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Resumo

Este manuscrito apresenta um método detalhado para a geração X-cromossomo braço sondas e realizando fluorescência situ hibridação in (peixe) para examinar o estado da irmã coesão cromátide em prometafase e metáfase prendi Drosófila ovócitos. Este protocolo é apropriado para determinar se a coesão de braço meiótica é intacta ou interrompidos em diferentes genótipos.

Resumo

Em humanos, erros de segregação do cromossomo em oócitos são responsáveis para a maioria dos abortos espontâneos e malformações congénitas. Além disso, como as mulheres envelhecem, o risco de conceber que um feto aneuploid aumenta dramaticamente e este fenómeno é conhecido como o efeito da idade materna. Um requisito para a segregação do cromossomo precisos durante as divisões meióticas é manutenção da irmã coesão de cromátides irmãs durante o período de prófase estendida que a experiência de oócitos. Citológicas em seres humanos e organismos modelo sugerem que a coesão meiótica deteriora-se durante o processo de envelhecimento. Além disso, erros de segregação em oócitos humanos são mais prevalentes durante a meiose I, consistente com a perda prematura da coesão do braço. O uso de organismos modelo é fundamental para desvendar os mecanismos subjacentes a idade-dependente perda de coesão. Drosophila melanogaster oferece diversas vantagens para estudar o Regulamento de coesão meiótica em oócitos. No entanto, até recentemente, apenas testes genéticos estavam disponíveis a ensaiar para a perda de coesão de braço em oócitos de genótipos diferentes ou em diferentes condições experimentais. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido usando fluorescência em situ hibridação (peixe) para visualizar diretamente os defeitos na coesão de braço em prometafase I e metáfase prendi Drosophila oócitos. Gerando uma sonda de peixe que se para o braço distal do cromossomo X e coletando pilhas de Z confocal, um pesquisador pode visualizar o número de sinais individuais de peixes em três dimensões e determinar se irmã cromátide braços são separados. O procedimento descrito torna possível quantificar defeitos de coesão braço em centenas de oócitos de Drosophila . Como tal, este método oferece uma importante ferramenta para investigar os mecanismos que contribuem para a manutenção da coesão, bem como os fatores que levam à sua extinção durante o processo de envelhecimento.

Introdução

Adequada segregação dos cromossomos durante a mitose e meiose exige que a irmã cromátide coesão ser estabelecido, mantido e lançado em uma coordenada1,2. Coesão é estabelecida durante a fase S e é mediada pelo cohesin complexo, que forma ligações físicas que segure a irmã cromátides irmãs juntos. Na meiose, coesão distal de um crossover também funções para armazenar recombinantes homologs juntos e esta associação física ajuda a garantir a adequada orientação do forma bivalente na metáfase eu do eixo (Figura 1)3,4, 5. Lançamento do braço coesão na anáfase permite-lhe as homologs segregar para polos opostos do fuso. No entanto, se a coesão do braço é perdido prematuramente, recombinantes homologs perderá sua conexão física e segregar aleatoriamente, que pode resultar em gâmetas aneuploid (Figura 1).

Em oócitos humanos, erros na segregação do cromossomo são a principal causa de abortos e defeitos de nascimento, como síndrome de Down,6, e sua incidência aumenta exponencialmente com a idade materna7. Coesão de cromatídeos é criada em oócitos fetais e recombinação meiótica é concluída antes do nascimento. Oócitos depois prenda no meio da prófase eu até ovulação e durante esta prisão, associação física continuada de recombinantes homologs baseia-se na irmã coesão de cromátides irmãs. Portanto, precisa segregação durante a meiose e os resultados de gravidez normal exigem que coesão permanecem intactas por até cinco décadas.

Perda prematura de coesão durante a prolongada detenção meiótica de oócitos humanos tem sido proposta para contribuir para o efeito da idade materna e várias linhas de evidência suportam esta hipótese8,9. No entanto, tendo em conta os desafios da coesão meiótica em oócitos humanos a estudar, muito da nossa compreensão deste fenômeno baseia-se sobre a utilização do modelo organismos5,10,11,12, 13de14,,15.

