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要約

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase とを逮捕した中期ショウジョウバエ卵。このプロトコルは、減数分裂の腕の結合はそのままか、異なった遺伝子型の崩壊かどうかを決定するのに適しています。

要約

ヒトでは、卵母細胞における染色体分離エラーが流産や先天性欠損症の大半を担当です。さらに、女性の年齢、妊娠 aneuploid 胎児が大幅に増加、このような現象のリスクは母体年齢効果と呼ばれます。減数分裂の分裂時の正確な染色体分離の要件の 1 つは妹のメンテナンス卵母細胞が発生する拡張前期期間中に染色分け体結束。人間のモデル生物細胞学的証拠では、老化の過程減数分裂凝集度を劣化させることを示唆しています。人間の卵子に偏析エラーは減数分裂の間に最も普及している、さらに、私は、腕の結束の早期喪失と一貫性のあります。モデル有機体の使用は、凝集度の年齢依存性損失の根底にあるメカニズムの解明にとって重要です。キイロショウジョウバエでは、卵母細胞の減数分裂の凝集の制御を勉強するためのいくつかの利点を提供しています。しかし、最近まで、遺伝テストのみでした腕結束異なった遺伝子型の異なる実験条件下で卵母細胞の損失の分析に利用できます。ここでは、詳細なプロトコルで、私は、ショウジョウバエの卵母細胞を逮捕された中期の腕 prometaphase の結束の交配 (魚) を直接可視化する蛍光その場で使用するため欠陥を提供。X染色体の遠位腕に交配魚プローブを生成および共焦点 Z スタックを収集、研究者が 3 つの次元での個々 の魚信号数を視覚化して姉妹かどうかを決定する染色分け体腕区切られました。手順では、ショウジョウバエの卵母細胞の何百もの arm 結束欠陥を定量化可能です。そのため、このメソッドは、結束のメンテナンスだけでなく、老化プロセスの間に死につながる要因に寄与するメカニズムを調査するため重要なツールを提供します。

概要

有糸分裂と減数分裂時の染色体の分離が適切な必要とその姉妹染色分け体の凝集性の確立、維持、・連携1,2のリリースします。凝集度は S 期の間に確立され、姉妹を保持する物理の連携を形成するコヒーシン複雑、により媒介される染色分け体一緒に。減数分裂、クロス オーバーの遠位結束も組換え同族体を一緒に保持する機能し、この物理的な関連付けにより、適切な方向 (図 1)3,4、減数分裂に 2価の紡錘 5。リリース アームの後期で結束対極スピンドルに分離する同族体が可能します。ただし、腕結束がある場合途中で失われた組換え同族体の物理的な接続を失う、異数性配偶子 (図 1) につながることができます、ランダムに分離します。

人間の卵子の染色体分配のエラー6、ダウン症候群などの先天異常と流産の原因、その発生率は、母体年齢7とともに指数関数的に増加します。胎児卵母細胞で姉妹染色分け体の凝集が確立され、出生前に減数分裂組み換えが完了しました。卵母細胞、中期前期私排卵までと逮捕この逮捕中に、組換え同族体の継続的な物理的な連合の依存姉妹染色分け体結束。したがって、減数分裂と正常妊娠の転帰の間に正確な分離は、最大 5 年間の凝集力がそのまま残ること必要があります。

人間の卵子の減数分裂長期逮捕時に結束の早期喪失は母親年齢の効果に貢献する提案されているし、証拠の複数のラインは、この仮説8,9をサポートします。ただし、ヒトの卵母細胞の減数分裂の結束を研究の課題を考えると、この現象の私達の理解の多くは、モデル生物5,10、11,12,の使うことで13,14,15。

ショウジョウバエの卵母細胞は減数分裂の結束と染色体の偏析の研究のための多数の利点を提供しています。単純な遺伝的アッセイ異数性配偶子から子孫を回復し、 Xの忠実度を測定することができます-大規模な11,16,17染色体分離。さらに、1 つも減数分裂期組換え同族体 missegregate アーム結束11,18,の早期喪失と一貫性のある表現型、私ために染色体分離エラーが発生するかどうかを決定可能性があります19. 直接ショウジョウバエの卵母細胞の減数分裂の結束の状態の観察が可能な蛍光現場の交配 (魚) を使用しても。反復的な衛星シーケンスに交配する蛍光のオリゴヌクレオチドが使用されているため 10 年以上 pericentromeric 結束の成熟したショウジョウバエ卵4、20アームの分析を監視するには凝集度は、はるかに困難されています。腕の結束の状態の可視化には、シングル コピーの大規模な地域にわたるプローブ シーケンスし、アーム結合が存在しないときに個々 の妹のため目に見えるシグナル染色分け体が発生するには十分に明るいですが必要です。さらに、卵母細胞固定条件と分類された Dna のサイズは大きな成熟したショウジョウバエ卵母細胞 (200 μ m 幅 500 μ m 長で) に浸透21を促進する必要があります。最近、腕プローブが正常に利用いる prometaphase で信号の検出できませんでした述べたけど、著者、後期中ショウジョウバエ卵母細胞染色分け体を可視化するまたは中期卵22を逮捕しました。ここでは、 Xの生成のための詳しいプロトコルを提供-私と中期染色分け体結束 prometaphase の妹の早期喪失の試金する私たちを許可している卵母細胞調製条件と魚プローブ染色体腕私卵。減数分裂の結束の維持に必要な遺伝子の製品を識別するために私たちを有効に、これらのテクニックになります他の姉妹のために試金する染色分け体結束異なった遺伝子型の成熟のショウジョウバエ卵の欠陥します。

