a 20 ° C durante 4 horas antes de la extracción de ADN.
      Nota: La temperatura de congelación y la exposición Ultravioleta utilizado para el control grupo de mata o por lo menos limita la acumulación natural V. parahaemolyticus en los berberechos. No aplique un mayor régimen de pasteurización de 70 ° C, de la condición controlada en este estudio se pretende simular la situación real de los berberechos frescos. Mientras tanto, analizar las muestras directamente en el grupo no tratado sin ningún pre-tratamiento tan pronto como llegan en el laboratorio.
    3. Subcultivo de una cepa de V. parahaemolyticus ATCC 17802 en TSB (3% NaCl). Determinar el nivel de células viables en el inóculo mediante placas de las diluciones apropiadas de TSB (3% NaCl) en CA con el fin de obtener un inóculo de 104 UFC mL-1 de V. parahaemolyticus. Lavar cada berberechos en agua destilada y limpiar suciedad antes de usar pinzas estériles en un gabinete de flujo laminar para extraer los tejidos de la cáscara.
    4. Homogeneizar unos 10 g de muestras de tejido de berberechos con un homogeneizador en 90 mL de TSB estéril (3% NaCl) para 60 s. agregar una cantidad conocida de V. parahaemolyticus a 9 mL de caldo de homogeneizado de la muestra para las muestras inoculadas. Utilice las muestras antes como control negativo. Estimar el recuento de V. parahaemolyticus añadió a las muestras de conchas por 0,1 mL de las muestras en CA de la galjanoplastia, y posteriormente, Pipetear 1 mL de las muestras en un tubo de microcentrífuga para ADN de la muestra extracción, para ser utilizado en el biosensor y análisis polimerización en cadena.
    5. Extraer el ADN genómico del V. parahaemolyticus las muestras inoculadas y antes tras un modificado hervida los lisis procedimiento36. Por último, determinar la concentración de ADN y la pureza con la medición del fotómetro de bio de absorción UV a una longitud de onda de 260 nm (como los ácidos nucleicos absorben la longitud de onda de la luz) y también en una longitud de onda de 280 nm (como las proteínas absorben la longitud de onda de la luz).

Resultados

Formación de AuNPs fue revelada a través del cambio en el color de la solución acuosa con citrato de sodio presente. Esto causó que el color cambie de amarillo claro a un rojo rubí profundo. La generación de AuNPs PLA fue confirmada de los espectros UV-vis (figura 1) donde el crecimiento del pico de resonancia (SPR) de plasmón superficial se encontró a alrededor de 540 nm. La formación y existencia de AuNPs PLA fue indicada en las gamas de longitud d...

Discusión

Los pasos críticos en un marco para el desarrollo exitoso de este tipo de biosensor electroquímico son selección de elementos de reconocimiento biológico apropiado para el transductor (ácido nucleico o ADN aquí); enfoque de química para la construcción de la capa de detección del transductor; material de transducción de señales; optimización de inmovilización del DNA e hibridación; y validación del biosensor desarrollado con muestras reales.

Base para el desarrollo de un biosens...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer el apoyo de Universiti Putra Malasia.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

Referencias

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