JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

腸炎ビブリオを検出するポリ酸安定、金ナノ粒子修飾、スクリーン印刷された炭素電極を構成する電気化学的 DNA センサーの開発のためのプロトコルが表示されます。

要約

(ビブリオ) 腸炎ビブリオ、人間の死亡率と罹患率に大きな影響を与える公衆衛生問題の大きい割合にグローバルに貢献する一般的な食中毒病原体であります。文化法、免疫アッセイと分子手法など腸炎ビブリオの検出のための従来の方法は、複雑なサンプル処理を必要し、時間がかかり、退屈な高価です。最近では、バイオ センサー高速検出、費用対効果、および実用性の利点を持つ有望な包括的な検出方法であると証明しました。この研究は、急速な高選択性と感度のハイブリダイゼーションの原則を使用して腸炎ビブリオ検出法の開発に焦点を当てます。仕事で合成したポリ酸安定の金ナノ粒子 (PLA によって金ナノ粒子) の評価は、x 線回折 (XRD)、紫外可視分光法 (紫外-可視)、透過型電子顕微鏡 (TEM)、電界放出を使用して達成されました。走査型電子顕微鏡 (FESEM) およびサイクリックボルタンメトリー (CV)。さらに、PLA 結果の再現性、感度、安定性のテストを行いました。わかった PLA によって金ナノ粒子が水溶液中で安定化されたナノ粒子の音構造を形成します。また電荷転送の抵抗 (Rct) 値を小さくと活性表面積 (0.41 cm2) の増加の結果として感度が改善したことが観測されました。私たちの DNA のバイオ センサーの開発は、PLA によって金ナノ粒子と酸化還元指示薬としてメチレン ブルー (MB) を使用してスクリーン印刷されたカーボン電極 (空間) の修正に基づいていた。差動パルス ・ ボルタンメトリー (DPV) による固定化と交配イベントを評価しました。相補、補完的、ことがわかったし、不一致のオリゴヌクレオチドは具体的に試作したバイオ センサーによって区別されていました。様々 な食品媒介病原体に対する交差反応性の研究、新鮮な貝で腸炎ビブリオの同定、また確実に高感度検出を分かった。

概要

近年公共および学術の議論の主要なトピック、食中毒は主に 3 のエージェントに関連付けられている: 微生物1化学2、および寄生虫3。汚染された食物は、人間、特に免疫力が弱い、高齢者、妊婦、赤ちゃん、幼児4とのそれらのより高いリスク グループの深刻な健康の結果を可能性があります。アフリカ、アジア、およびラテン アメリカの 5 歳未満の子供で毎年発生する急性下痢の以上 100 万の場合、食中毒は、世界の主要な疾患5,6と世界保健機関が確立最も重要な貢献者7として微生物。腸炎ビブリオは最も広く知られている病原性菌株の中で際立っています。通常、河口、沿岸及び海洋環境8で発見、それはグラム陰性菌では、高塩分環境でアクティブになりますし、不十分な調理、不適切または生の海洋の食べたとき深刻な人間の胃腸炎を引き起こす製品の9。さらに、何人かの人々 の既存の医療条件を作るそれら傷ビブリオ10から生じる感染症、敗血症や耳の感染症になりやすい。ヘモリジン腸炎ビブリオの病原因子が病気の発症に寄与する 2 つのタイプに分けられる: 耐熱性直接溶血毒 (TDH) tdh 遺伝子によってコード化された、TDH 関連溶血 trh 遺伝子11によってコード化されました。ビブリオの病原性マーカー (tdh と trh 遺伝子) は、環境試料ではなく臨床検体で大抵見つけられます。

