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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor bestehend aus eine Polymilchsäure Säure stabilisiert, gold-Nanopartikeln modifiziert, Siebdruck kohlenstoffelektrode Vibrio Parahaemolyticus erkennen wird vorgestellt.

Zusammenfassung

Vibrio Parahaemolyticus (V. Parahaemolyticus) ist eine gemeinsame lebensmittelbedingten Erreger, die für einen Großteil der Probleme der öffentlichen Gesundheit Global gesehen trägt erheblich auf die Rate der menschlichen Sterblichkeit und Morbidität. Konventionelle Methoden für den Nachweis von V. Parahaemolyticus wie Kultur-basierte Methoden, immunologischen Assays und molekularen Methoden erfordern komplizierte Probenbehandlung und sind zeitraubend, mühsam und teuer. Vor kurzem, Biosensoren erwiesen sich eine viel versprechende und umfassende Methode mit den Vorteilen der schnellen Erkennung, Wirtschaftlichkeit und Zweckmäßigkeit. Diese Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung einer schnelle Methode zum Nachweis V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit, die mit den Prinzipien der DNA-Hybridisierung. In der Arbeit gelang mittels Röntgendiffraktometrie (XRD), Ultraviolett-sichtbare Spektroskopie (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Feldemission Charakterisierung von synthetisierten Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs) Rasterelektronenmikroskopie (FESEM) und zyklischer Voltammetrie (CV). Wir führten auch weitere Tests an Stabilität, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von PLA-AuNPs. Wir fanden, dass die PLA-AuNPs eine Klangstruktur von stabilisierten Nanopartikeln in wässriger Lösung gebildet. Wir beobachten auch, dass die Empfindlichkeit durch die kleinere Ladung übertragungswert Widerstand (R-ct) und eine Zunahme der aktiven Fläche (0,41 cm2) verbessert. Die Entwicklung unserer DNA-Biosensor beruhte auf Änderung der Siebdruck kohlenstoffelektrode (tauglich) mit PLA-AuNPs und mit Methylenblau (MB) als Redox-Indikator. Wir bewertet die Immobilisierung und Hybridisierung Ereignisse durch differenzielle Puls Voltammetrie (DPV). Wir fanden, dass ergänzende, nicht-ergänzende und nicht übereinstimmende Oligonukleotide wurden speziell zeichnet sich durch die vorgefertigten Biosensor. Es zeigte auch zuverlässig empfindliche Detektion in Kreuzreaktivität Studien von verschiedenen lebensmittelbedingten Krankheitserregern und bei der Identifizierung von V. Parahaemolyticus in frische Herzmuscheln.

Einleitung

Ein wichtiges Thema der öffentlichen und wissenschaftlichen Diskussion in den letzten Jahren, Lebensmittelvergiftung wird hauptsächlich mit 3 Agenten: Mikroorganismen1, Chemikalien2und Parasiten3. Kontaminierter Lebensmittel kann dazu führen, dass schwerwiegende gesundheitliche Folgen beim Menschen, vor allem in höheren Risikogruppe der Personen mit geschwächtem Immunsystem, ältere Menschen, Schwangere, Säuglinge und Kleinkinder4. Mit mehr als 1 Million Fälle von akuter Durchfall bei Kindern unter 5 Jahren in Afrika, Asien und Lateinamerika jährlich auftretenden Lebensmittelvergiftungen ist eine wichtige globale Krankheit5,6 und der World Health Organization gegründet Mikroorganismen als wichtigsten Faktor7. Vibrio Parahaemolyticus zeichnet sich unter den bekanntesten virulente Stämme. In der Regel in Küsten-, Flussmündungen und marine8gefunden, ist es ein gramnegatives Bakterium, wird im hohen Salz Umgebungen aktiv, und verursacht schwere menschliche Gastroenteritis beim Verzehr in ungenügend gekocht, fehlgeleitetes oder roh marine Produkte-9. Darüber hinaus machen Vorerkrankungen bei manchen Menschen sie anfällig für Infektionen, Septikämie oder Ohr-Infektion aus V. Parahaemolyticus10gewickelt. Die Virulenzfaktoren von V. Parahaemolyticus hämolysinen gliedern sich in zwei Arten, die an der Pathogenese der Erkrankung beitragen: thermostabile direkten hlya (TDH) von Tdh Gene codiert und TDH-bezogene hlya von Trh Gene11codiert. Die Virulenz-Marker (Tdh und Trh Gene) von V. Parahaemolyticus befinden sich meist in klinischen Proben nicht in Umweltproben.

