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Resumen

Este manuscrito presenta un detallado método para la generación X-cromosoma brazo sondas y rendimiento en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para examinar el estado de la hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase detenido Drosophila ovocitos. Este protocolo es adecuado para determinar si cohesión brazo meiótica es intacta o interrumpida en diferentes genotipos.

Resumen

En los seres humanos, errores de la segregación del cromosoma en ovocitos son responsables de la mayoría de los abortos espontáneos y defectos de nacimiento. Por otra parte, como la edad de las mujeres, el riesgo de concebir que un feto aneuploide aumenta considerablemente y este fenómeno se conoce como el efecto de la edad materna. Un requisito para la segregación del cromosoma exacta durante las divisiones meióticas es mantenimiento de hermana cohesión de cromátidas hermanas durante el período de profase prolongada experimentan de ovocitos. Pruebas citológicas en los seres humanos y organismos modelo sugieren que la cohesión meiótica se deteriora durante el proceso de envejecimiento. Además, errores de segregación en ovocitos humanos son más frecuentes durante la meiosis I, consistente con la prematura pérdida de cohesión del brazo. El uso de organismos modelo es fundamental para desentrañar los mecanismos que subyacen a la pérdida depende de la edad de la cohesión. Drosophila melanogaster ofrece varias ventajas para el estudio de la regulación de la cohesión meiótica de ovocitos. Sin embargo, hasta hace poco, sólo las pruebas genéticas estaban disponibles para análisis por pérdida de cohesión de brazo en ovocitos de diferentes genotipos o bajo diferentes condiciones experimentales. Aquí, un protocolo detallado es siempre para usar fluorescencia en situ hibridación (FISH) para visualizar directamente defectos cohesión brazo en Prometafase y metafase arresté a ovocitos de Drosophila . Generando una sonda de pescado que cruza por hibridación en el brazo distal del cromosoma X y recolectando pilas Z confocales, un investigador puede visualizar el número de señales individuales de peces en tres dimensiones y determinar si la hermana chromatid brazos son separados. El procedimiento descrito permite cuantificar defectos de cohesión brazo de cientos de ovocitos de Drosophila . Como tal, este método proporciona una herramienta importante para la investigación de los mecanismos que contribuyen al mantenimiento de la cohesión, así como los factores que conducen a su desaparición durante el proceso de envejecimiento.

Introducción

Adecuada segregación de los cromosomas durante la mitosis y la meiosis requiere que hermana cohesión de cromátidas hermanas establecido, mantenido y liberado en una coordinada1,2. Cohesión se establece durante la fase S y es mediada por la cohesin complejo, que forma vínculos físicos que sostienen la hermana chromatids juntos. En la meiosis, cohesión distal a un crossover también funciona para unir homólogos recombinantes y esta asociación física ayuda a asegurar la orientación correcta del bivalente en la metafase del huso (figura 1)3,4, 5. Liberación del brazo de cohesión en el anaphase permite los homólogos segregar a los polos opuestos del huso. Sin embargo, si la cohesión del brazo es perdido prematuramente, recombinantes homólogos perderá su conexión física y segregan al azar, que puede dar lugar a gametos aneuploides (figura 1).

En ovocitos humanos, errores en la segregación cromosómica están la causa principal de abortos espontáneos y defectos de nacimiento, como síndrome de Down6, y su incidencia aumenta exponencialmente con la edad materna7. Cohesión de cromátidas se estableció en ovocitos fetales y la recombinación meiótica se completa antes del nacimiento. Ovocitos luego arrestar en mitad de la profase I hasta la ovulación y durante esta detención, la asociación física continua de homólogos recombinantes depende de la cohesión de cromátidas hermanas hermana. Por lo tanto, exacta segregación durante meiosis y los resultados del embarazo normal requiere que cohesión permanecen intactas hasta cinco décadas.

Pérdida prematura de cohesión durante el prolongado arresto meiótico de ovocitos humanos se ha propuesto contribuir al efecto de la edad materna y múltiples líneas de evidencia apoyan esta hipótesis8,9. Sin embargo, dado los desafíos de estudiar cohesión meiótico de ovocitos humanos, gran parte de nuestra comprensión de este fenómeno se basa en el uso del modelo organismos5,10,11,12, 1314,de,15.