腸炎ビブリオ12環境の変化に迅速に対応、条件の広い範囲の下で生き残るために能力を持っています。セル質量13と並行してその毒性が増加するにつれて、その増殖機構はその災害ポテンシャルをエスカレートします。さらに悪いことに、気候変動は、これらの細菌のセル人口成長14を加速する十分な条件を提供しています。腸炎ビブリオ高周波による、食品サプライ チェーン、貿易とそれらの製品は、膨大な量の15,の16の場所からは魚介類の生産で特に監視する必要世界。現在細菌が識別され、隔離された生化学的なテスト、濃縮培地17、酵素免疫吸着などの方法の範囲を使用してアッセイ (ELISA)18、パルス フィールド電気泳動 (PFGE)19、ラテックス凝集反応、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) テスト20。これらのメソッドは、有資格者、洗練された楽器と汚染に関する情報をすぐに提供していない骨の折れるテクニックに通常必要です。これは深刻な有害汚染物と敷地内のアプリケーションを速やかに検出の可能性を制限します。迅速な検出ツールのまま未解決の挑戦です。

バイオセンシング、食品由来の病原体の検出のための有望なオプションとして浮上して、時間を節約、コスト効果の高い、実用的なおよびリアルタイムの分析法21,22,23,24 を提供していますので.ただし、試料及びバイオ センサーを用いた標準液で検体検出の多くの肯定的な結果をされているが、まだある水溶液または有機抽出物25試料への応用研究の欠如。最近では、直接及び間接のデオキシリボ核酸 (DNA) の検出を用いた電気化学バイオ センサーの交配イベント26を介して相補的なターゲットの特異的検出のための科学者の間で注目を受けた,27,28,29. これらのユニークなアプローチは酵素を用いたバイオ センサー、小型化と実用化のための有望な技術をご提供と比較して安定しています。研究の対象は、高選択性、感度、交配時の DNA 配列の特異性に基づく実用性と腸炎ビブリオ検出することができます高速ツールを構築することですここで報告しました。識別方法は、交配インジケーター、メチレン ブルー (MB) の存在下でのポリ酸安定化金ナノ粒子 (PLA によって金ナノ粒子)30スクリーン印刷された炭素電極 (SPCEs) の組み合わせを含みます。開発の検出構成の可能性はさらに検討細菌 dna のライセートと新鮮なしわを使用します。

プロトコル

注: 使用するすべての化学・生化学的試薬分析グレードのはず、さらに精製することがなく使用します。滅菌の脱イオン水を使用してのすべてのソリューションを準備します。オートクレーブ滅菌前にすべてのガラス製品。

注意: コントロール (ヒューム フード、グローブ ボックス) をエンジニア リングの使用など研究室の活動を実行するときすべての適切な安全対策を使用してくださいと個人用保護具 (保護メガネ、手袋、白衣、フルの長さのズボン、閉じてつま先靴)。

1. 作製と PLA によって金ナノ粒子を使用して修飾した電極のキャラクタリゼーション

  1. PLA によって金ナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション
    1. すばやく沸騰水性塩化金酸溶液 (1 mM) の 100 mL にクエン酸ナトリウム溶液 (38.8 mM) 10 mL を追加し、周囲温度まで冷却します。黄色、黒への変更として開始し、最終的に暗いルビーとして終了する調製した金ナノ粒子溶液の色の変化を観察します。
    2. 溶融プロセスのステンレス鋼の金型の PLA ペレットを置き、それらを押す手順で 10 分以下の 190 ° C の温度で予熱: PLA シート準備の一部として 1 分 2.2 MPa の圧力の下でそれらを置きます。PLA シートは、約 3 時間冷却した後使用できるようになります。
    3. 活発にかき混ぜながら、室温でクロロホルム 5 mL に PLA シートの 0.68 mg 溶解します。事前に準備された金ナノ粒子溶液 10 mL で溶存の PLA を混合し、均一室温で攪拌します。均質な混合物は PLA によって金ナノ粒子と呼ばれますことができます、EDX を用いた紫外可視、x 線回折、電子顕微鏡、FESEM 特徴付けられます。
  2. 変更されたスクリーン印刷されたカーボン電極の作製と評価
    注: この研究で使用される空間構成 3 電極システム: 銀/塩化銀参照電極、カーボン電極、対向電極。
    1. すぐに空間とし、空気に PLA によって金ナノ粒子の均質なソリューションのピペット 25 μ L は 24 h 使用する前にそれを乾燥します。
    2. 、電極の電気化学的特性空間/PLA-, カリウム鉄シアン化物の (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) 活性表面積、電気化学インピー ダンス分光法、再現性を測定するには再現性、および安定性30。

