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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et intracellulaire. Ici, je décris un protocole in vivo d’enregistrement et d’analyse du transport axonal et de chez c. elegans.

Résumé

Transport axonal et transport de (IFT) sont essentiels pour la fonction et morphogenèse axone et les cils. Dynéine et kinésine superfamille des protéines sont des moteurs moléculaires qui régulent antérograde et rétrograde transport, respectivement. Ces moteurs utilisent des réseaux de microtubules comme rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour étudier le transport axonal et IFT in vivo. Ici, je décris un protocole afin d’observer le transport axonal et IFT vie c. elegans. Marchandises transportées peut être visualisé par marquage des protéines de cargaison à l’aide de protéines fluorescentes comme protéine fluorescente verte (GFP). C. elegans est transparent et protéines GFP-étiquetée de cargaison peuvent être exprimés dans des cellules spécifiques en vertu de promoteurs spécifiques des cellules. Vers vivants peuvent être résolus en microbilles sur gel d’agarose 10 % sans tuer ou anesthésier les vers. Dans ces conditions, mouvement de la cargaison peut être directement observé dans les axones et les cils de la vie c. elegans sans dissection. Cette méthode peut être appliquée à l’observation de n’importe quelle molécule de fret dans toutes les cellules en modifiant les protéines cibles et/ou les ils sont exprimés dans les cellules. Les protéines plus basiques tels que les moteurs moléculaires et protéines d’adaptateur qui sont impliqués dans le transport axonal et IFT sont conservés chez c. elegans. Par rapport aux autres organismes modèles, mutants peuvent être obtenus et maintenus plus facilement chez c. elegans. La combinaison de cette méthode avec divers mutants de c. elegans peut clarifier les mécanismes moléculaires du transport axonal et IFT.

Introduction

L’imagerie de cellules vivantes est un outil essentiel pour l’analyse de transport intracellulaire. En biologie cellulaire neuronale, analyses du transport axonal avec l’imagerie de cellules vivantes sont essentielles pour comprendre la fonction et la morphogenèse neuronale1. Défauts dans le transport axonal sous-tendent plusieurs de troubles neurodégénératifs2. Kinésine superfamille des protéines et dynéine effectuer le transport axonal axonales et marqués, respectivement1,2.

Cils sont un autre compartiment cellulaire dans lequel le réseau de microtubules et traite des machines sont très développés3. Machinerie de synthèse de protéine n’est pas localisée dans les cils, ce qui signifie que les protéines ciliaires doivent être transportées du cytoplasme vers la pointe des cils. Kinésine propres cils et dynein, appelés kinésine-2 et cytoplasmiques dynéine-2, respectivement, transporter les composants de cils4, dans un phénomène appelé intraflagellaire transport (IFT)5. Dépréciation d’IFT provoque un éventail de maladies appelées ciliopathies6. Ainsi, l’analyse du mécanisme de l’imagerie de cellules vivantes IFT est nécessaire pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la formation ciliaire et la pathogenèse.

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et IFT7,8,9. Pour observer l’IFT, Chlamydomonas a été largement utilisé comme un modèle organisme5,6. Comme Chlamydomonas est un organisme unicellulaire, la relation entre IFT et vieillissement, la fonction neuronale et comportement serait difficile à analyser. En outre, des techniques génétiques indispensables tels que CRISPR/Cas9 n’ont pas été appliquées de Chlamydomonas. Chez les organismes supérieurs de modèle, tels que souris et Drosophila, perturbation du transport axonal et IFT souvent provoque des phénotypes létales car transport axonal et IFT sont essentielles pour la morphogenèse et l’homéostasie des animaux 10, 11. Dans le cas de souris, transfection et culture cellulaire est généralement nécessaire d’observer le transport axonal et IFT, qui exige de nombreuses compétences et beaucoup de temps12,13. En outre, beaucoup de contexte physiologique important peut être perdue dans des cellules cultivées et des lignées cellulaires. Parce que le système nerveux n’est pas essentiel à la survie vers, c. elegans mutants dans lequel le transport axonal ou IFT sont perturbées ne sont souvent pas létales7,9,14. Le transport axonal et IFT peuvent être directement observé in vivo sans dissection parce que c. elegans est transparent et il est donc facile d’observer des marqueurs GFP-étiquetée.