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プロトコル

1. 準備

  1. 蛍光の in situの交配 (魚) のためのソリューションを準備します。超純水を使用してすべてのソリューションを準備します。
    1. 5 x 変更ロブのバッファーを準備: 275 mM 酢酸カリウム、酢酸ナトリウム 200 mM、500 mM ショ糖、50 mM グルコース、6 mM 塩化マグネシウム、塩化カルシウム 5 mM、500 mM HEPES pH 7.4 を =。7.4 10 N NaOH を使用して pH をもたらします。フィルター滅菌し、-20 ° C で保存解凍し必要に応じて 1 倍に希釈し、-20 ° C で 1 x 因数を格納
    2. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1.3 M の NaCl、70 mM Na2HPO430 mM NaH2PO4x 10 を準備します。10 N NaOH を使用して 7.0 に pH をもたらします。オートクレーブまたはフィルターの殺菌によって殺菌しなさい。
  2. ポリ-L-リジン coverslips に一日を準備する前に必要な。
    1. ピペットの 18 mm × 18 mm #1.5 カバーガラスの表面に 1% 塩酸を含む 70% エタノールや 5 分液体を削除する使用して真空吸引を孵化させなさい。滅菌超純水を繰り返します。0.1 mg/mL ポリ-L-リジンのカバーガラスの表面をカバーし、10 分間インキュベートします。
    2. 液体を除去し、空気乾燥で 10 分間ほこりを避けるためにタイトなフィッティングふた付きプラスチック容器にアップ ストア coverslips ポリ L リジン側吸引します。
  3. 引っ張られたパスツール ピペット卵母細胞を削除せず液体のソリューションを削除するを準備します。ブンゼン バーナーの炎でガラスを溶かすし、離れて引っ張るまで優しく両端を引っぱりながら長いガラス パスツール ピペットの中間を熱します。

2. 魚の腕プローブの生成

注: すべての遠心分離機手順は 16,000 〜 21,000 x g (ほとんどのテーブルの上の microcentrifuges の最高速度) で実行されます。簡単なの遠心分離機スピン回転を示すは、5-15 s. 渦を示します ~ 15 のボルテックスの max で s 特記を高速化します。

注意: アームのプローブの BACs は BAC PAC リソースから入手できます。2 つのX染色体ユークロマチン腕プローブは、この方法で正常に使用されています。1 つのアームのプローブで構成されていた六つの BAC クローンの細胞に対応する 6E 7B (BACR17C09、BACR06J12、BACR35J16、BACR20K01、BACR35A18、BACR26L11) のバンドします。他のアームのプローブを細胞学的バンド 2 階-3 C (BACR13K19、BACR21G11、BACR09H13、BACR30B01、BACR34O03、BACR03D13) に対応する六つの BAC クローン成っていた。BACs 他ショウジョウバエの染色体領域可能性があります参照する: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html。X染色体の 359 bp 衛星繰り返しを認識する 2 つの番プローブは、この方法で正常に使用されています。22 ヌクレオチド プローブは、広く使用されていて、(5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23をうまきます。28 ヌクレオチド プローブ テストは最近、(5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24もうまくいった。高速液体クロマトグラフィー精製オリゴヌクレオチド 5' 特定の蛍光ラベルの付いた市販のソース (例えばDNA の統合の技術) から命じられました。