Drosophila melanogaster ovocitos ofrecen numerosas ventajas para el estudio de la segregación meiótica de cohesión y cromosoma. Un simple análisis genético permite recuperar progenie de gametos aneuploides y medir la fidelidad de los X-la segregación cromosómica en una gran escala11,16,17. Por otra parte, uno puede determinar también si errores de segregación del cromosoma ocurren porque missegregate recombinantes homólogos durante la meiosis I, un fenotipo que es consistente con la prematura pérdida de brazo cohesión11,18, 19. observación del estado de cohesión meiótica de ovocitos de Drosophila también es posible usar en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) directamente. Aunque fluorescentes oligonucleótidos que hibridan a secuencias repetitivas satélite han utilizado por más de una década para controlar pericentromeric cohesión en maduro Drosophila ovocitos4,20, análisis del brazo cohesión ha sido mucho más difícil. Visualización del estado de la cohesión del brazo requiere una sonda que abarca una extensa región de copia solo secuencias y es lo suficientemente brillante para dar lugar a señales visibles para cada hermana cromátides cuando existe cohesión de brazo. Además, las condiciones de fijación ovocitos y tamaño de los DNAs marcados deben facilitar penetración21 dentro del óvulo maduro grande de Drosophila (200 μm ancho por 500 μm de largo). Recientemente, un sondeo de brazo fue exitosamente utilizados visualizar Drosophila cromátides de ovocitos durante la anafase I, pero los autores indicó que no pudo detectar una señal en Prometafase o metafase detenido ovocitos22. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la generación de X-cromosoma brazo sondas de FISH y las condiciones de preparación de ovocitos que nos han permitido analizar por la prematura pérdida de hermana cohesión de cromátidas hermanas en Prometafase y metafase I ovocitos. Estas técnicas, que nos han permitido identificar productos génicos que se requieren para el mantenimiento de la cohesión meiótica, permitirá a otros análisis para hermana cohesión de cromátidas hermanas defectos en ovocitos maduros de Drosophila de diferentes genotipos.

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Protocolo

1. preparaciones

  1. Preparar soluciones en situ hibridación de la fluorescencia (pescado). Preparar todas las soluciones con agua ultrapura.
    1. Preparar 5 x buffer de Robb modificado: acetato de potasio de 275 mM, acetato de sodio 200 mM, sacarosa 500 mM, 50 mM de glucosa, cloruro de magnesio de 6 mM, cloruro de calcio de 5 mM, 500 mM HEPES pH = 7.4. Llevar el pH a 7,4 con 10 N NaOH. Filtro de esterilizar y almacenar a-20 ° C. Descongelar y diluir a 1 x si es necesario y almacenar en alícuotas de x 1 a-20 ° C.
    2. Preparar 10 x tamponada fosfato salino (PBS) con 1,3 M de NaCl, m 70 Na2HPO4, 30 mM NaH2PO4. Llevar el pH a 7.0 con NaOH N 10. Esterilizar por autoclave o filtro de esterilización.
  2. Preparación de poli-l-lisina cubreobjetos un día antes de que sea necesario.
    1. Pipeta de etanol al 70% que contiene 1% de ácido clorhídrico en la superficie de un cubreobjetos 18 x 18 mm #1.5 e incubar 5 min aspiración uso para eliminar el líquido. Repetir con agua ultrapura estéril. Cubrir la superficie del cubreobjetos con poli-l-lisina 0.1 mg/mL e incubar durante 10 minutos.
    2. Aspirar para eliminar el líquido y secar durante 10 minutos tienda cubreobjetos poli-l-lisina lado hacia arriba en un recipiente de plástico con tapa bien ajustada para evitar el polvo al aire.
  3. Preparar tirado Pasteur Pipetas para eliminar soluciones líquidas sin la eliminación de los ovocitos. Sobre una llama de mechero de Bunsen, caliente la mitad de una pipeta Pasteur de vidrio largo tirando suavemente en cada extremo hasta que el vidrio se derrite y se tira aparte.

2. generación de brazo sonda para peces

Nota: Todos los pasos de la centrifugadora se realizan a 21.000 ~ 16.000 x g (velocidad máxima en la mayoría microcentrifuges mesa). Breve centrifugadora gira indica giro para 5-15 s. Vortex indica un vórtex durante 15 ~ s a un máximo de velocidad a menos que se indique lo contrario.

Nota: BACs para sondas de brazo pueden obtenerse recursos de BAC PAC. Dos sondas de euchromatic del brazo de cromosoma X se han utilizado con éxito con este método. Una sonda de brazo fue compuesta de seis clones BAC correspondiente a citológico bandas 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). La otra punta de prueba del brazo consistió de seis clones BAC corresponde a bandas citológico 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs a otro cromosoma de Drosophila regiones pueden ser consultadas en: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Dos sondas de pericentric que reconocen la repetición de satélite bp 359 del cromosoma X se han utilizado con éxito con este método. Una sonda de 22 nucleótidos se ha utilizado ampliamente y funciona bien (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. Una sonda 28 nucleótidos fue probada recientemente y también funcionó bien (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC purificada oligonucleótidos 5' marcado con un fluoróforo específico fueron ordenados de una fuente comercial (por ejemplo, tecnologías integradas de la DNA).

