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요약

꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 세포내 수송을 공부 하는 좋은 모델입니다. 여기, 내가 vivo에서 녹음 및 C. 선 충에 axonal intraflagellar 수송의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

Axonal 전송 및 intraflagellar 전송 (IFT) 축 삭과 속눈썹 morphogenesis 및 기능에 대 한 필수적입니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 분자 모터를 각각 참가자 및 역행 전송 규제 있습니다. 이 모터는 레일으로 microtubule 네트워크를 사용합니다. 꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 전송 및 IFT에서 vivo에서공부 하는 강력한 모델 생물 이다. 나 axonal 교통과 IFT 생활에서 관찰 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, C. 선 충. 수송된 화물 화물 단백질 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 형광 단백질을 사용 하 여 태그를 추가 하 여 구상 될 수 있다. C. 선 충 은 투명 하 고 GFP 태그 화물 단백질 세포 특정 발기인에서 특정 셀에 표현 될 수 있습니다. 살아있는 벌레 살인 또는 벌레를 마비 없이 10 %agarose 젤에 microbeads에 의해 해결할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 화물 움직임 관찰 될 수 있다 직접 축 삭 및 생활의 속눈썹에 절 개 없이 C. 선 충 . 이 메서드는 대상 단백질을 수정 하 여 셀 또는 셀에 표현에서 어떤 화물 분자의 관찰에 적용할 수 있습니다. 가장 기본적인 단백질 분자 모터 및 axonal 교통과 IFT에 관련 된 어댑터 단백질 C. 선 충에 보존 됩니다. 다른 모델 유기 체에 비해, 돌연변이 얻은 고 C. 선 충에 더 쉽게 유지. 이 메서드를 결합 하 여 다양 한 선 충 C. 돌연변이와 axonal 교통과 IFT의 분자 메커니즘 명확히 수 있습니다.

서문

라이브 셀 이미징 세포내 수송을 분석 하기 위한 필수적인 도구입니다. 신경 세포 생물학에서 라이브 셀 이미징 axonal 전송의 분석 신경 기능과 morphogenesis1를 이해 하기 위한 필수적입니다. 결함 axonal 전송에 여러 가지 신경 장애2기반이 됩니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 수행 axonal 전송 anterogradely 그리고 retrogradely, 각각1,2.

속눈썹은 다른 세포질 격실 있는 microtubule 네트워크 및 밀매 기계는 고도로 발달된3. 단백질 종합 기계 하지 속눈썹 팁 속눈썹 단백질 세포질에서 수송 되어야 한다 즉, 속눈썹에 지역화 됩니다. 속눈썹 전용 kinesin 다, 라는 각각 kinesin-2와 세포질 다-2, 속눈썹4, intraflagellar 전송 (IFT)5라는 현상의 구성 요소를 전송. IFT의 장애 ciliopathies6라는 질병의 스펙트럼을 발생 합니다. 따라서, 라이브 셀 이미징에 의해 IFT 메커니즘의 분석 속눈썹 형성과 pathogenesis의 기본 메커니즘을 이해 해야 합니다.

꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 교통과 IFT7,,89공부 하기 좋은 모델입니다. 관찰 하기 위해 IFT, Chlamydomonas 은 모델 생물5,6으로 널리 사용 되었습니다. Chlamydomonas 는 단 세포 유기 체, 노화, 신경 기능과 동작 IFT의 관계 분석 하기 어려울 것 이다. 또한, CRISPR/Cas9 등 필수 유전자 기술 하지 Chlamydomonas에 적용 되었을. 높은 모델 생물, 초파리, 쥐 등 자주 axonal 교통과 IFT 중단 하면 치명적인 고기 axonal 교통과 IFT morphogenesis 및 동물 10의 항상성 위해 필수적 이기 때문에 11. 마우스의 경우 세포 배양과 transfection은 일반적으로 필요 axonal 교통과 IFT, 많은 기술 및 광범위 한 시간12,13필요를 관찰 합니다. 또한, 중요 한 생리 적 맥락을 많이 배양된 세포 및 셀 손실 수 있습니다. C. 선 충 돌연변이 axonal 전송 또는 IFT 혼란 된다 신 경계는 벌레의 생존에 필수적 이기 때문에 없습니다 종종 치명적인7,,914. Axonal 교통과 IFT 관찰할 수 있습니다 직접 vivo에서 절 개 없이 선 충 C. 투명 이며 따라서 GFP 태그 마커를 관찰 하기 쉽게 때문에.