Il existe plusieurs protocoles pour immobiliser c. elegans, comme l’utilisation d’un dispositif de microfluidique15, coussinets de gel d’agarose avec anesthésie16ou microbilles17. L’inclusion de l’anesthésie peut inhiber les événements trafic dans les neurones15. Un inconvénient évident de la méthode de dispositif microfluidique est que préparer un dispositif microfluidique n’est pas toujours facile. Au lieu de cela, immobilisation par coussinets de gel d’agarose et microbilles est un moyen pratique et facile d’effectuer l’imagerie de laps de temps chez c. elegans. Ici, je décris ce protocole de base pour immobiliser le c. elegans et visualiser le transport axonal et IFT in vivo dans c. elegans. Par rapport aux autres méthodes, la méthode décrite ici ne nécessite pas d’équipement spécial et est beaucoup moins cher et plus facile à réaliser.

Protocole

1. préparation des échantillons

  1. générer un transgénique c. elegans souche d’intérêt à l’aide de méthodes transgéniques 18. Également obtenir des souches appropriées de la centre de génétique de Caenorhabditis (CCG). Pour visualiser le transport axonal des précurseurs de la vésicule synaptique, utiliser la lignée transgénique wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. Pour observer l’IFT, obtenir la lignée transgénique mnIs17 [osm-6::gfp] 19. Ces souches sont utilisés dans le présent protocole.
    Remarque : Soit tableau extrachromosomique, intégration génomique ou même GFP knock-in œuvres. Pour réduire les signaux de fond, utilisez promoteurs de cellules spécifiques, plutôt que de promoteurs pan-neuronale.
    NOTE : Entretien de worms est décrite dans les autres protocoles 20. Les souches ont été maintenus sur les pelouses de Escherischia coli OP50 amenée sur la croissance des nématode des plaques (NGM) moyennes (agarose de 1,7 % (p/v), 50 mM NaCl peptone de 0,25 % (p/v), 1 mM CaCl 2, cholestérol 5 mg/mL, 25 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4 boîtes en plastique de diamètre 60 mm) à 20 ° C.
  2. Grow worms à 20 ° C sur les plaques de NGM à n’importe quel stade du cycle de vie vers.
    Remarque : On peut observer aussi bien le transport axonal et IFT à n’importe quel stade. Fin L4 à jeune adulte est un bon témoin positif parce que plusieurs publications ont utilisé ces étapes et visualisées traite des événements 14 , 21 , 22 , 23.

2. Préparation de 10 % Agarose

Remarque : de nombreux fournisseurs offrent des produits similaires tels qu’agar, poudre d’agar et d’agarose. Utilisation de l’électrophorèse sur agarose de grade (résistance de gel > 1200 g/cm 2). Poudres de gélose à bas prix ne fonctionnent pas car le gel qui en résulte n’est pas assez fort pour immobiliser vers.