  1. Preparación de ADN de clones BAC siguiendo las instrucciones del kit como se especifica en la Tabla de materiales. Resuspender el precipitado de ADN obtenido de 100 mL de cultivo en 200 μL de TE; la concentración final de ADN debe estar comprendida entre 5-40 ng/μl dependiendo del clon BAC.
  2. Realizar amplificación de DNA para cada BAC utilizando el kit de amplificación, como se especifica en la tabla de materiales y el siguiente protocolo. Proceso de ADN BAC para cada clon individualmente. Uso de enzimas y buffer suministrado con el kit en pasos 2.2.1 a 2.2.3.
    1. Fragmentación al azar de ADN BAC: cada BAC TE utilice para preparar 10 μl de una solución de ADN ng/μL 1 en un tubo PCR de 200 μl. Añadir 1 μl de 10 X Buffer de fragmentación. Coloque el tubo en una máquina PCR a 95 ° C exactamente 4 minutos enfríe inmediatamente la muestra en agua con hielo y centrifugar brevemente. La incubación es tiempo sensible y cualquier desviación puede alterar los resultados.
    2. Preparación de la biblioteca
      Nota: Este método utiliza cebadores aleatorios para generar una biblioteca de fragmentos amplificable.
      1. Al tubo que contiene el ADN añadir lo siguiente: 2 μl de 1 x biblioteca preparación Buffer, 1 μl de solución de biblioteca de estabilización. Mezclar bien todo con un vórtex, centrifugar brevemente y coloque el tubo en la máquina PCR a 95 ° C por 2 minutos inmediatamente enfriar la muestra en agua con hielo y centrifugar brevemente.
      2. Añadir 1 μl de enzima de preparación de biblioteca para el tubo PCR, mezcle y centrifugue brevemente. PCR de lugar el tubo en la máquina PCR e incubar como sigue: 16 ° C por 20 min, 24 ° C por 20 min, 37 º C durante 20 min, 75 ° C por 5 min, después llevar a cabo a 4 ° C.
      3. Extraer muestras de la máquina de la polimerización en cadena y centrifugar brevemente. Muestras pueden ser amplificadas inmediatamente o almacenadas a-20 ° C hasta por tres días.
    3. Amplificación de ADN de BAC biblioteca
      1. Añadir los siguientes reactivos para la reacción entera del fragmento al azar de 15 μl: 7.5 μl 10 x amplificación Master Mix, 47.5 μL agua libre de nucleasa, 5 μl ADN polimerasa de WGA. Mezclar completamente por Vortex y centrifugar brevemente.
      2. PCR de lugar el tubo en la máquina PCR e incubar como sigue: primera desnaturalización 95 ° C por 3 min, 14 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 15 s, seguido de recocido/extensión a 65 ° C por 5 min, después llevar a cabo a 4 ° C.
      3. Tras completar el ciclo, ensayo de la concentración de ADN. La concentración de ADN debe ser por lo menos 800 ng / μl. Mantenga las muestras a 4 ° C o almacenar a-20 ° C hasta listo para la digestión. Opcionalmente, evaluar el tamaño del fragmento de ADN mediante la ejecución de 400 ng de ADN en gel de agarosa al 2%. Fragmentos deben estar comprendida entre 200 bp a 3 kb (figura 2).
  3. Digestión de la enzima de restricción de ADN amplificado
    1. Lugar 20 μg de DNA amplificada en la sección anterior en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Agregar 20 unidades de Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 unidades de BfuCl, 0.5 BSA de x 100 μl, 5 μl 10 x buffer de enzima de la restricción digestión y ajustar el volumen a 50 μl al añadir la cantidad apropiada de la poste-limpieza de H2O.
    2. Incubar el Resumen durante la noche a 37 ° C en una incubadora para evitar la condensación en la tapa. Etanol precipitar el ADN digerido. Añadir a la recopilación: 1 glucógeno μl, acetato de sodio de 3 M volumen 1/10, 2,5 volúmenes grado molecular 100% etanol. Incubar a-80 ° C durante 1 h o durante la noche.
    3. Centrifugar por 30 min a 4 ° C. Pellet de ADN de lavado con 1 volumen de etanol al 70% temperatura ambiente y centrifugado durante 5 minutos a 4 ° C. Quite el sobrenadante y deje el ADN pellets secado al aire o secar con suavidad con un flujo constante de aire.
    4. Resuspender el precipitado de DNA en 36 μl estériles ultrapura H2O y use 1 μl de ADN para análisis de la concentración de ADN, que debe ser aproximadamente 285 ng / μl. almacenar el ADN a-20 ° C.
    5. Opcionalmente evaluar tamaño del fragmento de ADN funcionando 400 ng de ADN en gel de agarosa al 2%. Fragmentos de la mayoría deben estar comprendida de bp 100-200, con una señal más débil hasta 500 bp (figura 2).
  4. 3' reacción de jales
    1. Desnaturalizar el ADN digerido a 100 ° C por 1 min en un bloque de calor. Inmediatamente enfriar en agua con hielo. A los 35 μl de ADN, agregue lo siguiente: 50 μl cacodilato de sodio de 400 mM, 1 μl de 10 mM DTT y agitar bien. Añadir 4 μL de 25 mM CoCl2, 2,5 μl 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP desde ARES etiquetado kit como se especifica en la tabla de materiales, 5 μL 1 mM dTTP, 18 μL buffer de x TdT 5 y transferasa terminal del deoxynucleotidyl de 1 μl (TdT) 400 U / μl. Vortex y centrifugar brevemente.
      PRECAUCIÓN: CoCl2 es tóxico, usar protección adecuada.
    2. Incubar por 2 h a 37 ° C en una incubadora para evitar la condensación. Añadir 1 μl de EDTA para detener la reacción y vortex para mezclar 250 mM. Etanol precipitar el ADN cola como se describió anteriormente (pasos 2.3.2 - 2.3.4). Resuspender el precipitado de ADN seco en 10 μl estériles ultrapura H2O. tienda el ADN a-20 ° C hasta que esté listo para continuar.
  5. Conducta verbal de colorante fluorescente utilizando el kit de ADN etiquetado como se especifica en la tabla de materiales.
    Nota: Una vez que el tinte se agrega Mantenga las muestras en la oscuridad.
    1. Desnaturalizar el ADN cola a 95 ° C por 5 min en un bloque de calor. Inmediatamente enfriar ADN en agua con hielo y centrifugar brevemente. Preparar el tampón etiquetado según las instrucciones del juego y añadir 6 μl de cada muestra de ADN. Agite cada tubo de tinte en 4 μL de DMSO del kit. Vortex y centrifugar brevemente.
    2. Utilice un tubo de tinte para cada reacción de etiquetado. Añadir la solución de colorante al ADN, vortex y centrifugar brevemente. Incubar la reacción etiquetadora a temperatura ambiente durante 2 h en la oscuridad. Agregar 3 μl de hidroxilamina de 3M para detener la reacción seguida por 77 μl de la nucleasa-H2O del kit. Vortex y centrifugar brevemente.
  6. Quitar tinte no utilizando el kit de purificación de la PCR como se especifica en la tabla de materiales. Siga las instrucciones del fabricante. Eluir el ADN de la columna dos veces con 40 μl de tampón de elución de cada vez.
  7. Etanol precipitar el ADN etiquetado como descrito anteriormente (pasos 2.3.2 - 2.3.4). Resuspender el precipitado de ADN seco en 10 μl de tampón de elución.
  8. Preparar mezcla de sonda
    1. Etiquetado ADN, determinar la concentración de la tintura de fluorocromo en pmol/μl. La concentración del fluoróforo puede variar entre 30-100 pmol/μl, dependiendo del BAC. La concentración de ADN puede variar entre 300-800 ng/μl.
      Nota: El ajuste de microarray funciona bien en un espectrofotómetro microvolume, como especificado en la tabla de materiales. En la ventana de microarrays, seleccione ADN-50 y especifique el fluorocromo.
    2. Crear una mezcla maestro combinando cantidades equimolares (fluor pmol) de cada una de las puntas de prueba de BAC. Vortex 30 s antes de combinar. Para evitar congelaciones y descongelaciones, preparar alícuotas de la mezcla principal, película de parafina se aplican a los tubos para evitar la evaporación y almacenar en la oscuridad a-20 ° C.
      Nota: Un mastermix que contiene 250 pmol de cada uno de los BAC individual 6 sondas en un volumen total de 30-50 μl funciona bien. Una alícuota que contenga 25 pmol (fluor) para cada BAC bastarán para las reacciones de hibridación de dos 40 μl, con una concentración final de la sonda de fluor de 0.31 pmol/μL para cada BAC.

