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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
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  • Referencias
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Resumen

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal e intracelular. Aquí describo un protocolo para el análisis del transporte axonal e intraflagelar en C. elegansy grabación en vivo .

Resumen

Transporte axonal y el Transporte intraflagelar (IFT) son esenciales para la función y la morfogénesis axon y cilios. Proteínas del superfamilia de quinesina y dineína son motores moleculares que regulan anterograde y retrógrada transporte, respectivamente. Estos motores utilizan redes de microtúbulos como rieles. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para estudiar transporte axonal y IFT en vivo. Aquí describo un protocolo para observar el transporte axonal y IFT en la vida del C. elegans. Transporte de carga puede visualizarse por selección de proteínas de carga utilizando proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP). C. elegans es transparente y proteínas GFP-tagged carga pueden expresarse en células específicas bajo promotores específicos de la célula. Gusanos vivos pueden ser fijos por microesferas en gel de agarosa de 10% sin matar o anestesiar los gusanos. En estas condiciones, movimiento de carga se puede observar directamente en los axones y cilios de la vida de C. elegans sin disección. Este método puede ser aplicado a la observación de cualquier molécula de carga en las células mediante la modificación de las proteínas de la blanco o las células que expresan. Proteínas básicas como motores moleculares y proteínas adaptadoras que intervienen en el transporte axonal y IFT se conservan en C. elegans. Comparado con otros organismos modelo, mutantes pueden ser obtenidos y mantiene más fácilmente en C. elegans. Combinando este método con varios mutantes de C. elegans puede aclarar los mecanismos moleculares del transporte axonal y IFT.

Introducción

Proyección de imagen de células vivas es una herramienta esencial para el análisis de transporte intracelular. En biología de la célula neuronal, análisis de transporte axonal con proyección de imagen de células vivas son esenciales para la comprensión de la función y la morfogénesis neuronal1. Defectos en el transporte axonal subyacen varios neurodegenerativas trastornos2. Dynein y proteínas de Kinesin Superfamilia realicen transporte axonal anterogradely y retrogradely, respectivamente1,2.

Cilios son otro compartimento celular en el que la red de microtúbulos y tráfico de maquinaria son altamente desarrollada3. Maquinaria de síntesis de proteína no se localiza en los cilios, lo que significa que deberán transportarse ciliares proteínas desde el citoplasma a las puntas de los cilios. Cilios específicos quinesina y dineína, llamado kinesin-2 y citoplásmica dineína-2, respectivamente, el transporte de los componentes de los cilios4, en un fenómeno llamado Transporte intraflagelar (IFT)5. Deterioro de IFT causa un espectro de enfermedades llamadas ciliopathies6. Así, análisis del mecanismo IFT por proyección de imagen de células vivas es necesaria para entender los mecanismos básicos de formación ciliar y patogenia.

Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un buen modelo para estudiar el transporte axonal y IFT7,8,9. Para observar el IFT, Chlamydomonas se ha utilizado ampliamente como un organismo modelo5,6. Chlamydomonas es un organismo unicelular, la relación de IFT con el envejecimiento, la función neuronal y comportamiento serían difícil de analizar. Además, no han aplicado técnicas genéticas esenciales como CRISPR/Cas9 a Chlamydomonas. En organismos más altos del modelo, tales como ratones y Drosophila, interrupción del transporte axonal y IFT a menudo causa fenotipos letal transporte axonal y IFT son esenciales para la morfogénesis y la homeostasis de los animales 10, 11. En el caso de ratones, transfección y el cultivo celular se necesita generalmente para observar el transporte axonal y IFT, que requiere muchas habilidades y tiempo extenso12,13. Además, se puede perder mucho del contexto fisiológico importante en líneas celulares y células cultivadas. Porque el sistema nervioso no es esencial para la supervivencia de las lombrices, se interrumpen los mutantes de C. elegans transporte axonal o IFT no son a menudo letales7,9,14. Transporte axonal y IFT pueden observarse directamente en vivo sin la disección ya que C. elegans es transparente y por lo tanto es fácil observar los marcadores etiquetados de GFP.

Hay varios protocolos para inmovilizar, C. elegans, como el uso de un dispositivo de microfluidos15, cojines de agarosa con anestesia16o17de microesferas. La inclusión de la anestesia puede inhibir los trata de personas eventos en neuronas15. Un claro inconveniente del método dispositivo de microfluidos es que preparar un dispositivo de microfluidos no siempre es fácil. En cambio, inmovilización por pastillas de agarosa y microesferas es una manera conveniente y fácil para realizar imágenes de lapso de tiempo en C. elegans. Aquí describo este protocolo básico para inmovilizar C. elegans y visualizar el transporte axonal y IFT en vivo en C. elegans. En comparación con los otros métodos, el método descrito aquí no requiere equipo especial y es mucho más barato y más fácil de realizar.