C. 선 충, 마 취16, 또는 microbeads17미세 장치15, agarose 패드를 사용 하 여 고정을 여러 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 마 취의 포함 신경15밀매 이벤트를 억제 수 있습니다. 미세 장치 메서드는 분명 단점은 그 미세 장치를 준비 하 고 항상 쉽지 않다입니다. 대신, immobilization agarose 패드와 microbeads에 의해 C. 선 충에서 시간 경과 화상 진 찰을 수행 하는 편리 하 고 쉬운 방법 이다. 여기, 제가 설명 C. 선 충 을 무력화 하 고 시각화 axonal 전송 IFT에서 vivo에서 에서이 기본 프로토콜 C. 선 충. 다른 방법에 비해, 여기 설명 하는 방법을 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 훨씬 저렴 하 고 쉽게 수행 하는.

프로토콜

1. 샘플 준비

  1. 생성 유전자 변형 C. 선 충 유전자 변형 방법론 18를 사용 하 여 관심사의 변형. 또는, 적절 한 긴장을 꼬마 유전학 센터 (CGC)에서 가져옵니다. 시 냅 스 소포 선구자의 axonal 전송을 시각화 하려면 유전자 변형 라인 wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT 관찰, 유전자 변형 라인 mnIs17 [osm 6::gfp] 19를 얻을. 이러한 긴장은이 프로토콜에 사용 됩니다.
    참고: 중 extrachromosomal 배열, 게놈 통합, 또는 심지어 GFP 노크에 작품. 배경 신호를 줄이기 위해, 사용 하 여 셀 특정 발기인 보다는 팬-신경 발기인.
    참고: 벌레의 유지 관리는 다른 프로토콜 20에 설명 되어 있습니다. 변종 선 충 류 성장에 Escherischia 대장균 OP50 급지대의 잔디밭에 유지 되었다 중간 (NGM) 접시 (1.7% (w/v) agarose, 50 mM NaCl, 0.25% (w/v) 펩, 1mm CaCl 2, 5mg/mL 콜레스테롤, 25mm KH 2 포 4, 1mm MgSO 60 mm 직경 플라스틱 접시에 4) 20 ° c.
  2. 성장 벌레의 어떤 라이프 사이클 단계로 NGM 접시에 20 ° C에서 웜.
    참고: 모든 단계에서 axonal 교통과 IFT를 관찰할 수 있다 하나. 여러 게시 이러한 단계와 시각화 된 밀매 이벤트 14 , , 21 22 사용 하기 때문에 젊은 성인 늦은 L4 좋은 긍정적인 통제는 , 23.

2. 10%의 준비 Agarose

참고: 한 천, 한 천 분말, agarose 등 유사한 제품을 제공 하는 많은 공급 업체. 전기 이동 법 학년 agarose를 사용 하 여 (강도 젤 > 1200 g/c m 2). 저렴 한 천 분말 결과 젤은 충분히 강한 벌레를 무력화 하기 때문에 작동 하지 않습니다.

  1. 믹스 0.4 g agarose 4에서 mL 증류수 (DW) 유리 튜브 (1.5 c m x 10.5 c m). 뚜껑을 증발을 피하기 위해 유리 튜브에 넣어.
  2. 90 분 동안 95 ° C 열 블록에 유리 튜브를 넣어. 또한, 다른 유리 튜브 (1.5 c m x 10.5 c m) DW 가득 준비 하 고 95에서 계속 ° C. 넣어 파스퇴르 피펫으로 95 ° C DW ( 그림 1 A). 작은 거품을 많이 agarose 튜브에서 볼 것 이다 그리고 솔루션 탁 되어야 합니다. 솔루션 취소 될 때까지 놔 둬. 다음, agarose 솔루션 균질 될 때까지 아래로 pipetting 혼합.
    참고: 전자 레인지 10 %agarose 솔루션 DW agarose에서 만든 때를 준비 하는 사용할 수 없습니다. 전자 레인지에 의해 발생 하는 작은 거품 agarose 녹는 것을 방지 합니다. 그러나, 응고 10 %agarose 젤 수 있습니다 쉽게 될 녹아 전자 레인지를 사용 하 여 다시. 10 %agarose 젤을 포함 하는 유리 튜브 미리 준비 하 고 6 개월 이상 4 ° C에서 저장 수 있습니다. 이렇게 필요할 때 전자 레인지를 사용 하 여 주식을 용 해 하 고이 프로토콜의 3 단계에서 시작.
    참고: Agarose 점차적으로 또는 반복된 응고 및 용 해 후 오랜 시간 동안 95 ° C에서 incubated 경우 응고 능력을 잃는다. 이 경우, 준비 새로운 10 %agarose.