  1. Mix 0,4 g d’agarose dans 4 mL l’eau distillée (DW) dans un tube de verre (1,5 cm x 10,5 cm). Mettez un couvercle sur le tube de verre pour éviter l’évaporation.
  2. Mettre le tube en verre sur un bloc de chaleur de 95 ° C pendant 90 min. En outre, préparer un autre tube de verre (1,5 cm x 10,5 cm) rempli de DW et gardez-le à 95 ° C. mettre une pipette Pasteur dans le 95 ° C DW ( Figure 1 A). Beaucoup de petites bulles apparaîtront dans le tube de gel d’agarose et la solution doit être trouble. Laissez-le jusqu'à ce que la solution devienne claire. Ensuite, mélanger en pipettant également de haut en bas jusqu'à ce que la solution d’agarose devient homogène.
    Remarque : Les micro-ondes ne peut servir à préparer la solution à 10 % d’agarose lors de DW et d’agarose. Petites bulles causées par micro-ondes empêchent d’agarose fonte. Cependant, solidifié 10 % gel d’agarose peut facilement faire fondre à nouveau en utilisant un four micro-ondes. Tubes de verre contenant du gel d’agarose de 10 % peuvent être préparés à l’avance et conservés à 4 ° C pendant au moins 6 mois. Si, ce faisant, faire fondre le stock à l’aide d’un four à micro-ondes lorsque nécessaire et commencez à l’étape 3 dans le présent protocole.
    NOTE : Agarose perd progressivement la capacité de solidifier si incubés à 95 ° C pendant une longue période ou après répétées de solidification et de fusion. Dans ce cas, préparer les nouveaux 10 % d’agarose.

3. Préparation du gel d’Agarose Pad

  1. à l’aide de la pipette Pasteur chaude préparée à l’étape 2.2, déposer 2 gouttes d’agarose de 10 % sur une lame de 76 x 22 mm.
  2. Rapidement couvrir avec une deuxième diapositive 2 de 76 x 22 mm avant la chute de l’agarose se solidifie comme montré dans la Figure 1 B et poussez vers le bas sur la deuxième diapositive pour aplatir la solution de gel d’agarose. L’épaisseur doit être de 0,5 à 1 mm.
  3. Rapidement pour rincer la pipette Pasteur pipetage 95ºC DW monte et descend jusqu'à ce que la solution de gel d’agarose est délavée. Dans le cas contraire, la pipette va se bouchent en gel d’agarose. Laisser les commandes de la pipette dans le 95 ° C DW.
  4. Attendre pendant 1 min. Le coussin de gel d’agarose forme et devient trouble. Ensuite, glissez les lames apart à la main ( Figure 1 C).

4. Montage de Worms

Remarque : même de petites quantités de mouvement ver empêchent bonne observation. Lévamisole a été utilisé traditionnellement pour empêcher tout mouvement de la vis sans fin sur l’agarose pad 24 , 25. Cependant, Levamisole inhibe les récepteurs neuronaux chez c. elegans et donc susceptibles d’affecter les événements trafic dans les neurones 15. À l’aide de microbilles de polystyrène décrit encore une bonne alternative 17.

  1. Sous un microscope stéréo avec une transillumination miroir coulissant, transfert ~ 30 vers transgéniques exprimant les marqueurs appropriées pour une nouvelle NGM plaque sans prendre de bactéries à l’aide d’un fil de platine.
    Remarque : Un choix de fil de platine est fait de fil de platine et pipette Pasteur (5 pouces), et l’extrémité du fil platine a été aplatie. La préparation des sélections de fil de platine et la manipulation de worms avec ces sont décrites dans le Wormbook (http://www.wormbook.org).
  2. Laisser la plaque pendant 1 min. bactéries sont automatiquement supprimés des surfaces vers comme les vers se déplacent sur gel d’agarose NGM sans bactéries.
  3. Put a 0,5 à 1,0 µL baisse de 2,6 % 100 nm de diamètre polystyrène microbilles dans l’eau sur le bloc de gélose ( Figure 1 D). Transfert vers 10-20 de la plaque NGM sans bactéries pour les microbilles. Drop et propagation les vers en utilisant le fil de platine choisir pour éviter le chevauchement des organes ( Figure 1 E) à vis sans fin.
  4. Appliquer une lamelle de 2 22 x 40 mm ( Figure 1 F). Pousser doucement pour enlever les bulles d’air, mais éviter les vers de concasseuse. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie.
    NOTE : Parce qu’aucune anesthésie n’est administré, worms sont fixés uniquement par la force de frottement générée par le bloc de gélose, microbilles de polystyrène et lamelle 17. La présence de bactéries chargeur et/ou trop solution fera la force de frottement plus faible.
    NOTE : Différentes tailles de lamelles couvre-objet (p. ex., 22 x 22 mm 2, 18 x 18 mm 2) fonctionnent. Cependant, les plus grandes lamelles couvre-objet peut empêcher immersion eau ou huile de la lentille de l’objectif une fuite dans les échantillons lors de l’observation.