  1. BAC クローン DNA材料のテーブルで指定されているキットの手順を準備します。100 mL 200 μ L TE; 文化から得られる DNA の餌を再停止しなさいBAC クローンによって 5-40 ng/μ L の間最終的な DNA 濃度の範囲。
  2. 材料の表および次のプロトコルで指定された増幅キットを使用して各 BAC DNA 増幅を実行します。各クローンの BAC DNA を個別に処理します。酵素と 2.2.1 2.2.3 からの手順でキットに付属しているバッファーを使用します。
    1. BAC DNA の断片化をランダム: 各 BAC の TE を使用して 200 μ L の PCR チューブに 1 ng/μ L の DNA 溶液の 10 μ L を準備します。10 X 断片化バッファーの 1 μ L を追加します。チューブ PCR マシンで丁度 4 分 95 ° C ですぐにクールな氷の水のサンプルを置き、遠心分離機の簡潔に。インキュベーション時間に敏感であり任意の偏差は、結果を変更可能性があります。
    2. ライブラリの準備
      注: このメソッドは、増幅断片のライブラリを生成するのにランダムなプライマーを使用します。
      1. 管に次の追加 DNA を含む: 1 x ライブラリの準備バッファー、ライブラリ安定化溶液 1 μ L の 2 μ L。ボルテックス、簡潔に、遠心分離機、チューブを置き、PCR マシンで 95 ° c で 2 分間すぐにクールな氷の水のサンプル、遠心分離機の簡潔に。
      2. 簡単に PCR チューブ、ミックス、遠心分離機に図書館準備酵素の 1 μ L を追加します。場所 PCR チューブは PCR マシン、および次のように孵化させなさい: 16 ° C、20 分、20 分、20 分、5 分の 75 ° C の 37 ° C のための 24 の ° C、4 ° C で押し
      3. PCR マシンからサンプルを削除し、遠心分離機の簡潔に。サンプルをすぐに増幅または 3 日間-20 ° C で保存されている可能性があります。
    3. BAC DNA ライブラリの増幅
      1. 次の試薬を加える全体の 15 μ L ランダム フラグメント反応: 増幅マスター ミックス、47.5 μ x 7.5 μ 10 ヌクレアーゼ フリー水、5 μ L WGA DNA ポリメラーゼ。ボルテックスし、遠心分離機の簡潔に。
      2. 場所 PCR チューブは PCR マシン、および次のように孵化させなさい: 初期変性 95 ° C 3 分、14 サイクルの変性 94 ° C で 15 秒、5 分の 65 ° C で熱処理/拡張子が続くが、4 ° C で押し
      3. サイクリングの完了後 DNA の集中の試金します。DNA 濃度は、少なくとも 800 べき ng/μ L。 維持サンプル 4 ° c または-20 ° C まででストアが消化の準備。必要に応じて、400 を実行することによって DNA のフラグメント サイズを評価 2% の agarose のゲルの DNA の ng。フラグメントの範囲に 200 から bp 3 kb (図 2)。
  3. 増幅された DNA の制限の酵素の消化力
    1. 1.5 mL および microfuge の管で前のセクションからの増幅された DNA の場所 20 μ g。アルール、Haelll、Msel、Mspl、Rsal、BfuCl、0.5 μ L 100 x BSA、制限酵素消化バッファー x 5 μ 10 の 25 単位 20 単位を追加し、超純水 H2o. の適切な量を追加することによって 50 μ L にボリュームを調整
    2. 一晩で蓋の上の結露を防ぐためにインキュベータ 37 ° C ダイジェストを孵化させなさい。エタノールは、消化の DNA を沈殿させます。ダイジェストに追加: 1 μ L グリコーゲン、1/10 ボリューム 3 M 酢酸ナトリウム 2.5 ボリューム 100% 分子グレード エタノール。-80 ° C 1 時間または一晩で孵化させなさい。
    3. 4 ° C で 30 分間遠心1 ルーム一時 70% エタノール、4 ° C で 5 分間スピン量で洗う DNA の餌上澄みを除去し、ペレット乾燥空気または空気の着実なストリームを優しく乾燥 DNA をしましょう。
    4. 36 μ L 滅菌超純水 H2O で DNA ペレットを再懸濁します、1 μ L の DNA を使用して試金 DNA 濃度は、約 285 すべき ng/μ L-20 ° C で DNA の店舗
    5. 400 実行している DNA のフラグメントのサイズを必要に応じて評価 2% の agarose のゲルの DNA の ng。ほとんどのフラグメントの範囲に 500 まで薄く信号の 100-200 bp から bp (図 2)。
  4. 3 ' 反応を尾行
    1. 熱ブロックで 1 分間 100 ° C で消化の DNA を変化させなさい。すぐに氷水で冷やします。DNA の 35 μ L に以下を追加します: 50 μ L 400 mM ナトリウム cacodylate、1 μ L 10 mM DTT、渦も。4 μ L 25 mM CoCl2、dUTP ラベリング キット 5 x TdT バッファー、および 1 μ L ターミナルトランスフェラーゼ (TdT) 400 U 18 μ L、5 μ L 1 mM dTTP 材料のテーブルで指定されたアレスから - 2.5 μ L 2 mM 5-(3-aminoallyl) を追加/μ L。 渦と遠心分離機を簡潔に。
      注意: CoCl2は有毒である、適切な保護具を着用します。
    2. 結露を防止するインキュベーターで 37 ° C で 2 時間インキュベートします。250 mM 反応と簡単にミックスする渦を停止する EDTA の 1 μ L を追加します。エタノールは、(手順 2.3.2 - 2.3.4) 上記のように尾の DNA を沈殿させます。再懸濁します 10 μ L 滅菌超純水 H2o. ストアで乾燥 DNA の餌 DNA-20 ° C で続行する準備ができるまで。
  5. 材料表で指定されている DNA ラベリング キットを使用して蛍光色素活用を行ってください。
    注: 染料を追加するは、暗闇の中でサンプルを保持します。
    1. 熱ブロックで 5 分 95 ° C で尾の DNA を変化させなさい。すぐに氷の水と遠心力で簡単に DNA をクールします。キットの指示に従ってラベル バッファーを準備し、6 μ L を各 DNA のサンプルに追加します。キットから DMSO の 4 μ L で染料の各チューブを再懸濁します。渦と遠心分離機を簡潔に。
    2. 各標識反応染料の 1 つの管を使用します。簡単に DNA、渦、および遠心分離機に色素溶液を追加します。暗闇の中 2 時間室温でラベリングの反応を孵化させなさい。ヌクレアーゼ フリーの 77 μ L に続いて反応を停止する 3 M のヒドロキシルアミンの 3 μ L を追加 H2O キットから。渦と遠心分離機を簡潔に。
  6. 非共役系色素材料の表の指定に従って PCR 精製キットを使用してを削除します。製造元の指示に従ってください。2 回するたびに 40 μ L の溶出バッファーを使用して、列から DNA を溶出します。
  7. エタノールは、(手順 2.3.2 - 2.3.4) 前述標識 DNA を沈殿させます。10 μ L の溶出バッファーで乾燥 DNA ペレットを再懸濁します。
  8. プローブの混合物を準備します。
    1. ラベル付けされた DNA pmol/μ L で螢光色素の濃度を決定します。Fluorophore 濃度 30 100 pmol/μ L、BAC によって範囲があります。DNA 濃度は 300-800 ng/μ L の範囲があります。
      注: マイクロ アレイ設定は材料の表に指定されているなど、微量分光光度計でうまく機能します。マイクロ アレイの] ウィンドウで DNA-50 を選択し、螢光色素を指定します。
    2. 各 BAC プローブの等モル量 (pmol 蛍光) を組み合わせることによりマスター ミックスを作成します。結合する前に渦 30 s。凍結/解凍サイクルを避けるためには、マスター ミックスの因数を準備、蒸発を防止し、-20 ° C で暗闇の中を格納するチューブにパラフィン フィルムを適用
      注: 各 6 個々 BAC の 250 pmol を含むマスター ミックスは 30-50 μ L 作品の容量でもプローブします。各 BAC の 25 pmol (蛍光) を含む、因数 2 40 μ L の交配反応、0.31 pmol 蛍光/μ l 各 BAC の最終的なプローブの濃度で十分であります。