V. Parahaemolyticus besitzt die Fähigkeit, unter den unterschiedlichsten Bedingungen überleben, reagiert schnell auf Veränderungen der Umwelt12. Seine Verbreitung Mechanismus eskaliert sein Gefahrenpotenzial, als seine Giftigkeit parallel zu Zelle Masse13erhöht. Noch schlimmer ist, stellt Klimawandel diese Bakterien mit reichlich Bedingungen ihre Zelle Bevölkerung Wachstum14zu beschleunigen. Aufgrund seiner hohen Frequenz muss V. Parahaemolyticus überwacht werden entlang der Food Supply Chain, insbesondere beim Handel und Produktion von Meeresfrüchten, da diese Produkte sind wo sie sich befinden, in enormen Mengen15,16 überall auf der Welt. Derzeit werden die Bakterien identifiziert und isoliert mit einer Reihe von Methoden, einschließlich biochemischen Tests, Bereicherung und selektivmedien17, Enzym-linked Immunomagnetic sorbent assay (ELISA)18, Puls-Bereich Gelelektrophorese (PFGE) 19, Latex Agglutination Prüfungen und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Tests20. Diese Methoden erfordern in der Regel qualifiziertes Personal, ausgefeilte Instrumente und aufwendige Techniken, die Informationen über Verunreinigung nicht sofort angeben. Dies schränkt die Wahrscheinlichkeit schädlichen Verunreinigungen und vor-Ort-Anwendungen sofort zu erkennen. Schnellnachweis Werkzeuge bleiben eine hervorragende Herausforderung.

Biosensoren zeichnet sich als eine vielversprechende Option für den Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern, denn es eine zeitsparende, kostengünstige, praktische und Echtzeit-Analyse-Methode21,22,23,24 bietet . Zwar gab es viele positive Ergebnisse der Analyten Erkennung dotierten Proben und Standardlösung mit Biosensoren, bleibt es jedoch ein Mangel an Forschung auf realen Proben in wässrigen Gemischen oder Bio-Extrakte25angewendet. Vor kurzem erhielten elektrochemische Biosensoren mit direkte und/oder indirekte Desoxyribonukleinsäure (DNA) Erkennung erhöhte Aufmerksamkeit unter den Wissenschaftlern, aufgrund ihrer spezifischen Nachweis der komplementären Ziel über eine Hybridisierung Event26 , 27 , 28 , 29. diese einzigartige Ansätze sind stabiler im Vergleich zu den Enzym-basierte Biosensoren, bietet somit eine viel versprechende Technologie für Miniaturisierung und Vermarktung. Das Ziel der Studie berichtet, soll hier ein schnelles Werkzeug zu konstruieren, die V. Parahaemolyticus mit hoher Selektivität, Sensibilität und Praktikabilität, basierend auf der DNA-Sequenz Spezifität bei Hybridisierung erkennen kann. Identifikation-Strategien beinhalten die Kombination aus Polymilchsäure Säure stabilisiert gold-Nanopartikeln (PLA-AuNPs)30 und Siebdruck Kohleelektroden (SPCEs) in Anwesenheit der Hybridisierung Indikator, Methylenblau (MB). Das Potenzial des Konstrukts entwickelten Erkennung ist weiter untersucht mit Bakterien DNA lysate und frische Herzmuscheln Proben.

Protokoll

Hinweis: Die chemischen und biochemische Reagenzien verwendet werden sollte der analysenrein und ohne weitere Reinigung verwendet. Bereiten Sie alle Lösungen mit sterilen deionisiertes Wasser. Autoklav alle Gläser vor der Sterilisation.

Achtung: Bitte verwenden alle geeigneten Sicherheitsmaßnahmen beim Labortätigkeiten, einschließlich des Einsatzes von technischen Kontrollen (Abzugshaube, Handschuhfach) durchführen und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, voller Länge Hose, geschlossene (Schuhe).