Drosophila melanogaster oócitos oferecem inúmeras vantagens para o estudo da segregação meiótica de coesão e cromossomo. Um ensaio simples genético permite recuperar a descendência dos gâmetas aneuploid e medir a fidelidade do X-segregação de cromossomos em uma grande escala11,16,17. Além disso, um pode também determinar se erros de segregação do cromossomo surgem porque homologs recombinantes missegregate durante a meiose I, um fenótipo que é consistente com a perda prematura de braço coesão11,18, 19. direta observação do estado de coesão meiótica em oócitos de Drosophila também é possível usar a fluorescência em situ da hibridação (peixe). Apesar de oligonucleotídeos fluorescentes que hibridizam às sequências repetitivas de satélite têm sido usados por mais de uma década para monitorar pericentromeric coesão em madura Drosophila oócitos4,20, análise de braço coesão tem sido muito mais desafiador. Visualização do estado de coesão braço requer uma sonda que se estende por uma grande região de cópia única sequências e é brilhante o suficiente para resultar em sinais visíveis para cada irmã cromátides irmãs quando braço coesão está ausente. Além disso, as condições de fixação do oócito e tamanho dos DNAs rotuladas devem facilitar a penetração21 para o grande oócito maduro de Drosophila (200 µm de largura por 500 µm de comprimento). Recentemente, uma sonda de braço com êxito foi utilizado Visualizar cromátides irmãs oócito de Drosophila durante a anáfase, eu, mas os autores afirmou que não podia detectar um sinal em prometafase ou metáfase prendi oócitos22. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a geração de X-braço do cromossoma sondas de peixe e as condições de preparação de oócito que nos permitiram a ensaiar para a perda prematura da irmã coesão cromátide em prometafase I e metáfase eu oócitos. Estas técnicas, que nos permitiram identificar produtos de genes que são necessários para a manutenção da coesão meiótica, permitirá que outros a ensaiar para a irmã coesão cromátide defeitos em oócitos maduros de drosófila de diferentes genótipos.

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Protocolo

1. preparações

  1. Prepare soluções para fluorescência em situ da hibridação (peixe). Prepare todas as soluções usando água ultrapura.
    1. Prepare-se 5 x tampão do Robb modificado: acetato de potássio 275mm acetato de sódio 200 mM, sacarose 500mm, glicose de 50 mM, 6 mM de cloreto de magnésio, cloreto de cálcio de 5 mM, pH de 500 mM HEPES = 7,4. Trazer o pH para 7,4 usando 10 N NaOH. Filtro de esterilizar e armazenar a-20 ° C. Descongelar e diluir a 1 x, conforme necessário e armazenar 1 alíquotas x a-20 ° C.
    2. Prepare a solução salina tamponada fosfato (PBS) usando 1.3 M NaCl, 70mm Na2HPO4, 30mm NaH2PO4de 10x. Trazer o pH para 7.0 usando 10 N NaOH. Esterilize em autoclave ou filtro de esterilização.
  2. Preparar as lamelas de poli-L-lisina, um dia antes necessário.
    1. Pipetar o etanol a 70% contendo 1% ácido clorídrico sobre a superfície de uma lamela de 18 x 18 mm #1.5 e incubar 5 min. aspiração vácuo do uso para remover o líquido. Repita com água ultrapura esterilizada. Cobrir a superfície da lamela com 0,1 mg/mL poli-L-lisina e incubar durante 10 min.
    2. Aspire para remover o líquido e secar por 10 min. loja lamelas poli-L-lisina para cima em um recipiente de plástico com uma tampa apertada para evitar poeira.
  3. Prepare-se puxado Pasteur pipetas para remover soluções líquidas sem remover os ovócitos. Sobre uma chama do bico de Bunsen, aqueça no meio de um copo longo pipeta Pasteur puxando suavemente em cada extremidade até o vidro derrete e puxa separados.

2. geração de braço sonda para peixes

Nota: Todas as etapas de centrifugação são realizadas a ~ 16.000-21.000 x g (velocidade máxima na maioria das microcentrifuges da parte superior de tabela). Rodadas de centrífuga breve indicam fiação para 5 a 15 s. Vortex indica num Vortex para ~ 15 s no max velocidade a menos que indicado o contrário.

Nota: BACs para sondas de braço podem ser obtidos BAC PAC recursos. Dois X cromossomo braço eucromatina sondas têm sido utilizadas com sucesso com este método. Uma sonda de braço foi composta de seis clones de BAC correspondente ao citológico bandas 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). A outra sonda de braço consistiu de seis clones de BAC correspondente para bandas citológica 2F C - 3 (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs para outro cromossomo de Drosophila regiões podem ser visitadas em: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Duas sondas de pericentric que reconhecem a repetição de satélite bp 359 do cromossomo X têm sido utilizadas com sucesso com este método. Uma sonda de 22 nucleotídeo tem sido amplamente utilizada e funciona bem (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. Uma sonda de 28 nucleotídeo foi recentemente testada e também funcionou bem (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC purificado oligonucleotides 5' rotulado com um fluoróforo específico foram ordenados de uma fonte comercial (por exemplo, as tecnologias integradas de DNA).