3. 郭清と卵母細胞の固定

  1. 適切な遺伝子型の 30 のアダルト処女女性を収集します。後期段階卵子の豊かにするには、郭清25まで 3-5 日はえの食糧と乾燥酵母を瓶でなく男性女性を保持します。郭清、前日はガスなし女性を酵母と新鮮なバイアルに転送します。
  2. 郭清を実行します。
    注: 必要なツールの図 3を参照してください。ソリューションは、特に断らない限り、引っ張られたパスツール ピペットを使用して削除されます。卵巣を常に転送する場合は、10 %bsa 溶液でコーティングされたピペット チップを使用します。
    1. 浅い解剖皿に変更ロブのバッファーを含む、単一の女性から卵巣を削除するのに鉗子を使用します。使用鉗子またはタングステン針内部卵巣小管に連絡するソリューションをできるように、それぞれの卵巣を軽くスプレーします。1 mL 変更ロブのバッファーを含む 1.5 mL microfuge の管にスプレイ卵巣のペアを転送します。
    2. 3.2.1 1.5 mL および microfuge の管で 20-25 女性から卵巣を蓄積するためのステップを繰り返します。10 分以内 20-25 女性の解剖を終了します。
  3. 固定をとおり実行します。
    1. 引っ張られたパスツール ピペットおよび microfuge の管に液体を削除、P1000 を使用する卵巣を 500 μ L の 37 ° C の解決策をすばやく追加し、すぐに卵巣に室温ヘプタンの 500 μ L を追加します。
    2. ミックス、3 分 nutator に振るおよび microfuge チューブは、底に沈殿する nutator と卵母細胞を許可する 1 分管ラックの場所からおよび microfuge の管を削除します。合計固定時間は 4 分です。
      注意:解決策とヘプタン有毒である、適切な保護具を着用します。
    3. 解決策を削除し、卵巣リンス 500 μ L の PBS 0.5 %bsa および 0.1% を含む 3 回トリトン X-100 (PBSBTx)
  4. 残りの遺伝子型を繰り返します。