3. disección y fijación de los ovocitos

  1. Recoger 30 hembras vírgenes del genotipo correspondiente. Para enriquecer de ovocitos finales de etapa, mantener hembras sin machos en un frasco con mosca comida y levadura seca durante 3-5 días antes de la disección25. El día antes de la disección, transferir las hembras sin gas a un vial nuevo con levadura.
  2. Realizar la disección.
    Nota: Consulte la figura 3 para las herramientas necesarias. Soluciones se eliminan usando una pipeta Pasteur tirada a menos que se indique lo contrario. Al transferir los ovarios siempre utilizar una pipeta con una solución de BSA de 10%.
    1. En un plato bajo disección con tampón de Robb modificado, utilice pinzas para extraer los ovarios de una sola hembra. Uso de pinzas o una aguja de tungsteno para splay suavemente cada ovario, permitiendo que la solución en contacto con interior ovariolas. Transferir el par de ovarios extendidos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con tampón de 1 mL modificado Robb.
    2. Repita el paso 3.2.1 para acumular los ovarios de las hembras 20-25 en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Acabado de las disecciones de las hembras de 20 a 25 en 10 minutos.
  3. Realizar fijación como sigue.
    1. Con una pipeta Pasteur tirada, extraer el líquido en el tubo de microcentrífuga, utilice una P1000 para rápidamente añadir 500 μl de solución de solución de 37 ° C a los ovarios y luego inmediatamente agregar 500 μl del heptano de temperatura a los ovarios.
    2. Tubo de microcentrífuga de agitar para mezclar y colocar en un nutator durante 3 minutos Retire el tubo de microcentrífuga del nutator y el lugar en un bastidor de tubo de 1 minuto permitir que los ovocitos para instalarse en la parte inferior. El tiempo de fijación total es 4 minutos.
      PRECAUCIÓN: Solución Fix y heptano son tóxicos, usar protección adecuada.
    3. Retirar la solución de fix y enjuague los ovarios 3 veces en 500 μl de PBS con 0,5% BSA y 0,1% Tritón X-100 (PBSBTx)
  4. Repita para el resto genotipos.

4. eliminación de Chorions y las membranas vitelinas

Nota: Consulte la figura 3 para las herramientas necesarias.