  1. Prepare o DNA de clone BAC seguindo instruções do kit conforme especificado na Tabela de materiais. Resuspenda o pellet de DNA obtido a partir de 100 mL de cultura em 200 µ l de TE; a concentração final de DNA deve variar entre 5-40 ng / µ l, dependendo do clone de BAC.
  2. Execute a amplificação de DNA para cada BAC usando o kit de amplificação, conforme especificado na tabela de materiais e o seguinte protocolo. Processo de DNA BAC individualmente para cada clone. Uso de enzimas e buffers fornecidos com o kit em passos 2.2.1 através de 2.2.3.
    1. Fragmentação aleatória de DNA BAC: para cada BAC, usar TE preparar 10 µ l de uma solução de DNA 1 ng / µ l em um tubo PCR de 200 µ l. Adicione 1 µ l de tampão de fragmentação X 10. Colocar o tubo em uma máquina PCR a 95 ° C por exatamente 4 min. imediatamente legal a amostra em água gelada e centrifugar brevemente. A incubação é tempo sensível e qualquer desvio pode alterar os resultados.
    2. Preparação de biblioteca
      Nota: Este método utiliza primers aleatórios para gerar uma biblioteca de fragmentos ampliáveis.
      1. Para o tubo contendo o DNA adicione o seguinte: 2 µ l de 1 x Buffer de preparação de biblioteca, 1 µ l de solução de estabilização de biblioteca. Homogeneiza-se pela utilização do vortex, centrifugue brevemente e colocar o tubo na máquina de PCR a 95 ° C por 2 min. imediatamente legal a amostra em água gelada e centrifugar brevemente.
      2. Adicione 1 µ l de biblioteca preparação enzimática para o tubo do PCR, mistura e centrífuga brevemente. Lugar PCR tubo na máquina de PCR e incubá-los da seguinte forma: 16 ° C por 20 min, 24 ° C por 20 min, a 37 ° C por 20 min, 75 ° C por 5 min, em seguida, mantenha a 4 ° C.
      3. Retirar amostras da máquina do PCR e centrifugar brevemente. As amostras podem ser amplificadas imediatamente ou armazenadas a-20 ° C por até três dias.
    3. Amplificação da biblioteca de DNA BAC
      1. Adicionar os seguintes reagentes para a reação de fragmento aleatório inteiro 15 µ l: 7,5 µ l 10 x amplificação Master Mix, 47,5 µ l água livre de Nuclease, 5 µ l WGA DNA polimerase. Homogeneiza-se pela utilização do Vortex e centrifugar brevemente.
      2. Lugar PCR tubo na máquina de PCR e incubá-los da seguinte forma: iniciais da desnaturação de 95 ° C por 3 min, 14 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 15 s, seguido de recozimento/extensão a 65 ° C por 5 min, em seguida, mantenha a 4 ° C.
      3. Depois de andar de bicicleta é completa, do ensaio a concentração de DNA. A concentração de DNA deve ser pelo menos 800 ng / µ l. amostras de manter a 4 ° C ou loja a-20 ° C até pronto para a digestão. Opcionalmente, avaliar o tamanho do fragmento de DNA executando 400 ng de DNA em um gel de agarose 2%. Fragmentos devem variar de 200 bp e 3 kb (Figura 2).
  3. Digestão da enzima de restrição do DNA amplificado
    1. Lugar de 20 µ g de DNA amplificado da seção anterior em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 20 unidades de Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 unidades de BfuCl, 0,5 µ l 100 x BSA, 5 µ l 10 x buffer de digestão de enzima de restrição e ajustar o volume de 50 µ l, adicionando a quantidade adequada de ultrapura H2O.
    2. Incube a digest durante a noite a 37 ° C, em uma incubadora para impedir a condensação na tampa. Etanol precipitar o DNA digerido. Adicionar para o digest: 1 glicogênio µ l, acetato de sódio 3M volume 1/10, etanol 100% nível molecular de 2,5 volumes. Incube a-80 ° C durante 1 h ou durante a noite.
    3. Centrífuga para 30 min a 4 ° C. Pellet de DNA de lavar com 1 volume de sala temp 70% de etanol e rotação por 5 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante e deixar o DNA da pelota secar ao ar ou seque suavemente com um fluxo constante de ar.