5. Observation

Remarque : les paramètres appropriés d’imagerie (puissance du laser, gain, binning, etc.) seront différente pour chaque système de microscope et de la caméra. Microscope widefield équipé d’un scanner confocal de disque de filature et de la caméra CCD est utilisé ici,.

  1. Définir le contrôle de la température de l’étape à 20 ° C, ou régler la température ambiante de 20 ° C.
  2. Mettre la lame de l’échantillon sur la platine du microscope. Utilisez x 100 (ouverture numérique = 1.3 ou supérieur) objectif.
  3. Recherchez les zones indiquées en Figure 2 A (pour wyIs251 et transport axonal) ou Figure 2 B (pour mnIs17 et IFT) comme témoins positifs . Autres domaines peuvent être analysés comme bien 22.
  4. Jeu de paramètres (Gain CCD = 200, Binning = 1 ou 2, puissance du laser à 488 nm = 1,0 à 1,3 mW). Effectuer l’enregistrement lapse de temps à 4 images/s pour jusqu'à 1 min. enregistrer les fichiers en format TIFF mutli.
    Remarque : Si GFP signale disparaissent et il est difficile de continuer à observer GFP::RAB-3 ou OSM-6::GFP pour 30 s, la puissance du laser est trop forte. Dans ce cas, réduire la puissance du laser. À l’inverse, si aucun mouvement vésiculaire n’est enregistré, la puissance du laser est trop faible. Dans ce cas, augmenter la puissance du laser.
  5. Consultez un autre ver et recommencez 5.3 et 5.4. Les observations peuvent durer jusqu'à 20 min, mais chaque ver devrait être enregistrée qu’une seule fois pour éviter les effets de la photo dommage.
    Remarque : Les vers ont été observées pendant au moins 20 min sans défauts significatifs 7 , 27 , 28. Observation plus longue peut être possible, mais le havre ' t été encore testé. Un signe clair de la mort neuronale est le changement de morphologie neuronale comme gonflement des neurites. Comme les signaux faibles de GFP peuvent être vu dans les axones et les dendrites en wyIs251 et en mnIs17, les neurites morphologie peut être facilement vérifiée en regardant juste les axones ou dendrites. La morphologie neuronale est illustrée à la Figure 2.
  6. Générer des fichiers de film.
    1. Ouvert le Multi-TIFF fichier à l’aide de logiciels de Fidji. Allez dans fichier > accéder puis sélectionner le fichier Multi-TIFF enregistré à l’étape 5.4.
      Remarque : Les Fidji peut être téléchargé à jttps://fiji.sc. Image J et plugins peuvent aussi servir pour générer kymographs. Si ce faisant, suivez les instructions pertinentes pour le plugin choisie.
    2. cliquez le " sélection rectangulaire " bouton ( Figure 3 A, flèche) et sélectionnez la zone d’intérêt en dessinant un rectangle avec une souris d’ordinateur (rectangle jaune dans la Figure 3 A). Allez dans Image > piles > outils > faire la Revolution, puis sélectionnez le nombre de tranches qui est inclus dans le film. Un substack est généré.
    3. Activer la fenêtre de substack en cliquant et allez dans Image > Adjust > luminosité/contraste. Une fenêtre pour ajuster la luminosité et le contraste apparaît. Dans la fenêtre, faites glisser le haut bar (Minimum) vers la droite afin que le signal de fond disparaît et le second top bar (Maximum) vers la gauche alors que les vésicules et les particules mobiles peuvent être vu très bien sur le fond.
    4. Allez dans Image > piles > temps Stamper. Le film est enregistré à 4 images/s à l’étape 5.4, l’intervalle de temps est de 0,25 s. Ainsi, tapez " 0,25 " dans l’intervalle.
    5. Génère un fichier de séquence en sélectionnant enregistrer sous > AVI dans le menu fichier (film 1 et 2).
      Remarque : En utilisant des plugins appropriés, vous pouvez enregistrer le fichier sous d’autres formats tels que " mpeg4 " ou " mov " fichiers.
  7. Générer kymographs.
    1. Ouvrir les fichiers de film original à l’aide de logiciels de Fidji à nouveau et répéter les étapes 5.6.2 et 5.6.3 pour ajuster la luminosité et le contraste.
    2. Click " segments de ligne " ( Figure 3 B, flèche). À l’aide d’une souris, tracez une ligne segmentée le long des cils ou axon (ligne jaune, à la Figure 3 B).
    3. Aller à analyser > kymographes Multi > Multi kymographes ( Figure 3 C). Ligne largeur fenêtre s’affiche ( Figure 3 D). Type " 3 " dans la fenêtre largeur de raie et cliquez sur OK ( Figure 3 D).
    4. Kymographes fenêtre est créée. Enregistrer l’image au format TIFF ou JPEG.