  1. Ovocitos de etapa tardía separado
    1. Añadir 1 mL de PBSBTx a un plato bajo de la disección. Utilizar un P200 con una punta cubierta de BSA para transferir ovarios fijos (de ~ 150 μL) en el plato bajo. Pipetear los ovarios arriba y abajo con la punta de la pipeta revestido de BSA para desalojar los ovocitos maduros de los ovocitos maduros menos.
    2. Cuando ovocitos de etapa tardía están suficientemente separados, transferir el tejido a un tubo de microcentrífuga de 500 μl. Quitar exceso de líquido con una pipeta Pasteur tirado, dejando sobre 150-200 μL en el tubo. Repita la sección 4.1 para genotipos restantes.
  2. Preparar para el balanceo
    1. Humedezca previamente un plato bien profunda con 200 μL de tapa de PBSBTx. y reservar. Obtener 3 portaobjetos esmerilado y set slide #3 a un lado. Frote suavemente las regiones escarchada de diapositivas #1 y #2 juntos. Enjuáguelos en agua desionizada para eliminar cualquier fragmentos de vidrio y secar con una toallita desechable.
    2. Capa de las regiones heladas de diapositivas #1 y #2 con PBSBTx por añadiendo 50 μl de PBSBTx a una diapositiva y frotar esta región con la otra diapositiva. Eliminar el líquido con una toallita desechable.
    3. Coloque los portaobjetos en un microscopio de disección en la configuración que se muestra en la Figura 4A. Manten las regiones heladas de diapositivas #1 y #2 en contacto, con la diapositiva #3 apoyo diapositiva #2.
  3. Rollo de ovocitos; Asegúrese de que la dirección del balanceo esté siempre en línea recta y nunca en un movimiento circular.
    1. Prewet una P200 pipeta tip en PBSBTx y dispersar los ovocitos en el tubo de microcentrífuga mediante pipeteo arriba y abajo. Transferir 50 μl del líquido que contiene ovocitos en el centro de la parte de vidrio esmerilado de la diapositiva #1. Levante la diapositiva #2 para hacer esto.
    2. Baje lentamente la diapositiva #2 hasta que la tensión superficial del líquido crea un sello entre las dos regiones de vidrio esmerilado. Debe haber suficiente líquido para cubrir el área helado pero ninguno debe estar filtrando. Si el líquido se está desbordando, utilice una pipeta de Pasteur tirada para quitar exceso de líquido.
    3. Sujete la corredera inferior (#1) con una mano y use la otra mano mover la diapositiva superior (#2) ida y vuelta en una dirección horizontal, manteniendo nivel diapositiva #2 y apoyados en la diapositiva #3. Realizar bajo un microscopio para la visualización fácil de los movimientos del ovocito y el progreso.
      Nota: Este movimiento generan fricción y hace que los ovocitos para "rodar" y pierden sus chorions. Se recomienda una mínima presión y movimientos deben ser corto y rápido.
    4. Después de algunos movimientos en dirección horizontal, cambiar ligeramente el ángulo de movimiento (Figura 4B). En múltiples incrementos, gradualmente aumentar este ángulo a 90° hasta que el movimiento de la diapositiva superior (#2) es perpendicular a la dirección inicial (Figura 4B). Nota que desembocan chorions será visible en el líquido y ovocitos que carece chorions aparecerán más largo y más delgado.
    5. Repita los pasos 4.3.3 - 4.3.4 cerca de 7 - 10 veces hasta que la solución se hace ligeramente nublada. Parar cuando la mayoría de los ovocitos (75-85%) parece haber perdido su membrana vitelina.
      Nota: Un extremo acentuado distintivo es a menudo visible en ovocitos que carecen las membranas vitelinas. Las membranas vitelinas son más difíciles de extraer que chorions. Ligera presión puede aplicarse a la diapositiva superior (diapositiva #2) mientras que ruedan para lograr la eliminación de las membranas vitelinas. Tratar de eliminar las membranas vitelinas de todos los ovocitos a menudo resulta en la destrucción de otros óvulos.
    6. Levante suavemente la diapositiva superior (#2), arrastrando una de sus esquinas en el centro de la región helada de la diapositiva de fondo (#1) que rodó ovocitos se acumulan en el centro de la región helada. Enjuague los ovocitos de ambas correderas con PBSBTx en el plato bien profunda que contiene PBSBTx.
    7. Limpiar diapositivas #1 y #2 con agua ultrapura, secar con una toallita desechable y reiniciar. Repita los pasos 4.3.1 - 4.3.6 hasta que han sido laminados en todos los ovocitos del mismo genotipo. Esto generalmente requiere 3-4 rondas de balanceo por genotipo.
  4. Eliminar la suciedad después de rodar
    1. Añadir 1 mL de PBSBTx a un tubo cónico de 15 mL. Agite el líquido para cubrir los lados del tubo.
    2. Utilizando un PBSBTx recubierto P1000 pipeta, transferencia los ovocitos rodados desde el plato bien en el tubo cónico que contiene 1 mL de PBSBTx. Añadir 2 mL adicional de PBSBTx en el tubo cónico que contiene los ovocitos.
    3. Deje que los ovocitos comienzan a instalarse en la parte inferior, luego quite la tapa de 2 mL de solución contiene basura (chorions, vitellines, etc.) con una P1000 y deseche. Si es necesario, sujete el tubo cónico sobre un fondo oscuro ver los ovocitos opacos como se hunden.
    4. Añadir un adicional 2 mL de PBSBTx a los ovocitos y repita el paso 4.4.3. 4.4.3 repetición. para un total de 3 rondas de eliminación de desechos.
    5. Utilizando un PBSBTx había recubierto P1000 pipeta, ovocitos transferencia hacia el tubo de microcentrífuga original de 500 μl. 20 - las hembras 25 deben generar aproximadamente 50 μl de laminado en ovocitos maduros.
  5. Repita la sección 4 para los genotipos restantes usando diapositivas helados frescos, un plato bien limpia profunda y un nuevo tubo cónico para cada genotipo.
  6. Si el almacenamiento es necesario, transferencia de ovocitos a PBS 1 x con el 0,1% TritionX-100 y tienda durante la noche a 4 ° C. Almacenamiento a largo plazo no se recomienda porque reticulación de formaldehído puede invertirse por detergentes no iónicos.