2. 電気化学的 DNA バイオ センサーの開発

  1. プローブの準備
    注: 一本鎖 Dna プローブと相補的な DNA のシーケンスは、国立生物工学情報 (NCBI) のデータベース センターからの情報に基づいて選ばれました。
    1. 次のシーケンスに基づく商業所から凍結乾燥粉末として総合的なオリゴヌクレオチド (20 mer ssDNA プローブ、20 mer の相補的な DNA、20 mer 一致しない DNA、21 mer 非相補的な DNA) を購入します。
      チオール ssDNA プローブ: 5 '-5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG -/3 '
      相補的な DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG -
      1 つベースが一致しない DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      3 拠点が一致しない DNA: 3 '5' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      非相補的な DNA: 3 '5' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -
    2. 分析に分けて滅菌テ ソリューション (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.5) を使用してすべてのオリゴヌクレオチド (100 μ M) の溶液を準備します。-4 ° C でこれを維持し、適切な希釈液を使用する直前。
  2. 固定および交配の最適化
    注: PLA 結果、空間/PLA-結果として示されると変更、スペースはこの研究のため使用され、ドロップ キャスト法は DNA の固定化および交配のために使用されました。
    1. まず、チオール ssDNA プローブ空間/PLA - 結果の 25 μ L を固定し、空気乾燥して、室温で 24 時間後、最後に示されます空間/PLA-金ナノ粒子/ssDNA として。3 つの要因を使用して固定化条件の最適化を決定する: ssDNA (0.2 から 1.4 μ M まで)、(210 分 30 からまで)、時間および温度 (25 から 75 ° C まで) の濃度。
    2. その後それ表すことができます最後にスペース/PLA-金ナノ粒子/dsDNA として交配イベントを行うスペース/PLA によって金ナノ粒子/ssDNA の表面に相補的な DNA の 25 μ L をピペットします。(30 分 5 に至るまで) 時間と温度 (25 から 75 ° C まで) の 2 つの要因によって交配条件の最適化を決定します。
    3. 固定化を浸すと 20 μ m MB 30 分ハイブリッド電極が 0.5 M ABS で洗浄することにより非具体的に吸着した DNA と過剰な MB を削除/20 mM 塩化ナトリウム (pH 4.5) とで洗浄し、脱イオン水。DPV を用いたメガバイトの削減のピーク電流を測定します。0.1 M PBS (pH 7) を使用する DPV 測定を実行インジケーターが含まれていません。
  3. 作製した DNA のバイオ センサーの特性評価
    1. 結果、30 分の 20 μ m MB スペース/PLA を浸す、0.5 M abs/20 mM 塩化ナトリウム (pH 4.5) を洗浄し、測定前に脱イオン水で洗い流し。プローブ DNA、相補的な DNA、dna 塩基のミスマッチ、および非相補的な DNA のサンプルを含むすべての相互作用のと同様の手順に従います。
    2. 電気化学的還元を測定します。
      メモ: インターフェイス ソフトウェアを商業的に製造された Autolab を使用して DPV を測定しました。
      MB の電気化学的還元に至る-0.5 V 0.005 V、0.05 V、変調振幅と 7.73 mVs-1 0.1 M PBS (pH 7) でのスキャン速度の潜在的なステップで 0.25 V、潜在的な公演の DPV 測定にはインジケーターが含まれていません。選択性、感度、再現性、および DNA の作製バイオ センサーの熱安定性をさらに検討しました。報告された結果は、3 つの複製で、平均値測定を発表されました。