3. Agarose 패드의 준비

  1. 따뜻하게 파스퇴르 피펫으로 단계 2.2에서에서 준비를 사용 하 여 76 x 22 mm 슬라이드 위에 2 방울 10 %agarose.
  2. 빨리 agarose 강하 하기 전에 두 번째 76 x 22 m m 2 슬라이드 커버 굳은 에서처럼 그림 1 B, 그리고 밀어 아래로 두 번째 슬라이드에 agarose 솔루션을 평평 하 게. 두께 0.5-1 이어야 한다 m m.
  3. 신속 하 게 파스퇴르 피펫으로 여 플러시 pipetting 95 ° C DW 위아래로 agarose 솔루션은 밖으로 세척 될 때까지. 그렇지 않으면,는 피펫으로 agarose 젤에 의해 막힌 될 것입니다. 95 ° C DW에에서 피 펫 서 둡니다.
  4. 잠깐 1 분입니다. Agarose 패드 고 흐린 되. 그런 다음 ( 그림 1 C) 손으로 떨어져 슬라이드 슬라이드.

4. 벌레의 장착

참고:도 적은 양의 웜 운동 방지 좋은 관찰. Levamisole는 agarose 패드 24 , 25에 웜 움직임을 방지 하기 위해 전통적으로 사용 되었습니다. 그러나, Levamisole C. 선 충에 있는 신경 수용 체를 억제 하 고 따라서 신경 15 밀매 이벤트에 영향을 미칠 수 있습니다. Hereis 좋은 대체 17 설명 사용 하 여 폴리스 티 렌 microbeads.

    • Slidable 미러 transillumination를 장착 스테레오 현미경, 전송 ~ 30 새로운 NGM 적절 한 표시자를 표현 하는 유전자 변형 웜 접시 없이 박테리아 백 금 철사를 사용 하 여 선택.
      참고: 백 금 철사 선택 백 금 철사 및 만든 파스퇴르 피 펫 (5 인치), 그리고 백 금 철사의 끝이 평평 했다. 백 금 철사 추천의 준비 및 취급이 벌레의 Wormbook (http://www.wormbook.org)에 설명 되어 있습니다.
    1. 접시를 두고 1 분 박테리아는 자동으로 제거 됩니다 벌레의 표면에서 벌레 세균 없이 NGM agarose 젤에 이동.
    2. 넣어는 0.5-1.0 µ L의 2.6 %100 nm 직경 폴리스 티 렌 microbeads 천 패드 ( 그림 1 D)에 물에 드롭. 박테리아 없는 NGM 플레이트의 10-20 벌레는 microbeads에 전송. 방울과 백 금 철사를 사용 하 여 벌레의 중복을 피하기 위해 선택 확산 벌레 시체 ( 그림 1 E).
    3. 22 x 40 m m 2 coverslip ( 그림 1 F) 적용 됩니다. 공기 방울을 제거 하지만 분쇄 웜 방지 부드럽게 밀어. 샘플은 지금 영상에 대 한 준비.
      참고: 아무 마 취 관리 때문에 벌레만 천 패드, 폴리스 티 렌 microbeads coverslip 17에 의해 생성 된 마찰 힘에 의해 고정 됩니다. 급지대 박테리아 너무 많은 솔루션의 존재는 마찰 힘 약한 하게된다.
      참고: (예를 들어, 22 x 22 m m 2, 18 x 18 m m 2) coverslips의 다른 크기를 작동합니다. 그러나, 더 큰 coverslips 침수 물 또는 오일 샘플 관찰 하는 동안 유출 대물 렌즈에서 방지할 수 있습니다.