5. PESCADO

Nota: Todos los lavados se realizan en un nutator a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Ovocitos que han sido laminados tardan más tiempo en instalarse en la parte inferior del tubo de microcentrífuga, especialmente en soluciones que contienen formamida. Es importante ser paciente al cambiar las soluciones para que los óvulos no se pierden en el proceso. Esto puede requerir 5-15 min en espera dejar ovocitos asentarse después de los enjuagues y lavados. También nota que los ovocitos en formamida son menos opacos.

  1. Tratamiento extracción y Rnasa
    1. Enjuague los ovocitos con 500 μl de PBS con 1% Tritón X-100 (PBSTx). Extraer el líquido y agregar 500 μl tampón de extracción (PBSTx que contienen ARNasas). Incubar en nutator a temperatura ambiente durante 2 h.
  2. Lavados de la hibridación
    1. Enjuague los ovocitos 3 veces con 500 μl de 2 x solución salina citrato de sodio, que contiene Tween 20 (SSCT). Precalentar una alícuota (~ 500 μl/genotipo) de 2 x SSCT + 50% formamida a 37 ° C.
      PRECAUCIÓN: formamida es tóxico, usar protección adecuada.
    2. Lavado de ovocitos durante 10 minutos 3 veces en 500 μl de 2 x SSCT. Lave ovocitos durante 10 minutos en 500 μl de 2 x SSCT + 20% formamida. Lave ovocitos durante 10 minutos en 500 μl de 2 x 40% formamida SSCT. Lave ovocitos durante 10 minutos en 500 μl de 2 x SSCT + 50% formamida.
    3. Eliminar el líquido y agregar 500 μl de 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamida de paso 5.2.1 muestra e incubar por 2 h a 37 ° C con rotación.
      Nota: Un horno de hibridación, equipado con un agitador funciona bien para esto. Un tubo de microcentrífuga de espuma "flotar" atado rotor se puede utilizar para asegurar los tubos.
  3. Desnaturalización e hibridación
    1. Para cada tubo de ovocitos, use 40 μl de tampón de hibridación de x 1 que contiene la sonda centromérica de 2,5 ng/μl y fluor de 0.31 pmol/μl de cada sonda de BAC. Preparar una solución de sonda en tampón de hibridación suficiente para todos los genotipos. Vórtice sonda mix 30 s antes de agregar.
    2. Utilizando una pipeta de P200 revestido de BSA, transfiera los ovocitos a un tubo PCR de 200 μl. Mantener las muestras a 37 ° C y ovocitos que coloque en la parte inferior, luego use una pipeta de Pasteur tirada para quitar tanto líquido como sea posible.
    3. Agregar 40 μl de solución de hibridación con sonda (preparado en la sección 2) a los ovocitos. Coloque el tubo PCR que contiene ovocitos en la máquina PCR e incubar como se indica a continuación: 37 ° C por 5 min, 92 ° C por 3 min, luego 37 ° C durante la noche. Después de punta de prueba se agrega a los ovocitos, manténgalos en la oscuridad tanto como sea posible.
  4. Lavados de la hibridación
    1. Precaliente 2 x SSCT + 50% formamida a 37 ° C y mantenerlo en la incubadora de hibridación. Con un BSA revestido P200 punta de pipeta, añada 100 μl de 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamida al tubo de PCR con los ovocitos y transfiera los ovocitos a un tubo de microcentrífuga nuevo 500 μl.
    2. Agregar un adicional de 400 μL de 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamida al mismo tubo y deje que los ovocitos se colocan a 37 ° C en la incubadora.
      Nota: Colocar a menudo toma más tiempo en este paso. No es raro tomar 15 minutos o más. La falta de paciencia resultará en una pérdida significativa de óvulos.
    3. Lave los ovocitos 3 veces de 20 minutos cada uno en 500 μl de 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamida a 37 ° C con rotación. Mantener ovocitos a 37 ° C mientras se instalan.
    4. Lave los ovocitos durante 10 minutos 3 veces en 500 μl de 37 ° C 2 x SSCT + 50% formamida a 37 ° C con rotación. Mantener ovocitos a 37 ° C mientras se instalan.
    5. A temperatura ambiente, lavar los ovocitos durante 10 minutos en 500 μl de 2 x 40% formamida en un nutator SSCT. Lave los ovocitos durante 10 minutos en 500 μl de 2 x SSCT + 20% formamida. Lave los ovocitos durante 10 minutos en 500 μl de 2 x SSCT.
  5. Tinción con DAPI
    PRECAUCIÓN: DAPI es tóxico, usar protección adecuada.
    1. Lavado de ovocitos por 20 min en la solución DAPI 500 μl (1 μg/ml) en 2 x SSCT en el nutator. Enjuague los ovocitos 3 veces en 500 μl de 2 x SSCT. Lavado de ovocitos 2 veces de 10 minutos cada uno en 500 μl de 2 x SSCT en el nutator. Muestras pueden conservarse durante un máximo de 4 h a temperatura ambiente en la oscuridad hasta que están listos para montar en cubreobjetos.
  6. Montaje
    Nota: Consulte la figura 3 para las herramientas necesarias.
    1. Coloque un cubreobjetos recubierto de poli-l-lisina con el microscopio de disección. Eliminar el líquido del tubo de ovocitos, ajuste el volumen total a cerca de 150 μL. Con un BSA revestido P200 pipeta, pipeta hacia arriba y hacia abajo para dispersar ovocitos a través de la solución y luego transferir 40 μl de la solución de ovocitos a un cubreobjetos recubierto de poli-l-lisina.
    2. Parte del líquido retire lo cubreobjetos usando una pipeta Pasteur tirada hasta que los ovocitos se adhieren al cubreobjetos pero aún están rodeados de líquido. Con pinzas, mantener pulsado el cubreobjetos en un lado y usar una aguja de tungsteno suavemente disociar grupos de ovocitos, moviéndolos para lograr una sola capa de ovocitos no superpuestos.
    3. Quitar el resto del líquido alrededor de los ovocitos con una pipeta Pasteur tirado. Tomar un portaobjetos de vidrio limpio y para soplar cualquier polvo gas comprimido. Añadir 22 μL de montaje de los medios de comunicación (por ejemplo, prolongar-oro) en el centro de la diapositiva. Baje lentamente el portaobjetos hacia el cubreobjetos, con los medios de montaje hacia la muestra, hasta que los medios de comunicación toca la muestra. Tensión superficial hará que el cubreobjetos a la diapositiva.
    4. Coloque los portaobjetos en un recipiente de plástico con tapa bien ajustada que contiene una capa de desecante fresco (p. ej., drierite). Deje portaobjetos secar durante 3-5 días en la oscuridad antes de la proyección de imagen. Tiempo de secado puede variar dependiendo de la humedad de la habitación.