    4. Resuspenda o pellet de DNA em 36 µ l estéril ultrapura H2O e utilizar 1 µ l de DNA a ensaiar a concentração de DNA, que deve ser aproximadamente 285 ng / µ l. armazenar o DNA a-20 ° C.
    5. Opcionalmente, avaliar o tamanho do fragmento de DNA executando 400 ng de DNA em um gel de agarose 2%. A maioria dos fragmentos devem variar de 100-200 bp, com um sinal mais fraco até 500 bp (Figura 2).
  4. 3' seguindo a reação
    1. Desnature o DNA digerido a 100 ° C por 1 min em um bloco de calor. Imediatamente esfriar em água gelada. À 35 µ l de DNA, adicione o seguinte: 50 µ l 400 milímetros de sódio cacodylate, 1 µ l 10 mM DTT e vórtice bem. Adicionar 4 µ l 25 mM CoCl2, 2,5 µ l 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP de ARES rotulagem kit conforme especificado na tabela de materiais, 5 µ l 1 mM dTTP, 18 µ l 5 x TdT buffer e transferase terminal deoxynucleotidyl de 1 µ l (TdT) 400 U / µ l. Vortex e centrífuga brevemente.
      Atenção: CoCl2 é tóxica, use proteção adequada.
    2. Incube durante 2 h a 37 ° C em uma incubadora para evitar a condensação. Adicione 1 µ l de 250 mM EDTA para parar a reação e o vórtice brevemente para misturar. Etanol precipitar o DNA de cauda, conforme descrito acima (passos 2.3.2 - 2.3.4). Resuspenda o pellet de DNA secado em 10 µ l estéril ultrapura H2O. loja do DNA a-20 ° C até que esteja pronto para continuar.
  5. Realizar a conjugação de tintura fluorescente usando o kit de DNA rotulagem conforme especificado na tabela de materiais.
    Nota: Uma vez que o corante é adicionado manter amostras no escuro.
    1. Desnature o DNA caudo a 95 ° C por 5 min em um bloco de calor. Imediatamente, cool DNA brevemente em água gelada e centrífuga. Preparar o buffer de rotulagem de acordo com as instruções do jogo e adicionar 6 µ l de cada amostra de DNA. Resuspenda cada tubo de corante em 4 µ l de DMSO do kit. Vórtice e centrífuga brevemente.
    2. Use um tubo de corante para cada reação de rotulagem. Adicione a solução de corante para o DNA, vórtice e centrífuga brevemente. Incube a reação de rotulagem em temperatura ambiente por 2 horas no escuro. Adicione 3 µ l de hidroxilamina 3M para parar a reação seguida por µ l 77 de nuclease isento de H2O do kit. Vórtice e centrífuga brevemente.
  6. Remova o corante não conjugada usando o kit de purificação de PCR conforme especificado na tabela de materiais. Siga as instruções do fabricante. Eluir o DNA da coluna duas vezes usando 40 µ l de tampão de eluição de cada vez.
  7. Etanol precipitar o DNA Etiquetado como descrito anteriormente (passos 2.3.2 - 2.3.4). Resuspenda o pellet de DNA secado em tampão de eluição 10 µ l.
  8. Preparar a mistura de sonda
    1. Para DNA etiquetada, determine a concentração do corante fluorocromo em pmol / µ l. A concentração de fluoróforo pode variar de 30-100 pmol / µ l, dependendo do BAC. A concentração de DNA pode variar de 300-800 ng / µ l.
      Nota: A configuração de microarray funciona bem em um Espectrofotômetro de microvolume, como o especificado na tabela de materiais. Na janela de microarray, selecione DNA-50 e especificar o fluorocromo.
    2. Crie uma mistura de mestre combinando montantes equimolar (pmol fluor) de cada uma das sondas BAC. Vórtice 30 s antes combinando. Para evitar ciclos de congelamento/descongelamento, preparar alíquotas do mestre mix, aplique película de parafina para os tubos para evitar a evaporação e armazenar no escuro a-20 ° C.
      Nota: Um mastermix contendo 250 pmol de cada um do CCB individuais 6 sondas em um volume total de 30-50 µ l funciona bem. Uma alíquota contendo 25 pmol (fluor) para cada BAC será suficiente para reações de hibridação de duas 40 µ l, com uma concentração final de sonda de 0,31 pmol fluor / µ l para cada BAC.