4. 絨毛と卵黄膜の除去

注: 必要なツールの図 3を参照してください。

  1. 別の後期段階卵子
    1. 浅い解剖皿に 1 mL PBSBTx を追加します。BSA コーティング チップで P200 を使用して (~ 150 μ L) で固定の卵巣を浅い皿に転送。卵巣を上下に未成熟卵母細胞から成熟した卵母細胞を除去する BSA コーティング ピペット チップ ピペットします。
    2. 後半ステージ卵子が十分に分離されている場合は、すべての組織を 500 μ L および microfuge の管に転送します。について残してプル パスツール ピペットで余分な液体を削除する管に 150-200 μ L。残りの遺伝子型のセクション 4.1 を繰り返します。
  2. ロールバックの準備します。
    1. 中古ウェット PBSBTx カバーの 200 μ L で深いよく料理しておきます。3 の曇らされたガラス スライドとセット スライド #3 脇を取得します。一緒にスライド #1 と 2 の曇らされたガラス領域をこすり。任意のガラスの破片を取り除き、使い捨てワイプで乾燥脱イオン水でそれらをすすいでください。
    2. 1 つのスライドに PBSBTx の 50 μ L を追加し、他のスライドでこの地域をこすりスライド #1 と PBSBTx #2 の霜で覆われた地域をコートします。使い捨て可能なワイプで液体を除去します。
    3. 図 4 aに示すように構成に解剖顕微鏡の下でスライドを配置します。#3 のスライドとスライド #1 と接触、#2 の霜で覆われた領域はスライド #2 をサポートし続けます。
  3. ロールの卵;圧延の方向は直線、決して円を描くように常にことを確認します。
    1. Prewet P200 ピペットは PBSBTx のヒントし、上下にピペッティングによるおよび microfuge の管で卵母細胞を分散します。液体含む卵母細胞の 50 μ L をスライド #1 の曇らされたガラス部分のセンターに転送します。# これを行う 2 スライドを持ち上げます。
    2. 液体の表面張力は 2 つの曇らされたガラス領域間のシールを作成するまで、スライド #2 をゆっくりと下ろします。すりガラスのエリアをカバーする十分な液体がありますがどれも浸出が。液体があふれている、余分な液体を削除するのにプル パスツール ピペットを使用します。
    3. 下部スライド (#1) 片手で押しながらスライド #2 レベルとのサポートされているスライド #3 維持する水平方向の一番上のスライド (#2) を行き来する他の手を使用します。卵母細胞の動きと進行中の簡単な可視化のための顕微鏡の下で実行します。
      注: この動きでは、「ロール」と、絨毛を失うに卵母細胞を引き起こす、摩擦が生成されます。最小限の圧力を使用する必要がありの動きが短く、簡単にする必要があります。
    4. いくつか水平方向に動き後、少し動き (図 4 b) の角度を変えます。複数単位で (#2) の一番上のスライドの動きが (図 4 b) の開始の方向に垂直になるまで徐々 に 90 ° に角度を増加します。空の絨毛が液体に表示される、絨毛を欠けている卵母細胞は長く、薄く表示されますに注意してください。
    5. ソリューションが曇りがちになるまで手順 4.3.3 - 4.3.4 を約 7-10 回繰り返します。卵母細胞 (75-85%) の大半は彼らの卵黄膜を失っていると圧延を停止します。
      注: 独特の先の尖った端は卵の卵黄膜を欠けている上に表示されます。卵黄膜が絨毛より削除は難しいです。光の圧力は、卵黄膜の除去を達成するために転がりながら一番上のスライド (スライド #2) に適用する可能性があります。すべての卵母細胞は、しばしば他の卵母細胞の破壊の結果から卵黄膜を削除しようとしました。
    6. フワリと一番上のスライド (#2)、霜で覆われた領域の中心に蓄積卵母細胞をロールバックできるように下部スライド (#1) の霜で覆われた領域の中心にそのコーナーの一つをドラッグします。PBSBTx の入った皿を深井戸に PBSBTx と両方のスライドから卵子をすすいでください。
    7. #1 と超純水、使い捨て可能なワイプ乾燥 #2 スライドをクリーンし、リセットします。4.3.1 - 4.3.6 卵母細胞は、同じ遺伝子がロールされているまでの手順を繰り返します。これは通常圧延遺伝子あたりの 3-4 ラウンドを必要があります。
  4. 圧延後の残骸を削除します。
    1. 15 mL の円錐管に 1 mL PBSBTx を追加します。チューブの側面に塗るに液体を旋回します。
    2. P1000 ピペット チップ、PBSBTx 追加 PBSBTx の追加の 2 mL の卵母細胞を含む円錐管に 1 mL を含む円錐管に深いから圧延の卵の皿も転送をコーティング、PBSBTx を使用しています。
    3. 卵母細胞の底に沈殿し、トップ、P1000 の破片 (絨毛、vitellinesなど) を含む溶液 2 mL を削除、破棄を開始しましょう。必要な場合は、彼らがシンク不透明な卵母細胞を見る暗い背景に円錐管を保持します。
    4. PBSBTx の追加 2 mL を加える卵母細胞、および 4.4.3 の手順を繰り返します。4.4.3 を繰り返します。瓦礫撤去の 3 ラウンドの合計。
    5. P1000 ピペット チップ、元の 500 μ L および microfuge の管に戻る転送卵子をコーティング、PBSBTx を使用しています。20-25 女性は圧延の成熟した卵子の約 50 μ L を得られるはず。
  5. 各遺伝子型の新鮮な曇らされたスライド、きれいな深い井戸の料理、新しい円錐管を使用して残りの遺伝子型のセクション 4 を繰り返します。
  6. ストレージが必要な場合は、転送と 0.1% TritionX 100 ストア 1 × PBS に卵子が 4 ° C で一晩非イオン性洗剤によって架橋結合するホルムアルデヒドを反転できますので長期保存はお勧めできません。