6. proyección de imagen de

  1. Al extraer diapositivas seco de la caja de dessicant, limpiarlos para eliminar cualquier partícula de polvo. Sello del cubreobjetos con esmalte de uñas. Diapositivas de sellado pueden ser almacenadas indefinidamente a-20 ° C.
  2. Adquirir el láser de barrido confocales imágenes con un objetivo de aceite de alta apertura numérica 40 X 6 X zoom digital.
    Nota: Idealmente, software del sistema permitirá encontrar y marcar la ubicación de X-Y de cromosomas meióticas de ovocitos múltiples mientras les con epifluorescencia. Esta capacidad ahorra tiempo durante una sesión de imágenes. Rápida de blanqueo con un objetivo de apertura numérica alta 60 X hizo su uso inadecuado con el sistema confocal elegido, pero puede funcionar para otros sistemas.
  3. Capturar una serie de Z para cada ovocito, ajuste la parte superior e inferior de la serie con la señal DAPI.
    Nota: Ganancia, offset, y energía del laser va a necesitar determinarse empíricamente utilizando un subconjunto de los ovocitos. Una vez que se encuentran los parámetros adecuados, sólo ajustes menores debería ser hecho.
    Si altera la adquisición ajustes son necesarios, utilice la pila de imagen previamente recogidos para estimar los cambios necesarios. Para evitar el blanqueo, se abstengan de la proyección de imagen la sonda del brazo antes de capturar la serie Z. Con un tamaño de paso de 0.25 μm, serie Z generalmente van de 25 a 30 pasos dependiendo de la orientación y la colocación de los cromosomas. Un tamaño de paso más pequeño puede mejorar la capacidad de evaluar si dos manchas de peces se separan en la dimensión axial, pero hay una relación inversa con el tiempo necesario para capturar pequeños pasos y pérdida de intensidad de la señal debido a la decoloración. Un objetivo de X 40 con 6 X de zoom digital y un campo de imagen 1.024 x 512 genera imágenes con un tamaño de pixel de 0.05 μm.