3. dissecção e fixação de ovócitos

  1. Colete 30 fêmeas adultas de virgens do genótipo adequado. Para enriquecer para oócitos de estágio final, segure fêmeas sem machos em um frasco com comida de mosca e fermento seco por 3-5 dias antes de dissecação25. No dia anterior dissecação, transferi as fêmeas sem gás para um frasco de doce com fermento.
  2. Faz a dissecação.
    Nota: Consulte a Figura 3 para ferramentas necessárias. Soluções são removidas usando uma pipeta Pasteur puxada, exceto onde anotado. Ao transferir os ovários sempre use uma ponta de pipeta revestida com uma solução de BSA de 10%.
    1. Em um prato raso dissecação contendo tampão do Robb modificado, use fórceps para remover os ovários de uma única fêmea. Uso de fórceps ou uma agulha de tungstênio para splay suavemente cada ovário, permitindo que a solução contatar ovarioles interna. Transferi o par de ovários inclinados para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo tampão do 1ml modificado Robb.
    2. Repita a etapa 3.2.1 para acumular os ovários das fêmeas de 20-25 no tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Termine as dissecções de 20 a 25 fêmeas dentro de 10 min.
  3. Execute a fixação da seguinte maneira.
    1. Com uma pipeta Pasteur puxada, remover o líquido no tubo de microcentrífuga, use um P1000 rapidamente adicionar 500 µ l de solução de correção de 37 ° C para os ovários e em seguida, adicione imediatamente 500 µ l de heptano de temperatura para os ovários.
    2. Tubo de microcentrífuga agitar para misturar e coloque em um nutator de 3 min. Retire o tubo de microcentrífuga da nutator e do lugar em uma cremalheira do tubo para 1 min permitir que os oócitos para resolver ao fundo. O tempo de fixação total é 4 min.
      Atenção: Solução de correção e heptano são tóxicos, use proteção adequada.
    3. Remover a solução e enxágue os ovários 3 vezes em 500 µ l de PBS contendo BSA de 0,5% e 0,1% Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Repita para genótipos restantes.

4. remoção de Chorions e membranas vitelínico

Nota: Consulte a Figura 3 para ferramentas necessárias.