1. Herstellung und Charakterisierung von geändert Elektrode mit PLA-AuNPs

  1. Herstellung und Charakterisierung von PLA-AuNPs
    1. Schnell 100 mL kochendem wässrigen Chloroauric Säure (1 mM) 10 mL Natriumcitrat-Lösung (38,8 mM) hinzu und auf Raumtemperatur abkühlen. Beachten Sie die Änderungen in der Farbe in die vorbereiteten AuNPs-Lösung, die als gelb, schwärzlich Änderungen beginnt und endet schliesslich als Dunkles Rubinrot.
    2. Die PLA-Pellets in einem Edelstahl-Werkzeug für den Schmelzprozess legen und Heizen sie bei einer Temperatur von 190 ° C für 10 min. folgen mit den Pressvorgang: setzen Sie sie unter einem Druck von 2,2 MPa für 1 min als Teil der PLA-Blatt-Vorbereitung. Das PLA-Blatt wird nach dem Abkühlen für ca. 3 h einsatzbereit sein.
    3. Lösen Sie kräftig rühren auf, 0,68 mg der PLA Blätter in 5 mL Chloroform bei Raumtemperatur. Mischen Sie die gelöste PLA mit 10 mL der vorbereiteten AuNPs Lösung und homogen rühren bei Raumtemperatur. Die homogene Mischungen können dann als PLA-AuNPs bezeichnet und mit UV-Vis, XRD, TEM und FESEM mit EDX charakterisiert.
  2. Herstellung und Charakterisierung von modifizierten Siebdruck kohlenstoffelektrode
    Hinweis: Die Erholungsfläche in dieser Studie verwendeten besteht aus einem drei-Elektroden-System: eine Gegenelektrode eine kohlenstoffelektrode arbeiten und eine Ag/AgCl-Referenzelektrode.
    1. Schnell Pipette 25 µL der homogenen Lösung von PLA-AuNPs auf die Erholungsfläche und dann Luft trocknen es für 24 Stunden vor der Verwendung.
    2. Elektrochemisch charakterisieren die modifizierte Elektroden Erholungsfläche/PLA-AuNPs, in Ferro Zyankali (K3[Fe(CN)6]3-/4 -) zur Messung der aktiven Fläche, elektrochemische Impedanz Spektroskopie, Wiederholbarkeit, Reproduzierbarkeit und Stabilität30.