    5. 관찰

    참고: 적절 한 이미징 매개 변수 (레이저 전력, 이득, 범주화, 등) 각 현미경 시스템 및 카메라에 대 한 다를 것 이다. 여기, 회전 디스크 confocal 스캐너와 디지털 CCD 카메라 widefield 현미경 사용 됩니다.

    1. 20 ° c, 무대의 온도 제어를 설정 하거나 조정 실내 온도 20 ° c.
    2. 샘플 슬라이드를 현미경 무대 위에. 100 x를 사용 하 여 (수 가늠 구멍 = 1.3 또는 더 나은) 렌즈.
    3. 그림 2 A (wyIs251 및 axonal 전송) 또는 그림 2 B (mnIs17와 IFT) 긍정적인 컨트롤에 표시 된 영역에 대 한 보고 . 다른 분야는 잘 22로 분석 될 수 있다.
    4. 세트 매개 변수 (CCD 이득 = 200, Binning = 1 또는 2, 488에서 레이저 전원 nm = 1.0-1.3 mW). 시간 경과 기록 4 프레임/s에서 최대 1 분 mutli-TIFF 형식으로 파일 저장에 대 한 수행.
      참고: 경우 GFP 신호 사라지고 GFP::RAB 3 또는 OSM 6::GFP 30에 대 한 관찰을 계속 하기가 s, 레이저 힘이 너무 강해. 이 경우, 레이저 파워를 줄일 수 있습니다. 반대로, 기공을 운동 기록 레이저 파워는 너무 약하다. 이 경우, 레이저 파워 증가.
    5. 다른 벌레를 관찰 하 고 5.3 및 5.4 반복. 관측 최대 20 분 동안 지난 수 있습니다 하지만 각 웜 p의 효과 피하기 위해 한 번만 기록해 야hoto 손상.
      참고: 중요 한 결함 7 , , 27 28 없이 적어도 20 분 동안 벌레 관찰 되었습니다. 더 이상 관찰 가능 피난처 있을 수 있습니다 ' t 되었습니다 아직 테스트. 신경 죽음의 명확한 표시 neurite 붓기 같은 신경 형태학의 변화 이다. 약한 GFP 신호는 축 삭과 dendrites wyIs251와 mnIs17에서 볼 수 있는, neurite 형태학 축 삭 또는 모 수석 보고 그냥 쉽게 확인할 수 있습니다. 신경 형태는 그림 2에 표시 됩니다.
    6. 동영상 파일 생성.
      1. 오픈 멀티 TIFF 파일 피지 소프트웨어를 사용 하 여. 파일 이동 > 오픈 단계 5.4에에서 저장 된 멀티 TIFF 파일을 선택 합니다.
        참고: 피지는 jttps://fiji.sc에서 다운로드할 수 있습니다. 이미지 J와 플러그인 또한 kymographs를 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이렇게 하는 경우 선택한 플러그인. 관련 지침에 따라
      2. 클릭는 " 사각형 선택 " ( 그림 3, 화살표) 버튼과 선택 사각형을 그려서 관심 영역 으로 컴퓨터 마우스 (노란색 사각형 그림 3 A). 이미지로 이동 > 스택 > 도구 > Substacks 고 영화에 포함 된 슬라이스 번호를 선택 하십시오. 생성 되는 substack.
      3. Substack 창을 클릭 하 여 활성화 하 고 이미지로 이동 > 조정 > 밝기/대비. 밝기 및 대비를 조정 하는 창이 나타난다. 창에서 슬라이드 상단 바 (최소) 오른쪽에 배경 신호 사라진다 고 두 번째 최고 (최대) 바 왼쪽 그래서 그 움직이는 소포 및 입자 볼 수 있는 배경 위에 아주 잘.
      4. 이미지로 이동 > 스택 > Stamper 시간. 영화 단계 5.4에서에서 4 프레임/s, 기록 시간 간격 이다 0.25 s. 따라서, 입력 " 0.25 " 간격에서.
      5. 다른 이름으로 저장을 선택 하 여 동영상 파일 생성 > AVI 파일 메뉴 (영화 1, 2).
        참고: 적절 한 플러그인을 사용 하 여 저장할 수 있습니다 파일을 다른 형식으로 같은 " mpeg4 " 또는 " mov " 파일.
    7. 생성 kymographs.
      1. 피지 소프트웨어를 사용 하 여 다시 원래의 동영상 파일을 열고 단계 5.6.2 5.6.3 밝기 및 대비를 조정 하려면 반복.
      2. 클릭 " 세그먼트 라인 " ( 그림 3 B, 화살표). 속눈썹 또는 축 삭 (노란 선, 그림 3 B에) 따라 세그먼트 선을 그리는 마우스를 사용 하 여.
      3. 이동 분석 > 멀티 Kymograph > 멀티 Kymograph ( 그림 3 C). 선 폭 창이 나타납니다 ( 그림 3 D). 유형 " 3 " 선 폭 창에서 확인을 클릭 합니다 ( 그림 3 D).
      4. Kymograph 창이 생성 됩니다. TIFF 또는 JPEG 형식으로 이미지를 저장.