7. imagen análisis y puntuación para los defectos de la cohesión

  1. Deconvolve la serie Z para optimizar la relación señal a ruido para cada ovocito19.
    Nota: Un paquete de software como especificado en la Tabla de materiales permite a deconvolve uso de restauración integral, así como de los cultivos y mejorar contraste de imágenes. Lo importante, es imprescindible un paquete de software que permite ver imágenes y puntuación para los defectos de la cohesión en tres dimensiones.
  2. Para cada ovocito, tabular el número de brazo y focos centroméricas que colocalize con la señal DAPI. Pérdida de cohesión resulta en tres o cuatro señales distintas y separadas para una sonda específica. No es infrecuente observar dos focos que están conectados por un hilo delgado. Por los criterios más exigentes, estos focos no se considerarían "separado".

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Resultados

Figura 5 presenta las imágenes obtenidas con una sonda de brazo que cruza por hibridación a citológico región 6E-7B en el cromosoma X . Este resultado de la sonda en una señal que se localiza junto con la de DAPI, es fácilmente distinguible del fondo y se ha utilizado con éxito para cuantificar defectos de cohesión brazo en diferentes genotipos19. Cuantificación de los defectos de cohesión se restringió a Prometafas...

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Discusión

El uso de peces las puntas de prueba para evaluar el estado de la cohesión de brazo en Prometafase y metafase I Drosophila ovocitos es un avance importante en el campo de la Drosophila meiosis. Históricamente, los investigadores de Drosophila se han limitado a pruebas genéticas para deducir la pérdida prematura de la cohesión de brazo en ovocitos maduros11,18,19. Ahora, con los métodos presentado...

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Divulgaciones

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por los NIH Grant GM59354 a Sharon E. Bickel. Agradecemos Huy Nguyen p. asistencia en el desarrollo del protocolo para la generación de sondas fluorescentes brazo, Ann Lavanway ayuda con microscopía confocal y J. Emiliano Reed para asistencia técnica. También agradecemos a numerosos colegas de la comunidad de Drosophila para discusiones útiles y consejos.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
Midi Prep kitQiagen12143Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) KitSigmaWGA2Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kitInvitrogenA21676Label BAC clone DNA
PCR purification kitQiagen28104Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chlorideFisher ScientificC75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfateSigmaD-8906
DrieriteDrierite Company23001
Dithiothreitol (DTT)Invitrogen15508-013Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl)Boehringer Mannheim1277049Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)Fisher ScientificS311-500Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof)Decon Laboratories2716
Tris (Ultra Pure)Invitrogen15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)SigmaE-3889
16% formaldehydeTed Pella, Inc.18505Toxic: wear appropriate protection
FormamideInvitrogenAM9342Toxic: wear appropriate protection
GlucoseFisher ScientificD16-1
GlycogenRoche901393
HEPESBoehringer Mannheim737-151
HeptaneFisher ScientificH350-4Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acidMilliporeHX0603-4Toxic: wear appropriate protection.
HydroxylamineSigma438227Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chlorideSigma104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2OFisher ScientificS373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2OFisher ScientificS369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml)SigmaP8920-100
Potassium acetateFisher ScientificBP364-500
Sodium acetateFisher ScientificS209-500Prepare 3M stock
Sodium cacodylatePolysciences, Inc.1131Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrateFisher ScientificBP327-1
Sodium chlorideFisher ScientificS271-3Sodium chloride
SucroseFisher ScientificS5-500
10% Tween 20Thermo Scientific28320Surfact-Amps
10% Triton X-100Thermo Scientific28314Surfact-Amps
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate)3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solutionToxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solutionToxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase)1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
NameCompanyCatalog NumberComments
Enzymes
AluINew England BiolabsR0137S
HaeIIINew England BiolabsR0108S
MseINew England BiolabsR0525S
MspINew England BiolabsR0106S
RsaINew England BiolabsR0167S
BfuCINew England BiolabsR0636S
100X BSANew England BiolabsComes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2New England BiolabsRestriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µlRoche/Sigma3333566001
TdT bufferRoche/SigmaComes with TdT enzyme
Cobalt chlorideRoche/SigmaToxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL)Thermo-ScientificEN0531
NameCompanyCatalog NumberComments
Cytology Tools etc.
ForcepsDumont#5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettesFisher13-678-20CAutoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dishCustom made
Deep well dish (3 wells)Pyrex7223-34
Fisherfinest Premium microscope slidesFisher Scientific22-038-104Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mmVWR Scientific48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thickThermo-Scientific3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5Thermo-Scientific3405
Tungsten needlehomemade
Prolong GOLD mounting mediaMolecular ProbesP36930
Compressed-air in canVarious
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR machineVarious
Nanodrop 2000, spectrophotometerThermo-Scientificmicrovolume spectrophotometer
VortexerVarious
Table top microfuge at room temperatureVarious
Table top microfuge at 4 °CVarious
Heat blockVarious
Hybridization oven or incubator with rotatorVarious
NutatorVarious
A1RSi laser scanning confoalNikon40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables etc.
50 mL conical tubesVarious
15 mL conical tubesVarious
1.5 mL microfuge tubesVarious
500 µl microfuge tubesVarious
200 µl PCR tubesVarious
Plastic container with tight fitting lidVariousTo hold Drierite
KimwipesVariousdisposable wipes
ParafilmVariousparaffin film
NameCompanyCatalog NumberComments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesCy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis SoftwarePerkinElmerVersion 6.3

Referencias

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