3. 実際のサンプルを使用して作製した DNA のバイオ センサーの検証

  1. 菌株の調製
    1. 魚介類31,32の重要な汚染に基づいて細菌のサンプルを選択します。
      注:ビブリオ参照株と他の 8 の細菌株 (カンピロバクターリステリア菌、サルモネラ菌、腸炎サルモネラ、クレブシエラ肺炎として性大腸菌 o157: h7、ビブリオ菌セレウス菌、) 一般的な食中毒の病原体は、本研究では電気化学的 DNA バイオ センサーの検証のため採用されました。
    2. 彼らの生存率を維持、培養条件、表 1を参照してください彼らのそれぞれの寒天培地に細菌の日常的サブカルチャー 2 週間ごとを実施します。
    3. グリセリン凍結のプロセス中にそれらを損傷することができます氷結晶の形成を防ぐことによって細菌を保護すると、-80 ° c 20% (v/v) グリセロールを含む、それぞれ成長の流体培養基の細菌の緊張の長期保全を維持します。次に、それぞれの流体培養基にグリセロールで保存された細菌の細胞培養のループを接種します。細菌を復活させるために必要があるときは、それぞれの成長の時間と温度の流体培養基を孵化させなさい。
    4. 希釈のシリーズから派生した微生物を列挙する拡散板法33、標準およびよく知られている方法を用いた腸炎ビブリオ細胞の量を決定します。
      1. 腸炎ビブリオトリプチ醤油スープの文化 (TSB + 3 %nacl) 140 rpm 振動状態で 37 ° C で。その後、TSB + 3% の 9 mL に 1 mL の細菌培養を転送 10-1希釈倍率を取得するための食塩。
    5. 全シリーズの最大 10-10希釈倍率を取得する 9 回この手順を繰り返します。次に、腸炎ビブリオの選択寒天培地カウント、それぞれの植民地に (10-1010-1から始まって) 各希釈倍率を 0.1 mL を広がってください。24 h の 37 ° C で培養したプレートを孵化させなさい。
    6. コロニー カウンターを使用して、個々 のコロニーをカウントし、(カウント CFU/戻量希釈倍率 ×) の背中をコロニー形成単位ミリリットル密度 (CFU mL-1) を取得する計算に。CFU mL-1吸光度に対する校正のプロットから細菌細胞懸濁液の単位 (CFUs) を形作っているコロニーの濃度を派生します。
  2. PCR 法の準備
    1. 煮沸溶解手順34次の変更されたゲノム DNA を抽出します。最初、ストリーク個々 の細菌の寒天にひずみし、スープ メディア、その相対成長の条件、条件を振って 140 rpm のインキュベーション後に接種します。
    2. マイクロ遠心チューブに液の 1 mL 文化をピペットします。4830 x g とペレットを取得に 1 分間、4 ° C でこれを遠心します。ペレットの再懸濁液に約 500 μ L の滅菌の TE バッファーを使用します。98 ± 2 ° C 加熱ブロックで 10 分結果の懸濁液を保持し、すぐに細胞を溶解し、DNA をリリース 10 分-18 ° C で冷やします。
    3. 4830 x g と明確なサスペンションを取得し、さらに使用するための-20 ° C で上澄みを維持に 3 分間、4 ° C でゲノム DNA を遠心します。260 の波長に紫外線吸収をもつ biophotometer 測定を使用して nm (核酸は光の波長を吸収) と同時に、波長 280 nm (光の波長を吸収するタンパク質) に濃度と抽出の純度を決定するにはゲノム DNA し、標準的な生化学的アッセイ35を使用しておよび 16S rRNA 遺伝子配列36によってそれらを確認するすべての系統を識別します。最後に、92 ° C 2 分でゲノム DNA を変性し、バイオ センサーへの応用の前に氷の水で急速に冷やします。
    4. さらに腸炎ビブリオの存在を確認 toxR 遺伝子を対象とする PCR を使用します。たちのプライマー (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' と 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3') を使用してこの手順を実行します。25 μ l の滅菌水 (15.5 μ L)、バッファー (5 μ L)、(1 μ、10 μ M) のプライマー、dNTP ミックス (1 μ L)、DNA テンプレート (2 μ L)、Taq DNA ポリメラーゼ (0.2 μ L, 10 x) から成る全反応量の PCR 増幅を最適化します。
    5. コンポーネントをよく混ぜ、増幅の 30 サイクル プログラムたちでターゲット シーケンスの PCR 増幅を手配します。私たちの研究では、各サイクルから成って 3 段階反応すなわち。、30 サイクルの変性 (94 ° C 1 分)、(63 ° C、1.5 分) をアニーリングをおよび拡張 (72 ° C、1.5 分)、最終的な拡張 (72 ° C, 7 分) 続いて続いて初期変性 (94 ° C、3 分)。