    • 결과

    DA9 신경 axonal 전송
    WyIs251 선, 참가자 및 GFP::RAB-3의 역행 axonal 수송을 사용 하 여 DA9 모터 신경에 동시에 기록 될 수 있습니다. 참가자 및 역행 DA9 신경 근 등 축 삭에서의 평균 속도 약 1.8, 2.6 μ m/s, 각각22. 움직이는 소포 수 0.03 μ s 당 축 삭의 당 0.018에 대 한 것입니다. 따라서, 100 x 렌즈를 사용 하 여 DA9 축 삭의 10 μ m의 30 s 관찰, 대 한 ...

    토론

    기존의 방법에 관하여 제한
    여기 설명 하는 방법은 관찰 axonal 전송 등 IFT 빠른 이벤트 최적화 됩니다. 따라서, 동원 정지는 더 이상 부 화 보다 우선 됩니다. 우리는 중요 한 섭 동 없이 적어도 20 분 동안 매매 이벤트를 관찰할 수 있다,이 방법은 않을 수 있습니다 항상 축 삭 신장 등 셀 마이그레이션 더 이상 관찰을 요구 하는 느린 이벤트를 관찰 하는 적당 한. 더 이상 관찰에 대 한 ?...

    공개

    저자는 공개 상관이 있다.

    감사의 말

    깊이 저자 박사 아 사코 스 기 모토 (도호쿠 대학) 그녀의 도움이 토론 감사합니다. wyIs251 박사 강 쉔 (스탠포드 대학)에서 관대 한 선물 했다. mnIs17 는 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금 CGC에 의해 제공 했다. 이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 #17 H 05010 및 #16 H 06536와 다이 이치 산 쿄 재단, 뇌 과학 재단과 나이토 재단에 의해 지원 되었다.

    자료

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Slideglass (76  x 26 mm)MatsunamiS1111
    Coverglass (22  x 40 mm)MatsunamiC024401
    AgaroseWako318-01195
    Polystylene microbeads 0.1 micronPolysciences#00876
    Heat blockTAITEC0063288-000CTU-mini
    MicroscopeOlympusIX-71widefield microscope
    Spinning disk ScannerYokogawaCSU-X1spinning disc confocal scanner 
    Digital CCD cameraHamamatsu PhotonicsC10600-10BORCA-R2 degital CCD camera
    Objective lens (x100, NA1.4)OlympusUPLSAPO 100XO
    Pasteur pipette (5 inch)IWAKIIK-PAS-5P
    Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)IWAKI9820TST15-105NP
    TV9211: wyIs251Laboratory of Kang ShenN/A
    OTL11: mnIs17Ref. 27, 29N/ASP2101 was backcrossed with wild type for 6 times
    Stereo microscopeCarl Zeiss435064-9000-000STEMI 508 
    Mirror transillumination unitCarl Zeiss435425-9010-000
    platinum wire (0.2 mm)Nilaco Corporationm78483501
    60 mm plastic dishFalcon#351007
    FijiN/AN/Ahttps://fiji.sc/
    nematode growth medium (NGM)  1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 

    참고문헌

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