Protocolo

1. preparación de la muestra

  1. generar un transgénico C. elegans cepa de interés utilizando metodologías transgénicas 18. Por otra parte, obtener cepas adecuadas desde el centro de genética de Caenorhabditis (CGC). Para visualizar el transporte axonal de los precursores de la vesícula sináptica, utilice la línea transgénica wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Para observar el IFT, obtener la línea transgénica mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Estas cepas se utilizan en el presente Protocolo.
    Nota: Ya sea matriz Extracromosómica, integración genómica o incluso GFP knock-en obras. Para reducir las señales de fondo, uso de promotores específicos de células, en lugar de pan-neuronal promotores.
    Nota: Mantenimiento de gusanos se describe en otros protocolos 20. Las cepas se mantuvieron en el césped de Escherischia coli OP50 alimentador sobre el crecimiento de nematodos placas de medio (NGM) (agarosa al 1,7% (w/v), 50 mM NaCl, 0,25% (w/v) peptona, 1 mM CaCl 2, 5 mg/mL de colesterol, 25 m m KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 en platos de plástico de diámetro 60 mm) a 20 ° C.
  2. Crecer gusanos a 20 ° C en las placas de NGM a cualquier fase del ciclo de vida de los gusanos.
    Nota: Se pueden observar transporte axonal y IFT en cualquier etapa. L4 tarde a adulto joven es un buen control positivo ya que varias publicaciones han utilizado estas etapas y visualizar tráfico eventos 14 , 21 , 22 , 23.

2. Preparación del 10% agarosa

Nota: muchos proveedores ofrecen productos similares tales como agar, polvo de agar y agarosa. Utilizar la electroforesis en agarosa de grado (fuerza del gel > 1200 g/cm 2). Polvos de agar baratos no funcionan porque el gel resultante no es lo suficientemente fuerte para inmovilizar gusanos.

  1. Agarosa de 0.4 g de mezcla de 4 mL agua destilada (DW) en un tubo de vidrio (1,5 cm x 10,5 cm). Ponga una tapa en el tubo de vidrio para evitar la evaporación.
  2. Poner el tubo de vidrio en un bloque de calor de 95 ° C durante 90 minutos. Además, preparar otro tubo de vidrio (1,5 cm x 10,5 cm) llenado de DW y mantener a 95 ° C. poner una pipeta de Pasteur en la 95 ° C DW ( figura 1 A). Se verá un montón de pequeñas burbujas en el tubo de la agarosa y la solución debe ser turbia. Dejarlo hasta que la solución sea clara. Luego, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo hasta que la solución de agarosa sea homogénea.
    Nota: Microondas no pueden utilizarse para preparar la solución de agarosa de 10% cuando hace de DW y agarosa. Pequeñas burbujas causadas por microondas evitar fusión de agarosa. Sin embargo, gel de agarosa de 10% solidificado puede fácilmente derretir otra vez usando un microondas. Tubos de vidrio que contiene gel de agarosa de 10% pueden ser preparados antes de tiempo y almacenados a 4 ° C durante al menos 6 meses. Si al hacerlo, derretir el caldo usando un microondas cuando sea necesario y comenzar desde el paso 3 en el presente Protocolo.
    Nota: Agarosa gradualmente pierde la capacidad de solidificarse si se incuban a 95 ° C durante mucho tiempo o después de repetidos solidificación y fusión. Si esto sucede, preparar nuevas 10% agarosa.

3. Preparación de agarosa almohadilla

  1. utilizando la pipeta Pasteur caliente preparada en el paso 2.2, colocar 2 gotas de 10% de agarosa sobre un portaobjetos de 76 x 22 mm.
  2. Rápidamente cubierta con un segundo portaobjetos de 76 x 22 mm 2 antes de la caída de la agarosa se solidifica como se muestra en la figura 1 B y empuje hacia abajo en la segunda diapositiva para aplanar la solución de agarosa. El espesor debe ser de 0.5-1 mm.
  3. Rápidamente Limpie la pipeta de Pasteur pipetas 95 ° C DW hacia arriba y hacia abajo hasta que la solución de agarosa es eliminada. De lo contrario, la pipeta que se obstruyen por gel de agarosa. Salir de la situación de la pipeta en la 95 ° C DW.
  4. Espere 1 minuto. La agarosa forma y se convierte en turbia. Luego, deslice el portaobjetos apartes a mano ( figura 1 C).