2. Entwicklung der elektrochemische DNA-Biosensor

  1. Vorbereitung der Sonde
    Hinweis: Die Sequenzen von SsDNA Sonde und komplementären DNA wurden basierend auf den Informationen vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) Datenbank ausgewählt.
    1. Kaufen Sie synthetische Oligonukleotide (20-Mer SsDNA Sonde, 20-Mer komplementären DNA-20-Mer nicht übereinstimmende DNA und 21-Mer-komplementären DNA) als lyophilisierte Pulver aus kommerziellen Laboren, basierend auf die folgenden Sequenzen:
      Thiolated SsDNA Sonde: 5′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      komplementäre DNA: 5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3 '
      One-Base nicht übereinstimmende DNA: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      drei-Base nicht übereinstimmende DNA: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      nicht-komplementären DNA: 5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3 '
    2. Bereiten Sie Stammlösungen alle Oligonukleotide (100 µM) mit einer sterilen TE-Lösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), in Portionen aufgeteilt. Beachten Sie dies bei-4 ° C und dann machen Sie die entsprechenden Verdünnungen nur vor dem Gebrauch.
  2. Optimierung der Immobilisierung und Hybridisierung
    Hinweis: Eine Erholungsfläche modifiziert mit PLA-AuNPs, bezeichnet als Erholungsfläche/PLA-AuNPs, wurde für diese Studie verwendet und ein Drop-Gießverfahren diente für die DNA Immobilisierung und Hybridisierung.
    1. Erstens immobilisieren 25 µL Thiolated SsDNA Sonde auf der AuNPs/PLA-tauglich und Luft trocknen Sie es dann für 24 h bei Raumtemperatur, danach wird es schließlich als Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA bezeichnet werden. Optimierung der Immobilisierung Bedingung mithilfe von drei Faktoren bestimmt: die Konzentration von SsDNA (von 0,2 bis 1,4 µM), Zeit (von 30 bis 210 min.) und Temperatur (von 25 bis 75 ° C).
    2. Pipette 25 µL der komplementären DNA auf die Oberfläche der Erholungsfläche/PLA-AuNPs/SsDNA zur Durchführung der Hybridisierung Veranstaltung, wonach es schließlich als Erholungsfläche/PLA-AuNPs/DsDNA bezeichnet werden kann. Optimierung der Hybridisierung Bedingung über die beiden Faktoren der Zeit (von 5 bis 30 min) und Temperatur (von 25 bis 75 ° C) zu bestimmen.
    3. Tauchen die immobilisierte und hybridisierte Elektroden in 20 µM MB für 30 min. unspezifisch adsorbierten DNA und überschüssige MB durch Waschen mit 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) und dann Spülen mit entionisiertem Wasser. Maß der Spitzenstrom für MB-Reduzierung mit DPV-Technik. Die DPV-Messung mit 0,1 M PBS (pH 7) ausführen, enthält kein Indikator.
  3. Charakterisierung von vorgefertigten DNA-biosensor
    1. Tauchen die Erholungsfläche/PLA-AuNPs in 20 µM MB für 30 min, mit 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) waschen und Spülen mit entionisiertem Wasser vor der Messung. Ein ähnliches Verfahren für alle Interaktionen mit der DNA-Sonde, komplementäre DNA nicht übereinstimmende DNA und nicht-komplementären DNA-Proben zu folgen.
    2. Die elektrochemische Reduktion zu messen.
      Hinweis: Wir haben DPV Schnittstellensoftware kommerziell hergestellten Autolab mit gemessen.
      Die DPV-Messungen der MB elektrochemische Reduktion durchgeführt auf einem Potential von -0,5 V bis 0,25 V, mit einem möglichen Schritt von 0,005 V, Amplitude Modulation von 0,05 V und einer Abtastrate von 7,73 mVs-1 mit 0,1 M-PBS-Puffer (pH 7), enthält kein Indikator. Die Selektivität, Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Hitzestabilität von vorgefertigten DNA-Biosensor waren weiter untersucht. Berichteten Ergebnisse präsentierten sich als mittlere Wert Messungen in drei Wiederholungen.

(3) Validierung der vorgefertigten DNA-Biosensor mit realen Proben

  1. Vorbereitung von Bakterienstämmen
    1. Wählen Sie bakterielle Proben anhand ihrer erheblichen Verschmutzung der Meeresfrüchte31,32 .
      Hinweis: V. Parahaemolyticus Referenzstämme sowie 8 andere Bakterienstämme (Campylobacter Jejuni, Listeria Monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Salmonellen Enteritis, Klebsiella Pneumonie, Escherichia coli O157: H7, Bacillus Cereusund Vibrio Alginolyticus) der gemeinsame lebensmittelbedingten Erreger waren für die elektrochemische DNA-Biosensor-Validierung in dieser Studie beschäftigt.
    2. Führen Sie eine Routine Subkultur von Bakterienstämmen auf ihre jeweiligen Agar alle zwei Wochen ihre Lebensfähigkeit zu erhalten, siehe Tabelle 1 für Kulturbedingungen.
    3. Pflegen Sie Langzeitarchivierung der Bakterienstämme in ihren jeweiligen wachsenden Brühen mit 20 % (V/V) Glycerin bei-80 ° C wie Glycerin schützt Bakterien verhindert die Bildung von Eiskristallen, die sie während des gefriervorgangs beschädigen können. Als nächstes impfen Sie eine Schleife der erhaltenen Bakterielle Zellkultur in Glycerin Aktien in der jeweiligen Brühen. Inkubieren Sie Brühen entsprechend ihrer jeweiligen Wachstumszeit und Temperatur, wenn benötigen, um die Bakterien wieder zu beleben.
    4. Bestimmen Sie die Menge von V. Parahaemolyticus Zellen unter Verwendung einer Ausbreitung Platte Technik33, ein Standard und eine bekannte Methode zum Auflisten von Mikroorganismen, die aus einer Reihe von Verdünnungen abgeleitet.
      1. Kultur V. Parahaemolyticus in Trypticase-Soja-Bouillon (TSB + 3 % NaCl) bei 37 ° C in einem 140 u/min schütteln Zustand. Übertragen Sie dann 1 mL Bakterienkultur Zelle in 9 mL TSB + 3 % NaCl, ein Verdünnungsfaktor 10-1 zu erhalten.
    5. Wiederholen Sie diesen Schritt neun Mal, um eine vollständige Reihe von bis zu 10-10 Verdünnungsfaktor zu bekommen. Als nächstes 0,1 mL jedes Verdünnungsfaktor (ab 10-1 bis 10-10) auf ein Vibrio selektive nährbodenplatte Kolonie zählen, bzw. verteilt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 24 h inkubiert.
    6. Verwenden Sie einen Kolonie Zähler zählen einzelne Kolonien und dann zurück-rechnen (Anzahl der KBE/pipettiert Betrag x Verdünnungsfaktor) um eine koloniebildenden Einheiten pro Milliliter Dichte (KBE mL-1) zu erhalten. Leiten Sie die Konzentration der koloniebildenden Einheiten (KBE) in der Bakterien-Zellsuspensionen vom Kalibrierung Grundstück KBE mL-1 gegen Extinktion ab.
  2. Vorbereitung des PCR-Assays
    1. Extrahieren Sie genomischen DNA nach einem modifizierten Lyse Verfahren34gekocht. Erste, Streifen, eine einzelne bakterielle Belastung auf Agar-Medien und in Brühe Medien, gefolgt von Bebrüten es seine relative Wachstum Zustand, ein 140 u/min schütteln Zustand zu impfen.
    2. Pipette eine 1 mL-Kultur der Brühe in eine Mikro Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie dies bei 4830 x g und 4 ° C für 1 min um Pellets zu erhalten. Verwenden Sie ca. 500 µL steriler TE-Puffer für Resuspension mit Pellets. Halten Sie die entstandene Suspension für 10 min bei 98 ± 2 ° C in einem Heizblock und chill es sofort bei-18 ° C für 10 min zur lyse der Zellen und die DNA freigeben.
    3. Zentrifugieren Sie die genomische DNA bei 4830 x g und 4 ° C für 3 min zu erhalten eine klare Suspension und halten den Überstand bei-20 ° C für die weitere Verwendung. Verwenden Sie eine Biophotometer-Messung mit UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (als Nukleinsäuren absorbierenden Wellenlänge des Lichts) und auch bei einer Wellenlänge von 280 nm (als die Proteine absorbierenden Wellenlänge des Lichts) zu bestimmen, die Konzentration und Reinheit der entnommenen genomische DNA und identifizieren Sie dann alle Stämme mit standard biochemischen Assays35 und von 16 s rRNA-Gen-Sequenzierung36zu überprüfen. Zu guter Letzt Denaturieren Sie die genomische DNA bei 92 ° C für 2 min und im Eiswasser vor Anwendung der Biosensor kühlen Sie schnell.
    4. Weiter bestätigen das Vorhandensein V. Parahaemolyticus mittels PCR ToxR gen Ziel. Führen Sie diese Schritte in einem Thermocycler mit einer Grundierung (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' und 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3"). Optimieren Sie die PCR Verstärkung in eine gesamte Reaktionsvolumen von 25 µL bestehend aus sterilem Wasser (15,5 µL), Puffer (5 µL), Grundierung (1 µL, 10 µM), dNTP-Mix (1 µL), DNA-Vorlage (2 µL) und Taq-DNA-Polymerase (0,2 µL, 10 X).