5. 魚

注: すべて洗浄は室温で nutator で実行されます限り。ロールされている卵子ホルムアミドを含むソリューションで特に、および microfuge の管の底に沈殿する時間がかかります。卵母細胞はプロセスで失われないようにソリューションを変更するときに患者をすることが重要です。これは、卵の洗口液と洗浄後解決させる 5-15 分を待っている必要があります。またホルムアミドの卵母細胞が少ない不透明なことに注意してください。

  1. 抽出と RNAse 処理
    1. 500 μ L の PBS 1% を含む卵をすすぎトリトン X-100 (PBSTx)。液体を削除し、500 μ L を追加抽出バッファー (PBSTx RNAse を含む)。Nutator 2 時間室温で孵化させなさい。
  2. 前の交配の洗浄
    1. トゥイーン 20 (SSCT) を含む生理食塩水クエン酸ナトリウム x 500 μ L 2 で 3 回卵をすすいでください。SSCT + 37 ° C に 50% ホルムアミド x 2 (〜 500 μ L/遺伝子型) に硫酸を予熱します。
      注意:ホルムアミドは有毒である、適切な保護具を着用します。
    2. 500 μ L 2 で 3 回 10 分ずつの卵を洗う x SSCT。10 分の卵を 500 μ L 2 x SSCT + 20% ホルムアミドに洗ってください。10 分の卵を 500 μ L 2 x SSCT + 40% ホルムアミドに洗ってください。10 分の卵を 500 μ L 2 x SSCT + 50% ホルムアミドに洗ってください。
    3. 液体を除去し、サンプルし、回転と 37 ° C で 2 時間インキュベートするステップ 5.2.1 から 37 ° C 2 x SSCT + 50% ホルムアミドの 500 μ L を追加します。
      注: ローテーター装備ハイブリダイゼーション オーブンはこのためにうまく動作します。泡 microfuge の管「フロート」、回転子に接続されているは、チューブを保護する使用ことができます。
  3. 変性および交配
    1. 卵母細胞の各チューブ、2.5 ng/μ L のセントロメア プローブと 0.31 pmol 蛍光/μ 各 BAC プローブを含む 1 x 交配バッファーの 40 μ L を使用します。交配バッファーのすべての遺伝子のために十分にプローブのソリューションを準備します。渦プローブ ミックス 30 秒追加する前に。
    2. BSA コーティング P200 ピペット チップを使用して、200 μ L の PCR チューブに卵母細胞を転送します。下に 37 ° C および let 卵子セトルでサンプルを維持し、引っ張られたパスツール ピペットを使用してできるだけ多くの液体を削除します。
    3. 卵母細胞にプローブ (セクション 2 の準備) を含むハイブリダイゼーション溶液 40 μ L を追加します。PCR マシンで卵母細胞を含む PCR チューブを置き、次のように孵化させなさい: 37 ° C、5 分、3 分、し 37 ° C 一晩 92 ° C。卵母細胞にプローブを追加すると後を保つそれら暗闇の中で可能な限り。
  4. ポスト交配の洗浄
    1. SSCT + 37 ° C に 50% ホルムアミド x 2 を予熱し、ハイブリダイゼーション インキュベーターでそれを保ちます。BSA を用いたコーティング P200 ピペットの先端卵子と PCR チューブに 37 ° C 2 x SSCT + 50% ホルムアミドの 100 μ L を追加し、新しい 500 μ L および microfuge の管に卵子を転送します。
    2. 管および卵子をインキュベーターの 37 ° C で解決しましょうと同じ 37 ° C 2 x SSCT + 50% ホルムアミドの追加の 400 μ L を追加します。
      注: 多くの場合解決この段階で時間がかかります。それは、15 分を取るには珍しい以上ではありません。忍耐力の欠如は、卵母細胞の重大な損失になります。
    3. 500 μ L 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C で 50% ホルムアミド回転で 3 回各 20 分の卵を洗います。37 ° C で卵子にまま、彼らは解決します。
    4. 500 μ L 37 ° C 2 x SSCT + 37 ° C で 50% ホルムアミド回転で 3 回 10 分ずつの卵母細胞を洗浄します。37 ° C で卵子にまま、彼らは解決します。
    5. 常温で 500 μ L 2 x SSCT + 40% ホルムアミド、nutator 上で 10 分の卵を洗います。10 分の卵を 500 μ L 2 x SSCT + 20% ホルムアミドに洗ってください。500 μ L 2 で 10 分の卵を洗う x SSCT。
  5. DAPI で染色します。
    注意: DAPI は有毒である、適切な保護具を着用します。
    1. 500 μ L DAPI 溶液 (1 μ g/ml) 2 で 20 分間卵を洗って、nutator の x SSCT。500 μ L 2 で卵母細胞を 3 回リンス x SSCT。500 μ L 2 の 2 回各 10 分の卵を洗って、nutator の x SSCT。Coverslips にマウントする準備ができるまで、暗闇の中で室温で 4 h までのサンプルを格納できます。
  6. 取付
    注: 必要なツールの図 3を参照してください。
    1. 解剖顕微鏡の下でポリ L リジン コーティングされた coverslip の場所。約 150 μ L に容量を調整すること、卵子のチューブから液体を除去します。BSA P200 ピペット チップ、ピペットを上下に、ソリューション全体で卵母細胞を分散し、ポリ-L-リジン コーティングされた coverslip に卵母細胞/溶液 40 μ L を転送をコーティングしました。
    2. 卵母細胞、coverslip に固執するが、まだ液体に囲まれてまで引っ張られたパスツール ピペットを使用して coverslip から液体の一部を削除します。鉗子を押しながら 1 つの側面のカバー スリップし優しく卵母細胞、非重複の卵母細胞の単一の層を達成するためにそれらを移動の塊を分離するタングステン針を使用します。
    3. 引っ張られたパスツール ピペットで卵子周囲液の残りの部分を削除します。きれいなガラス スライドを取るし、圧縮ガスを使用して、任意のほこりを吹き飛ばします。スライドの中央に (例えば延長金) メディアのマウントの 22 μ L を追加します。メディア サンプルに触れるまで、サンプルを直面しているメディアをマウントで、coverslip に向かってスライドをゆっくりと下ろします。表面張力は、coverslip のスライドに付着する原因となります。
    4. 新鮮な乾燥剤 (例えばdrierite) のレイヤーが含まれたタイトなフィッティングふた付きプラスチック容器にスライドを配置します。スライド画像の前に暗闇の中で 3-5 日間乾燥をしましょう。乾燥時間は、部屋の湿度に応じて異なる場合があります。

6. 画像

  1. 乾燥剤のボックスからドライ スライドを除去する際に任意のほこりの粒子を除去するそれらをきれいにします。マニキュアと coverslips をシールします。封印されたスライドは、-20 ° C で不明確に保存される場合があります。
  2. レーザースキャニング 6 X デジタル ・ ズームと高開口数 40 X 石油目的を用いた共焦点画像を取得します。
    注: 理想的には、システム ソフトウェアは、1 つを見つけるし、それらを見ながら複数の卵母細胞の減数分裂期染色体の X と Y の位置をマークする落射蛍光を使用します。この機能は、イメージング セッション中に時間を節約できます。漂白した高開口数 60 × 対物と急速な選ばれた共焦点システムが不適切な使用は他のシステム動作場合があります。
  3. DAPI 信号を使用してシリーズの上下を設定、それぞれの卵の Z シリーズをキャプチャします。
    注: ゲイン、オフセット、およびレーザー パワーが経験的卵母細胞のサブセットを使用して決定する必要があります。適切なパラメーターを見つけたら、マイナーな調整のみ必要があります行われる必要があります。
    買収を変更すると設定が必要です、以前に収集した画像のスタックを使用して必要な変更を評価します。漂白を避けるため、Z シリーズをキャプチャする前に腕プローブを事前イメージングを控えます。0.25 μ m のステップ サイズの Z シリーズ通常範囲 25 から方向および染色体の配置に応じて、30 の手順です。小さなステップ サイズは、1 つの魚の 2 つのスポットは、軸ディメンションに区切られていますが、小さいステップと漂白による信号強度の損失をキャプチャするために必要な時間とのトレードオフがあるかどうかを評価する能力が向上します。6 倍デジタル ズームと 1,024 x 512 イメージ フィールドと 40 X 目的は、0.05 μ m のピクセル サイズを持つ画像を生成します。

7. イメージ分析および凝集性の欠陥のためのスコアリング

  1. 各卵19の信号対雑音比を最適化するために Z シリーズを deconvolve します。
    注:材料表で指定されているものなどのソフトウェア パッケージ統合復元を使用する deconvolve と同様にトリミングし、コントラストは、画像を向上させることができます。重要なは、3 次元表示画像と結束性欠陥のスコアことができますソフトウェア パッケージは、不可欠です。
  2. 各卵子の腕および DAPI 信号 colocalize セントロメアの巣の数を集計します。凝集性の損失は特定のプローブの 3 つまたは 4 つのはっきりと分離信号の結果します。細い糸で接続されている 2 つの巣を観察することは珍しくないです。最も厳しい基準でこれらの巣はみなされない「分離」。

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結果

X染色体の細胞学的地域 6E 7B に交配腕プローブで得られた画像を図 5に示します。共同の DAPI、ローカライズ信号でこの検出結果の例は、背景から識別しやすいと正常に異なった遺伝子型19腕結束の欠陥を定量化するために使用されています。結束性欠陥の定量化は制限された prometaphase に私と中期私段階;核膜崩壊前に卵?...

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ディスカッション

私と中期 prometaphase の腕の結束の状態を評価するプローブの魚の使用私のショウジョウバエの卵母細胞はショウジョウバエの減数分裂の分野の重要な進歩。歴史的に、ショウジョウバエ研究者は成熟卵11,18,19腕結束の早期喪失を推論するための遺伝子検査に限られています。今、紹介した方法で腕の結?...

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開示事項

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

謝辞

この作品は、NIH グラント GM59354 シャロン E. Bickel に授与によって支えられました。Q. ウイ グエンにアン Lavanway 共焦点顕微鏡のヘルプとテクニカル サポートに J. エミリアーノ リード蛍光腕プローブの生成のためのプロトコルの開発に支援ありがちましょう。また、有用な議論やアドバイスのためのショウジョウバエのコミュニティで多くの同僚らを感謝いたします。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
Midi Prep kitQiagen12143Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) KitSigmaWGA2Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kitInvitrogenA21676Label BAC clone DNA
PCR purification kitQiagen28104Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chlorideFisher ScientificC75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfateSigmaD-8906
DrieriteDrierite Company23001
Dithiothreitol (DTT)Invitrogen15508-013Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl)Boehringer Mannheim1277049Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)Fisher ScientificS311-500Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof)Decon Laboratories2716
Tris (Ultra Pure)Invitrogen15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)SigmaE-3889
16% formaldehydeTed Pella, Inc.18505Toxic: wear appropriate protection
FormamideInvitrogenAM9342Toxic: wear appropriate protection
GlucoseFisher ScientificD16-1
GlycogenRoche901393
HEPESBoehringer Mannheim737-151
HeptaneFisher ScientificH350-4Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acidMilliporeHX0603-4Toxic: wear appropriate protection.
HydroxylamineSigma438227Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chlorideSigma104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2OFisher ScientificS373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2OFisher ScientificS369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml)SigmaP8920-100
Potassium acetateFisher ScientificBP364-500
Sodium acetateFisher ScientificS209-500Prepare 3M stock
Sodium cacodylatePolysciences, Inc.1131Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrateFisher ScientificBP327-1
Sodium chlorideFisher ScientificS271-3Sodium chloride
SucroseFisher ScientificS5-500
10% Tween 20Thermo Scientific28320Surfact-Amps
10% Triton X-100Thermo Scientific28314Surfact-Amps
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate)3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solutionToxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solutionToxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase)1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
NameCompanyCatalog NumberComments
Enzymes
AluINew England BiolabsR0137S
HaeIIINew England BiolabsR0108S
MseINew England BiolabsR0525S
MspINew England BiolabsR0106S
RsaINew England BiolabsR0167S
BfuCINew England BiolabsR0636S
100X BSANew England BiolabsComes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2New England BiolabsRestriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µlRoche/Sigma3333566001
TdT bufferRoche/SigmaComes with TdT enzyme
Cobalt chlorideRoche/SigmaToxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL)Thermo-ScientificEN0531
NameCompanyCatalog NumberComments
Cytology Tools etc.
ForcepsDumont#5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettesFisher13-678-20CAutoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dishCustom made
Deep well dish (3 wells)Pyrex7223-34
Fisherfinest Premium microscope slidesFisher Scientific22-038-104Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mmVWR Scientific48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thickThermo-Scientific3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5Thermo-Scientific3405
Tungsten needlehomemade
Prolong GOLD mounting mediaMolecular ProbesP36930
Compressed-air in canVarious
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR machineVarious
Nanodrop 2000, spectrophotometerThermo-Scientificmicrovolume spectrophotometer
VortexerVarious
Table top microfuge at room temperatureVarious
Table top microfuge at 4 °CVarious
Heat blockVarious
Hybridization oven or incubator with rotatorVarious
NutatorVarious
A1RSi laser scanning confoalNikon40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables etc.
50 mL conical tubesVarious
15 mL conical tubesVarious
1.5 mL microfuge tubesVarious
500 µl microfuge tubesVarious
200 µl PCR tubesVarious
Plastic container with tight fitting lidVariousTo hold Drierite
KimwipesVariousdisposable wipes
ParafilmVariousparaffin film
NameCompanyCatalog NumberComments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesCy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis SoftwarePerkinElmerVersion 6.3

参考文献

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710(2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263(2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607(2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013(2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

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