    6. 増幅産物と 1.5% の agarose のゲルの電気泳動でそのサイズを決定します。市販ゲル ドキュメンテーション システムでゲル画像をキャプチャします。
  3. コックル試料の調製
    1. 新鮮なサンプルを取得します。
      注: 私たちの新鮮な貝 (Anadara において) に serdang、セランゴール州、ウェット マーケットから得られ、分析用氷クーラー ボックスで研究室にすぐに持って来られます。サンプルを 2 つのグループ、すなわち処理と未処理グループ、こと、貝収穫された均一に収穫の開始から低温貯蔵にそれらを配置することまで想定して分割します。
    2. 事前治療群で 20 ° C の DNA の抽出の前に 4 時間で紫外線の暴露に続いて、24 時間-20 ° C で保存して貝を扱います。
      注: 凍結温度と制御に使用される紫外線暴露グループを殺すか、または少なくとも、当然のことながら蓄積腸炎ビブリオ貝の制限します。本研究では制御された条件の目的は、新鮮な貝の実際の状況を模倣する、70 ° C のより高い殺菌政権は適用されません。一方、彼らは研究室に到着するとすぐに前治療なし未処理のグループから直接サンプルを分析します。
    3. 腸炎ビブリオATCC 17802 TSB でのひずみのサブカルチャー (3 %nacl)。TSB の適切な希釈液のめっきによる菌の生菌のレベルを決定する (3 %nacl) 104 CFU mL-1 腸炎ビブリオの菌を取得するためにカリフォルニア州に。各コックル蒸留水で洗うし、スクラブのシェルから組織を削除する層流のキャビネットで無菌の鉗子を使用する前に汚れの自由。
    4. コックル組織サンプル約 10 g を 90 ml の滅菌 TSB のホモジナイザーを用いた均質化 (3 %nacl) 60 s の追加 9 mL、試料の均質化サンプル スープに腸炎ビブリオの既知の量です。ネガティブ コントロールとしてハワイプ サンプルを使用します。腸炎ビブリオca で、サンプルの 0.1 mL をメッキすることによってしわサンプルにスパイクの細胞数の推定し、抽出、バイオ センサーと PCR の試金で使用されるサンプル DNA の微量遠心チューブに試料 1 mL を分注後。
    5. 煮沸溶解手順36次の改良は、スパイクとハワイプ サンプルから、腸炎ビブリオのゲノム DNA を抽出します。DNA 濃度・純度バイオ光度測定を用いた UV 吸収波長 260 を最後に、決定 nm (核酸は光の波長を吸収) と同時に、波長 280 nm (光の波長を吸収するタンパク質) に。

結果

金ナノ粒子の形成は、現在クエン酸ナトリウムを用いた水溶液の色の変化によって明らかにされました。これは深いルビー色の赤に黄色の光から変更する色を発生します。表面プラズモン共鳴 (SPR) ピークの成長が約 540 で見つかりました紫外-可視スペクトル (図 1) から PLA によって金ナノ粒子の生成が確認された nm。形成と PLA によって金ナノ?...

ディスカッション

このタイプの電気化学バイオ センサーの開発に成功するためのフレームワークの重要な手順です。 (核酸またはここの DNA) の探触子に対して適切な生物的認識の要素の選択探触子; の検知層を構築するための化学的アプローチ生体材料;DNA の固定化および交配; の最適化実際のサンプルを使用して開発されたバイオ センサーの検証。

固定および交配条件の最適化は、コア?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、マレーシア ・ プトラのサポートを確認したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

参考文献

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. . WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R., Cliver, D. O., Riemann, H. P. . Foodborne Diseases. , 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A., Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. . Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. , 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. . Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., Murad, A. . AIP Conference Proceedings. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

136 DNA DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved