Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

Resumen

La incidencia de la obesidad está aumentando y aumenta el riesgo de enfermedades pulmonares crónicas. Establecer los mecanismos subyacentes y estrategias preventivas, el animal bien definido son necesarios modelos. Presentamos tres métodos (prueba de tolerancia a la glucosa, pletismografía corporal y fijación del pulmón) para estudiar el efecto de la obesidad sobre los resultados de pulmonares en ratones.

Resumen

Obesidad y trastornos respiratorios son importantes problemas de salud. La obesidad se está convirtiendo en una epidemia emergente con el número esperado de individuos obesos más 1 billón en todo el mundo en 2030, lo que representa una carga socioeconómica creciente. Al mismo tiempo, relacionadas con la obesidad comorbilidades, incluyendo diabetes, así como corazón y enfermedades pulmonares crónicas, están continuamente en aumento. Aunque la obesidad se ha asociado con mayor riesgo de las exacerbaciones del asma, empeoramiento de los síntomas respiratorios y un control deficiente, el papel funcional de la obesidad y el metabolismo perturbado en la patogenesia de la enfermedad pulmonar crónica es a menudo subestimado, y los mecanismos moleculares subyacentes permanecen fuera de alcance. Este artículo pretende presentar métodos para evaluar el efecto de la obesidad sobre el metabolismo, así como la estructura pulmonar y función. Aquí, Describimos tres técnicas para los estudios de ratones: (1) evaluación de la tolerancia a la glucosa intraperitoneal (ipGTT) para analizar el efecto de la obesidad sobre el metabolismo de la glucosa; (2) medición de la resistencia de vía aérea (Res) y cumplimiento del sistema respiratorio (Cdyn) para analizar el efecto de la obesidad sobre la función pulmonar; y (3) preparación y fijación del pulmón para evaluación histológica cuantitativa posterior. Enfermedades pulmonares relacionadas con la obesidad son probablemente multifactoriales, de desregulación inflamatoria y metabólica sistémica que potencialmente negativamente influyen en la función pulmonar y la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, una metodología estandarizada para el estudio de mecanismos moleculares y el efecto de nuevos tratamientos es esencial.

Introducción

Según la Salud Organización Mundial (OMS) en 2008, más de 1,4 billones de adultos, más de 20 años, tenían sobrepeso con índice de masa corporal (IMC) mayor o igual a 25; Además, más 200 millones de hombres y casi 300 millones de mujeres eran obesos (BMI≥30)¹. Obesidad y síndrome metabólico son factores de riesgo para una multitud de enfermedades. Obesidad y tejido adiposo blanco aumento concomitante masa ha estado íntimamente vinculado al tipo 2 diabetes^2,3, enfermedades cardiovasculares incluyendo la enfermedad cardíaca coronaria (CHD), insuficiencia cardiaca (IC), fibrilación auricular⁴ y artrosis⁵, su papel funcional en la patogenesia de desórdenes respiratorios siguen siendo mal entendidos. Sin embargo, estudios epidemiológicos han demostrado que la obesidad está fuertemente asociada con enfermedades respiratorias crónicas, incluyendo disnea del exertional, síndrome de apnea obstructiva del sueño (SAOS), síndrome de obesidad hipoventilación (SOH), crónica enfermedad pulmonar obstructiva (EPOC) y embolia pulmonar, neumonía por aspiración, asma bronquial^6,7,8,9. Posibles mecanismos de vinculación de obesidad y metabolismo perturbado, por ejemplo, resistencia a la insulina y tipo diabetes II, a la patogenesia de la enfermedad pulmonar crónica comprenden no sólo las consecuencias mecánicas y físicas de peso aumento en la ventilación sino también inducir un estado inflamatorio subagudo crónico^10,11. El aumento de la obesidad y las enfermedades pulmonares durante la última década, juntadas con la falta de estrategias preventivas eficaces y enfoques terapéuticos, destaca la necesidad de investigar los mecanismos moleculares para definir nuevas vías para la gestión de pulmón relacionados con la obesidad enfermedades.

Aquí, Describimos tres pruebas estándares, que son bases importantes para investigar la obesidad y su impacto en la estructura pulmonar y la función en modelos de ratón: (1) intraperitoneal glucosa tolerancia (ipGTT) (2) medición de la resistencia (Res) de la vía aérea y respiratorio cumplimiento del sistema (Cdyn); y (3) preparación y fijación del pulmón para evaluación histológica cuantitativa posterior. La ipGTT es una prueba de detección robusta a la captación de glucosa medida y así el efecto de la obesidad sobre el metabolismo. La simplicidad del método permite buena estandarización y por lo tanto la comparabilidad de resultados entre laboratorios. Métodos más sofisticados, tales como abrazaderas de hyperglycemic o estudios en islotes aislados, pueden utilizarse para un análisis detallado del fenotipo metabólico¹². Aquí evaluar tolerancia a la glucosa para definir un estado de obesidad asociados de trastorno metabólico y sistémico como la base para estudios posteriores en un resultado pulmonar. Para evaluar el efecto de la obesidad y desorden metabólico sobre la función pulmonar, se evaluó la resistencia de vía aérea (Res) y cumplimiento del sistema respiratorio (Cdyn). Para caracterizar la enfermedad pulmonar, están disponibles sin restricciones, así como restringidos métodos para la evaluación de la función pulmonar. Pletismografía libre libremente mover animales imita un estado natural, lo que refleja patrones de respiración; en contraste, métodos invasivos, tales como medición de la impedancia de entrada de Res y cDyn en ratones profundamente anestesiados para evaluar la mecánica pulmonar dinámica, son más exactos¹³. Enfermedades respiratorias crónicas son reflejados por alteraciones histologic del tejido pulmonar, fijación de pulmón adecuada para su posterior análisis es inminente. La elección del método de fijación del tejido y la preparación depende del compartimiento del pulmón que se estudiará, por ejemplo, conducción de las vías respiratorias o de parénquima pulmonar¹⁴. Aquí, describimos un método que permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de las vías aéreas conductoras para estudiar el efecto de la obesidad en el desarrollo de asma.

Protocolo

Animales todos los procedimientos se realizaron en cumplimiento de protocolos de actuación aprobados por las autoridades del gobierno local (tierra NRW, AZ: 2012.A424) y estaban de acuerdo con la ley de bienestar animal alemán y las normas sobre el bienestar de los animales utilizados para experimentos o para otros fines científicos. Desde análisis de función de pulmón pueden afectar la estructura del pulmón y por lo tanto posteriores analiza histológica, debe realizarse la medición de Res Cdyn y preparación y fijación del pulmón para histomorfometría en diferentes animales. Sin embargo, es posible medición de Res y Cdyn después de ipGTT. Puesto que el estrés durante la ipGTT puede interferir con la anestesia necesaria para la función pulmonar, pruebas, un período de recuperación de aproximadamente 2 semanas después de ipGTT se recomienda para permitir ratones para recuperarse de la pérdida de peso corporal y cambios en sangre parámetros¹².

1. preparación para la prueba de tolerancia a glucosa Intraperitoneal (ipGTT)

Nota: Después de 12 h de ayuno, la ipGTT completa toma aproximadamente 2 h.

1. Puesto que el estrés influye significativamente en glucosa en la sangre, asegúrese de que tanto la adaptación de ratones, así como la formación del científico, se realizan.
2. Transferencia de los animales a la zona experimental bajo condiciones tranquillas y sin estrés.
3. Considerar la aplicación de una dieta hipercalórica para inducir obesidad en ratones. Consulte la sección de discusión para más información.
4. Animales rápidos para 12 h noche a la mañana, sin limitar el acceso al agua. Al día siguiente, después de 12 h de ayuno, prepare el medidor de glucosa de la sangre según el fabricante de protocolo (véase tabla de materiales) introduciendo una nueva tira reactiva en el puerto de la tira de prueba.
5. Haga una incisión en la punta de la cola con unas tijeras estériles, manteniendo ligeramente el ratón en su cola y medir inmediatamente la glucemia ayunas aplicando una gota de sangre de flujo libre (mínimo de la muestra tamaño 0.5 μl) a la tira de prueba de medidor de glucosa en la sangre.
   Nota: Un temporizador de cuenta atrás comienza en la pantalla después de la aplicación suficiente de la muestra de sangre. Después de 4 s, el resultado aparece en la pantalla.
6. Luego, pesar y etiquetar los animales individualmente con el color de la marca.
7. Administrar 2 g glucosa/kg cuerpo peso mediante inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g de peso (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc).
8. Posteriormente, medida de glucosa en sangre después de 15, 30, 60 y 120 min, aplicando una gota de sangre de flujo libre en una nueva tira reactiva.
   Nota: Flujo de sangre puede aumentarse dando masajes suaves de las salas de punta de la cola. Si encrusts la herida de la cola, límpiela con un hisopo estéril empapado con solución de cloruro de sodio 0.9%.
9. Permitir a los animales descansar en sus jaulas hogar con acceso ilimitado al agua entre las mediciones.

2. pulmón función análisis a medida Res y cDyn

Nota: Para medir Res y cDyn, ratones que deba ventilarse bajo anestesia profunda. Manejo de animales libre de estrés y un seguimiento adecuado de la anestesia son esenciales. Instrucciones generales técnicas estériles, consulte el artículo de Hoogstraten-Miller et al. ¹⁵

1. Calibrar el pletismógrafo antes de cada serie de experimentos y preparar la configuración de estudio dentro del software (véase Tabla de materiales).
2. Antes de la cirugía, profundamente anestesiar animales mediante inyección intraperitoneal de xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y ketamina (100 mg/kg de peso corporal) (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc). Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g por peso corporal.
   Nota: Dado que la ketamina tiene un adecuado efecto analgésico en ratones, ningún tratamiento adicional es necesario. El procedimiento invasivo catéter traqueal/pletismógrafo toma aproximadamente 5-7 minutos, luego de adquisición de datos puede comenzar.
3. Coloque el ratón en la posición supina sobre una almohada para mantener la temperatura corporal.
4. Cubrir los ojos con ungüento para evitar la sequedad bajo anestesia.
5. Monitoree constantemente la profundidad de la anestesia con la respuesta de pellizco del dedo del pie.
   Nota: La administración adicional de anestésicos puede ser necesaria para mantener un plano quirúrgico de anestesia.
6. Humedezca la piel del área quirúrgica en la región de la tiroides con etanol al 70%.
7. Cuidadosamente haga una incisión en la piel en la línea media de aproximadamente 1 cm entre la muesca yugular del esternón y el symphyses del tubérculo de la mentum levantando con pinzas y corte la piel en una inspección visual con unas tijeras embotadas (figura 1A).
8. Visualizar el tejido adiposo subcutáneo subyacente y la glándula tiroides.
9. Exponer la tráquea separando con cuidado embotado ambos lóbulos de la tiroides en el Istmo y la disección de los sternothyroid y sternothyroid músculos (figura 1B). Tenga cuidado de no dañar cualquier vasos y causar sangrado, ya que esto puede causar efectos adversos sobre el sistema cardiovascular y en última instancia en las medidas.
10. Posteriormente, pasar una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y del esófago usando fórceps romos. Con cuidado haga una incisión en la tráquea cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales con micro tijeras.
11. Intubar con un tubo traqueal (0,04 pulgadas/1,02 mm de diámetro) bajo control visual (figura 1). Fijar el tubo a través de la ligadura con sutura quirúrgica para evitar cualquier fuga en el sistema.
12. A continuación, mueva al animal a la cama caliente de la cámara de cuerpo y conectar el tubo traqueal a la placa frontal (figura 1) y encender la ventilación pulsando la tecla de ventilación en el panel frontal del controlador (Figura 1E).
13. Estudio de la ventilación mediante la observación del movimiento del tórax al mismo tiempo con la tasa de ventilación. Para confirmar la colocación correcta del tubo traqueal, asegúrese de que ambos lados del tórax se mueven simultáneamente.
14. Vigilar la presión de señal en la pantalla del ordenador (Figura 1F). Que sean las curvas de ventilación uniforme. Si este no es el caso, separar el animal y comprobar el lado de la cirugía. Cuidado con sangre o moco que bloquea el tubo traqueal.
    Nota: Para animales adultos con un peso de 20-25 g, los ajustes del ventilador como se muestra en la figura 2 se proponen según las recomendaciones del fabricante.
15. Para control de cambios en la presión trans pulmonar durante la ventilación, inserte un tubo del esófago (0,04 pulgadas/1,02 mm de diámetro) en el esófago a la profundidad que se aproxima a los niveles de los pulmones. Miren la pantalla colocando el tubo. Coloque el tubo donde se aprecia desviación de la presión máxima y mínima corazón artefactos en la pantalla.
16. Después de la cirugía, preparar al animal para la medición. Re anestesia mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) utilizando una aguja de 27 G y jeringa de 1 cc. Asegúrese de que el volumen de inyección es de 0,1 mL/10 g por peso corporal.
    Nota: Para evaluar la hyperreagibility bronquial, nebulizar metacolina, un agonista no selectivo de los receptores muscarínicos del sistema nervioso parasimpático, que induce broncoconstricción. Adquisición de datos se realiza en cuatro fases (figura 3).
17. Iniciar la adquisición de datos según el protocolo de manufacturer´s.
    Nota: El software de guía automáticamente a los usuarios a través del proceso de adquisición.
18. Aplicar 10 μl de PBS (vehículo) en el nebulizador y comenzar la nebulización después de 5 minutos de aclimatación. A continuación, sigue una fase de respuesta de 3 minutos, donde se miden Res (cmH₂O/mL/s) y cDyn (mL/cmH₂O). Al final, dar una fase de recuperación de 3 minutos al animal antes de la próxima nebulización.
19. Siga el software de aplicación paso a paso de 10 μl de aumentar las concentraciones de metacolina (2,5 μg/10 μl, 6,25 μg/10 μl y 12,5 μg/10 μl) en el ventilador.
20. Una vez que todas las mediciones se han realizado y registrado, sacrifican los animales por dislocación cervical.

3. pulmón aislamiento cuantitativo análisis histomorfométrico de ratones adultos

1. Profundamente anestesiar el animal mediante inyección intraperitoneal de xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y ketamina (100 mg/kg de peso corporal) (aguja de 27 G y jeringa de 1 cc). El volumen de inyección debe ser de 0,1 mL/10 g por peso corporal.
   Nota: Después de alcanzar el estado de tolerancia quirúrgica, la preparación lleva unos 5 min seguido de perfusión de órganos y 30 min para la fijación.
2. Una vez que el animal ha alcanzado el estado de tolerancia quirúrgica (toe negativo pizca-respuesta), desinfectar el animal con etanol al 70% y para fijar el animal en una plataforma con cinta quirúrgica.
3. Sacrificar el animal por punción cardíaca y hemorragias. Brevemente, abrir el abdomen con una incisión medial a través de la piel y el peritoneo con tijeras embotadas.
4. Ubicar las salas jefe del diafragma del hígado y separar cuidadosamente el hígado del diafragma.
5. Hacer una pequeña incisión en el diafragma usando tijeras embotadas, y punteado el ventrículo izquierdo del corazón con una aguja de 20 G conectada a una jeringa de 2 mL. Poco a poco exsanguinate el animal.
   Nota: Exsanguination lento y cuidadoso es importante para evitar que los ventrículos que se derrumban debido a la presión negativa, inhibiendo un flujo de sangre.
6. Diseccionar el pulmón abriendo el tórax suavemente a través de una incisión paraesternal a lo largo de toda la longitud de la caja torácica usando tijeras curvas, romos.
7. Luego, levantar la caja torácica para exponer la cavidad pleural (figura 3). Quitar el timo para ver el corazón y los pulmones.
   Nota: Opcional inyección del ventrículo derecho, seguido de perfusión del sistema vascular pulmonar con PBS helada y luego con una solución fijadora [e.g., paraformaldehído al 4% (masa/volumen) (PFA)] es posible. Tenga en cuenta que existe un mayor riesgo a ruptura de septos alveolares y afectar estructura pulmonar usando este método.
8. Disecar cuidadosamente el pulmón primero quitar el corazón.
9. Posteriormente, pasar una sutura quirúrgica trenzada 4-0 entre la tráquea y del esófago usando fórceps romos.
10. A continuación, con cuidado haga una incisión en la tráquea, cerca de la laringe entre los cartílagos traqueales, intubar con una cánula intravenosa (26 G) e inflar el pulmón por la fijación de la presión a una presión constante de 20 cm H₂O mediante agente fijador [p. ej., 4% (masa /Volume) de PFA].
11. Para la fijación de la PFA, dejar el fijador durante 30 min a temperatura ambiente. Ligar la tráquea y luego, retirar la cánula. Luego, suprimir el pulmón cuidadosamente sin dañar el tejido y almacenar en agente fijador a 4 ° C durante la noche.
    Nota: Como alternativa, según la ATS/ETS consenso papel 2.5% GA tamponado con OsO4, solución de uracilo se utiliza para la estabilización de tejido apropiado. Para preparación de tejido adicional, consulte el documento de consenso por Hsia et al. ¹⁴

Resultados

Resultados representativos de la prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal (ipGTT) (figura 4), imágenes de prueba (figura 5) y representante de la función de pulmón que ilustran hematoxilina y eosina teñidos pulmones (figura 6).

La ipGTT fue realizado en ratones obesos (azul) después de 7 semanas de dieta alta en grasa (HFD). Rato...

Discusión

Este informe proporciona tres protocolos para tres diferentes métodos analizar el impacto de la obesidad sobre el metabolismo de la glucosa y resultados pulmonares. En primer lugar, la prueba de tolerancia a la glucosa ofrece la oportunidad de analizar la captación de glucosa intracelular y puede ser indicativa de resistencia a la insulina. En segundo lugar, pletismografía del cuerpo entero es una técnica para medir la función pulmonar y es así útil para probar la eficacia de nuevos tratamientos. En tercer lugar, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
GlucoMen LX	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	38969	blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor	A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy	39765	Test stripes
Glucose 20%	B. Braun, Melsung, Germany	2356746
FinePointe Software	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1831-001
FPRC Controller	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1075-001
FPRC Aerosol Block	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um	DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands	601-2306-001
Forceps	FST, British Columbia, Canada	11065-07
Blunt scissors	FST, British Columbia, Canada	14105-12
Micro scissors	FST, British Columbia, Canada	15000-00
Perma-Hand 4-0	Ethicon, Puerto Rico, USA	736H	Surgical suture
Roti-Histofix 4%	Roth	P087.1	4% Paraformaldehyd
Ketaset	Zoetis, Berlin, Germany	10013389	Ketamine
Rompun 2%	Bayer, Leverkusen, Germany	770081	Xylazine