Résultats

Transport axonal dans le neurone AD9
En utilisant la ligne de wyIs251 , les antérograde et rétrograde transport axonal de GFP::RAB-3 peut être enregistrée simultanément dans le motoneurone AD9. La vitesse moyenne d’antérograde et rétrograde transport dans l’axone proximale dorsale du neurone AD9 est environ 1.8 et 2,6 μm/s, respectivement22. Le nombre de vésicules mobiles est environ 0,03 et 0,018 par μm d’axone par s. A...

Discussion

Limitation en ce qui concerne les méthodes existantes
La méthode décrite ici est optimisée afin d’observer les événements rapides tels que le transport axonal et IFT. Ainsi, immobilisation est plus prioritaire que d’incubation plus longue. Alors que nous avons pu observer les événements trafic pendant au moins 20 min sans perturbation significative, cette méthode peut ne pas convenir toujours d’observer les événements lentes nécessitant des observations plus longues, telles que l’a...

Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

L’auteur remercie profondément Dr Asako Sugimoto (Université de Tohoku) pour son exposé utile. wyIs251 était un don généreux de m. Kang Shen (Stanford University). mnIs17 a été fourni par la CCG, qui est financée par le NIH Bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par la bourse JSPS KAKENHI #17 H 05010 et #16 H 06536 et Daiichi Sankyo foundation, Brain Science Foundation et la Fondation Naito.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Slideglass (76  x 26 mm)MatsunamiS1111
Coverglass (22  x 40 mm)MatsunamiC024401
AgaroseWako318-01195
Polystylene microbeads 0.1 micronPolysciences#00876
Heat blockTAITEC0063288-000CTU-mini
MicroscopeOlympusIX-71widefield microscope
Spinning disk ScannerYokogawaCSU-X1spinning disc confocal scanner 
Digital CCD cameraHamamatsu PhotonicsC10600-10BORCA-R2 degital CCD camera
Objective lens (x100, NA1.4)OlympusUPLSAPO 100XO
Pasteur pipette (5 inch)IWAKIIK-PAS-5P
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)IWAKI9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251Laboratory of Kang ShenN/A
OTL11: mnIs17Ref. 27, 29N/ASP2101 was backcrossed with wild type for 6 times
Stereo microscopeCarl Zeiss435064-9000-000STEMI 508 
Mirror transillumination unitCarl Zeiss435425-9010-000
platinum wire (0.2 mm)Nilaco Corporationm78483501
60 mm plastic dishFalcon#351007
FijiN/AN/Ahttps://fiji.sc/
nematode growth medium (NGM)  1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 

Références

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