4. Montaje de gusanos

Nota: incluso las pequeñas cantidades de movimiento de gusano evitar buena observación. Levamisol se ha utilizado tradicionalmente para prevenir el movimiento del gusano en la agarosa pad 24 , 25. Sin embargo, levamisol inhibe los receptores neuronales en C. elegans y por lo tanto puede afectar tráfico eventos en neuronas 15. Utilizando microbeads del poliestireno descrito hereis una buena alternativa 17.

  1. Microscopio estéreo equipado con una transiluminación espejo desplazable, transferencia de ~ 30 gusanos transgénicos que expresan los marcadores adecuados a un nuevo NGM placa sin bacterias usando un alambre de platino selección.
    Nota: Una selección de alambre de platino se hace del alambre de platino y pipeta de Pasteur (5 pulgadas), y la punta del alambre de platino fue aplanada. La preparación de las selecciones de alambre de platino y manejo de lombrices con éstos se describen en el Wormbook (http://www.wormbook.org).
  2. Deja la placa durante 1 minuto las bacterias se eliminan automáticamente de las superficies de gusanos como los gusanos se mueven en gel de agarosa NGM sin bacterias.
  3. Puso un 0.5-1.0 μL caída de 2,6% microesferas poliestireno del diámetro de 100 nm en el agua sobre el bloque de agar ( figura 1 D). Transferencia de 10-20 gusanos de la placa NGM libre de bacterias a las microesferas. Gusano de gota y propagación de los gusanos usando el alambre de platino selección para evitar la superposición de cuerpos ( figura 1 E).
  4. Aplique 2 cubreobjetos 22 x 40 mm ( figura 1 F). Presionar suavemente para eliminar burbujas de aire, pero evitar la trituración de gusanos. La muestra está ahora lista para la proyección de imagen de.
    Nota: Porque anestesia no es administrado, gusanos se fijan sólo por la fuerza de fricción generada por la almohadilla agar microbeads del poliestireno y cubreobjetos 17. La presencia de bacterias de alimentador o demasiada solución hará más débil la fuerza friccional.
    Nota: Diferentes tamaños de trabajo cubreobjetos (p. ej., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2). Sin embargo, pueden prevenir el cubreobjetos mayor inmersión agua o aceite de la lente del objetivo que se escapa en las muestras durante la observación.

5. Observación

Nota: parámetros apropiados de la proyección de imagen (energía del laser, ganancia, binning, etc.) serán diferente para cada sistema de microscopio y cámara. Aquí, se utiliza un microscopio de campo amplio equipado con un escáner confocal de disco giratorio y una cámara CCD digital.