    5. Vermischen Sie die Komponenten gut und ordnen Sie die PCR Verstärkung der Zielsequenz in einem Thermocycler programmiert für 30 Zyklen der Verstärkung. In unserer Studie jedem Zyklus bestand aus drei Schritten Reaktionen dh., erste Denaturierung (94 ° C, 3 min), gefolgt von 30 Zyklen der Denaturierung (94 ° C, 1 min), Glühen (63 ° C, 1,5 min) und Verlängerung (72 ° C, 1,5 min), gefolgt von letzte Verlängerung (72 ° C, 7 min).
    6. Bestimmen Sie die amplifizierten Produkte und deren Größen per Elektrophorese auf 1,5 % Agarosegel. Erfassen Sie die Gelbilder mit ein kommerziell hergestelltes Gel-Dokumentations-System.
  3. Vorbereitung der Herzmuschel-Proben
    1. Erhalten Sie frische Proben.
      Hinweis: Unsere frische Herzmuscheln (Anadara Granosa) wurden von der nassen Markt in Serdang Selangor, gewonnen und schnell an das Labor in einem Kühler Eisbox zur Analyse gebracht. Teilen Sie die Proben in 2 Gruppen, nämlich die behandelten und unbehandelten Gruppe davon aus, dass ums gleichmäßig aus den Beginn der Ernte geerntet wurden, bis ins Kühlhaus ablegen.
    2. Behandeln Sie Herzmuscheln in der behandelten Gruppe durch eine Aufbewahrung bei-20 ° C für 24 h, gefolgt durch die Einwirkung von UV-Licht bei 20 ° C für 4 h vor der DNA-Extraktion vor.
      Hinweis: Die Gefriertemperatur und UV-Exposition verwendet für die kontrollierte Gruppe tötet oder zumindest die natürlich anfallende V. Parahaemolyticus in ums beschränkt. Gelten Sie eine höhere Pasteurisierung Regime von 70 ° C nicht, wie der kontrollierten Zustand in dieser Studie die tatsächliche Situation der frische Herzmuscheln zu imitieren soll. Unterdessen analysieren Sie Proben direkt aus der unbehandelten Gruppe ohne jede Vorbehandlung, sobald sie im Labor ankommen.
    3. Subkultur einen Stamm von V. Parahaemolyticus ATCC 17802 TSB (3 % NaCl). Bestimmen Sie die entwicklungsfähigen Zellen in das Inokulum über Beschichtung von entsprechenden Verdünnungen der TSB (3 % NaCl) auf CA um ein Inokulum von 104 KBE mL-1 V. Parahaemolyticuszu erhalten. Waschen Sie jede Schale in destilliertem Wasser und Schrubben sie frei von Schmutz vor mit sterilen Pinzette in eine laminare Strömung Kabinett, um das Gewebe aus der Schale zu entfernen.
    4. Homogenisieren ca. 10 g Herzmuscheln Gewebeproben mit einem Homogenisator in 90 mL sterile TSB (3 % NaCl) für 60 s. hinzufügen eine bekannte Menge von V. Parahaemolyticus bis 9 mL der homogenisierten Probe Brühe für die Spikes Proben. Verwenden Sie die unspiked Beispiele als Negativkontrolle. Schätzen die Zellzahlen von V. Parahaemolyticus versetzt auf die Herzmuschel-Proben durch Ausplattieren 0,1 mL der Proben auf CA, und probieren Sie anschließend pipettieren 1 mL der Proben zu einem Microcentrifuge Schlauch für DNA Extraktion in der Biosensor und PCR-Assay verwendet werden.
    5. Extrahieren Sie die genomische DNA von der V. Parahaemolyticus der Spikes und unspiked Proben nach einem modifizierten gekocht Lyse Verfahren36. Schließlich bestimmen die DNA-Konzentration und Reinheit mit einer Bio-Photometer-Messung mit UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (als Nukleinsäuren absorbierenden Wellenlänge des Lichts) und auch bei einer Wellenlänge von 280 nm (als die Proteine, die Wellenlänge des Lichts absorbieren).

Ergebnisse

Bildung von AuNPs zeigte sich durch die Veränderung der Farbe der wässrigen Lösung mit Natriumcitrat vorhanden. Dies verursacht die Farbe von hellgelb zu tief Rubinrot wechseln. Die Generation von PLA-AuNPs wurde aus den UV-Vis-Spektren (Abbildung 1), wo das Wachstum des Surface Plasmon Resonance (SPR) Peaks bei ca. 540 gefunden wurde, bestätigt nm. Die Entstehung und Existenz von PLA-AuNPs wurde auf 500-600 nm Wellenlänge reicht, je nach Partikel Größ...

Diskussion

Die entscheidenden Schritte in einen Rahmen für die erfolgreiche Entwicklung dieser Art von elektrochemische Biosensor sind Auswahl der geeigneten biologischen erkennungselemente für den Wandler (Nukleinsäure oder DNA hier); chemischen Ansatz für den Bau der Fernerkundungen Schicht des Wandlers; Transduktion Material; Optimierung der DNA Immobilisierung und Hybridisierung; und Validierung der entwickelten Biosensor mit realen Proben.

Für die erfolgreiche Entwicklung der empfindliche und s...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten die Unterstützung der Universiti Putra Malaysia bestätigen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

Referenzen

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