  1. Regular la temperatura de la etapa a 20 ° C, o ajustar la temperatura a 20 ° C.
  2. Colocar la corredera de la muestra sobre la platina del microscopio. Utilizar 100 x (apertura numérica = 1.3 o mejor) objetivo.
  3. Busca de las esferas indicadas en la figura 2 A (para wyIs251 y transporte axonal) o figura 2 B (para mnIs17 y IFT) como controles positivos . Otras áreas pueden ser analizadas como bien 22.
  4. Conjunto de parámetros (aumento de CCD = 200, Binning = 1 o 2, energía del laser a 488 nm = 1.0-1.3 mW). Realizar la grabación de lapso de tiempo en 4 cuadros/s hasta 1 min guardar archivos en formato TIFF de páginas múltiples.
    Nota: Si GFP señales desaparecen y es difícil de seguir observando OSM-6::GFP o GFP::RAB-3 por 30 s, la potencia del láser es demasiado fuerte. En ese caso, reduzca la potencia del láser. Por el contrario, si no se registra ningún movimiento vesicular, la potencia del láser es demasiado débil. En ese caso, aumentar la energía del laser.
  5. Observar un gusano diferente y repetir 5.3 y 5.4. Las observaciones pueden durar hasta 20 minutos, pero cada gusano debe registrarse una sola vez para evitar los efectos de photo daños.
    Nota: Los gusanos se han observado por al menos 20 min sin defectos importantes 7 , 27 , 28. Una observación más larga posible pero asilo ' t sido probado todavía. Una clara señal de la muerte neuronal es el cambio de morfología neuronal como hinchazón de la neurita. Como pueden verse las señales débiles de GFP en axones y dendritas en wyIs251 y mnIs17, neurite morfología puede comprobarse fácilmente mirando a axones o dendritas. Morfología neuronal se muestra en la figura 2.
  6. Generar archivos de película.
    1. Abrir el multi-TIFF archivo utilizando el software de Fiji. Ir a archivo > abrir Seleccione el archivo multi-TIFF guardó en el paso 5.4.
      Nota: Fiji se puede descargar en jttps://fiji.sc. Imagen J y plugins también pueden usarse para generar kymographs. Si al hacer esto, siga las instrucciones para el plugin solicitadas.
    2. , haga clic en el " selección Rectangular " botón ( figura 3, flecha) y seleccione el área de interés por dibujar un rectángulo con un ratón de ordenador (rectángulo amarillo en la figura 3 A). Ir a la imagen > pilas > herramientas > Substacks y seleccione los números de segmento que se incluyen en la película. Se genera un substack.
    3. Activar la ventana de substack haciendo clic y vamos a imagen > ajuste > brillo y contraste. Aparece una ventana para ajustar el brillo y contraste. En la ventana, deslice la parte superior de la barra (mínimo) a la derecha para que la señal de fondo desaparece y el segundo superior de la barra (máximo) a la izquierda así que el movimiento de vesículas y partículas pueden verse bastante bien sobre el fondo.
    4. Vamos a imagen > pilas > tiempo matriz. Como la película se graba en 4 cuadros/s en el paso 5.4, el intervalo de tiempo es de 0.25 s. Así, tipo " 0,25 " en intervalo de.
    5. Generar un archivo de película seleccionando Guardar como > AVI desde el menú de archivo (pelicula 1 y 2).
      Nota: Mediante el uso de plugins apropiados, usted puede guardar el archivo como otros formatos tales como " mpeg4 " o " mov " archivos.
  7. Genere kymographs.
    1. Abra los archivos originales de la película utilizando otra vez el software de FIji y repita los pasos 5.6.2 y 5.6.3 para ajustar el brillo y contraste.
    2. Clic " segmentado línea " ( figura 3 B, flecha). Utilizando un ratón, dibuje una línea segmentada a lo largo de la cilia o axón (línea amarilla, en la figura 3 B).
    3. Ir a analizar > Multi Kymograph > Multi Kymograph ( figura 3 C). Aparece la ventana de ancho de línea ( figura 3 D). Tipo " 3 " en la ventana de grosor de línea y haga clic en Aceptar ( figura 3 D).
      4. Se crea la ventana de kymograph de
    4. . Guardar la imagen en formato TIFF o JPEG.

Resultados

Transporte axonal de neuronas DA9
Utilizando la línea de wyIs251 , la anterógrada y el transporte axonal retrógrado de GFP::RAB-3 se puede grabar simultáneamente en la neurona de motor DA9. La velocidad media de anterograde y transporte retrógrado en el axón proximal dorsal de la neurona DA9 es aproximadamente 1,8 y 2,6 μm/s, respectivamente22. El número de vesículas móviles es 0.03 y 0.018 por μm del axón por s. Así, para ...

Discusión

Limitación con respecto a los métodos existentes
El método descrito aquí está optimizado para observar eventos rápidas como transporte axonal y IFT. Así, la inmovilización se priorice más de incubación más largo. Aunque hemos podido observar eventos de tráfico por al menos 20 min sin perturbación significativa, este método no sea siempre conveniente observar eventos lentos que requieren más observaciones, como la elongación del axón y migración celular. Para más observaciones, es ne...

Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

El autor agradece profundamente Dr. Asako Sugimoto (Tohoku University) para su discusión útil. wyIs251 fue un generoso regalo del Dr. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 fue proporcionado por la CGC, que es financiada por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI grant #17 H 05010 y #16 H 06536 y Daiichi Sankyo Fundación, Brain Science Foundation y la Fundación de Naito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Slideglass (76  x 26 mm)MatsunamiS1111
Coverglass (22  x 40 mm)MatsunamiC024401
AgaroseWako318-01195
Polystylene microbeads 0.1 micronPolysciences#00876
Heat blockTAITEC0063288-000CTU-mini
MicroscopeOlympusIX-71widefield microscope
Spinning disk ScannerYokogawaCSU-X1spinning disc confocal scanner 
Digital CCD cameraHamamatsu PhotonicsC10600-10BORCA-R2 degital CCD camera
Objective lens (x100, NA1.4)OlympusUPLSAPO 100XO
Pasteur pipette (5 inch)IWAKIIK-PAS-5P
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)IWAKI9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251Laboratory of Kang ShenN/A
OTL11: mnIs17Ref. 27, 29N/ASP2101 was backcrossed with wild type for 6 times
Stereo microscopeCarl Zeiss435064-9000-000STEMI 508 
Mirror transillumination unitCarl Zeiss435425-9010-000
platinum wire (0.2 mm)Nilaco Corporationm78483501
60 mm plastic dishFalcon#351007
FijiN/AN/Ahttps://fiji.sc/
nematode growth medium (NGM)  1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 

Referencias

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