  1. Oócitos de estágio final separado
    1. Adicione 1 mL de PBSBTx para um prato raso de dissecação. Use um P200 com uma ponta revestida de BSA para transferir ovários fixos (em ~ 150 µ l) para o prato raso. Pipete ovários acima e para baixo com a ponta da pipeta revestido de BSA para desalojar os oócitos maduros de oócitos menos maduros.
    2. Quando tarde oócitos de palco são suficientemente separados, transferi todo o tecido para um tubo de microcentrífuga de 500 µ l. Remover o excesso de líquido com uma pipeta Pasteur puxado, deixando cerca 150-200 µ l no tubo. Repeti a secção 4.1 para genótipos restantes.
  2. Prepare-se para laminação
    1. Pre-molhado um prato poço profundo com 200 µ l de PBSBTx. tampa e reserve. Obter 3 lâminas de vidro fosco e conjunto slide #3 de lado. Esfrega suavemente as regiões de vidro fosco de slides #1 e #2 juntos. Lave-os em água desionizada para remover qualquer cacos de vidro e seque com uma limpeza descartável.
    2. Pelagem foscas regiões dos slides #1 e #2 com PBSBTx adicionando 50 µ l de PBSBTx para um slide e esfregando esta região com o outro slide. Retire o líquido com uma limpeza descartável.
    3. Coloque as lâminas ao microscópio dissecação na configuração mostrada na Figura 4A. Mantém as regiões foscas de slides #1 e #2 no contato, com slide #3 apoio slide #2.
  3. Rolo de oócitos; Certifique-se de que a direção do rolamento é sempre em linha reta e nunca um movimento circular.
    1. Pipeta prewet um P200 dica em PBSBTx e dispersar os oócitos no tubo de microcentrífuga pipetando para cima e para baixo. Transferi 50 µ l de líquido contendo ovócitos para o centro da parte do slide #1 de vidro fosco. Levante o slide #2 para fazer isso.
    2. Abaixe lentamente o slide #2 até que a tensão de superfície do líquido cria uma vedação entre as duas regiões de vidro fosco. Deveria haver líquido suficiente para cobrir a área fosco, mas nenhum deve ser escorrer para fora. Se o líquido está transbordando, use uma pipeta Pasteur puxada para remover o excesso de líquido.
    3. Prender a lâmina inferior (#1) no lugar com uma mão e use a outra mão para mover a corrediça superior (#2) e para trás no sentido horizontal, mantendo o nível slide #2 e suportados no slide #3. Realizar-se sob um microscópio para fácil visualização dos movimentos do oócito e progresso.
      Nota: Este movimento vai gerar atrito e causar os oócitos "rolar" e perder a suas chorions. Pressão mínima deve ser usado e os movimentos devem ser curtos e rápidos.
    4. Depois de alguns movimentos no sentido horizontal, altere um pouco o ângulo de movimento (Figura 4B). Em múltiplos incrementos, gradualmente aumente este ângulo de 90° até que o movimento da lâmina superior (#2) é perpendicular à direção inicial (Figura 4B). Observe que o chorions vazios será visíveis no líquido e oócitos falta chorions aparecerá mais longo e mais fino.
    5. Repita os passos 4.3.3 - 4.3.4 cerca de 7 - 10 vezes até que a solução torna-se ligeiramente turva. O travão quando a maioria dos oócitos (75-85%) parece ter perdido suas membranas vitelínico.
      Nota: Uma extremidade pontiaguda distintiva é frequentemente visível em oócitos falta vitelínico membranas. Vitelínico membranas são mais difíceis de remover do que chorions. Uma ligeira pressão pode ser aplicada para a corrediça superior (slide #2) enquanto rola para conseguir a remoção das membranas vitelínico. Tentar remover vitelínico membranas de todos os oócitos, muitas vezes, resulta na destruição de outros oócitos.
    6. Levante suavemente a corrediça superior (#2), arrastando um dos seus cantos para o centro da região fosco da lâmina inferior (#1) para que rolou oócitos acumular-se no centro da região de fosco. Enxágue oócitos de ambos os slides com PBSBTx no poço profundo prato contendo PBSBTx.
    7. Slides #1 e #2 com água ultrapura, seca com uma limpeza descartável, de limpar e repor. Repita as etapas 4.3.1 - 4.3.6 até rolaram todos os oócitos com o mesmo genótipo. Isto requer geralmente 3-4 rodadas de rolamento por genótipo.
  4. Remover os resíduos após a laminagem
    1. Adicione 1 mL de PBSBTx para um tubo cônico de 15 mL. Agite o líquido para revestir os lados do tubo.
    2. Usar um PBSBTx revestido a ponta da pipeta P1000, transferência de oócitos laminados do fundo bem o prato para o tubo cônico contendo 1 mL de PBSBTx. adicionar um adicional 2 mL de PBSBTx para o tubo cônico contendo os ovócitos.
    3. Que comecem os oócitos resolver ao fundo, em seguida retire a tampa 2 mL de solução contendo detritos (chorions, vitellines, etc.) com um P1000 e descartar. Se necessário, segure o tubo cónico contra um fundo escuro para ver os ovócitos opacos como eles afundam.
    4. Adicionar um adicional 2 mL de PBSBTx para os oócitos e repita a etapa 4.4.3. 4.4.3 repetição. um total de 3 rounds de remoção de entulhos.
    5. Usar um PBSBTx revestido a ponta da pipeta P1000, oócitos de transferência para o tubo de microcentrífuga original 500 µ l. 20 - 25 fêmeas devem produzir cerca de 50 µ l de oócitos maduros laminados.
  5. Repita seção 4 para os genótipos restantes usando slides foscas frescas, um prato limpo profunda e um novo tubo cônico para cada genótipo.
  6. Se o armazenamento é necessário, transferência de oócitos de 1X PBS com 0,1% TritionX-100 e loja durante a noite a 4 ° C. Armazenamento a longo prazo não é recomendado porque reticulação de formaldeído pode ser revertida por detergentes não-iônicos.

5. PEIXE

Nota: Todas as lavagens são executadas em um nutator à temperatura ambiente a menos que indicado o contrário. Oócitos que tenham sido rolados levam mais tempo para resolver a parte inferior do tubo de microcentrífuga, especialmente em soluções que contêm o formamide. É importante ser paciente quando alterar soluções para que os oócitos não são perdidos no processo de. Isso pode exigir esperando 5-15 min para deixar oócitos resolver após lavagens e lavagens. Observe também que os oócitos em formamida são menos opacos.

  1. Tratamento de extração e RNAse
    1. Enxágue oócitos com 500 µ l de PBS contendo 1% Triton X-100 (PBSTx). Retire o líquido e adicione 500 µ l tampão de extração (PBSTx contendo RNAse). Incube em nutator em temperatura ambiente por 2 h.
  2. Pré-hibridização lavagens
    1. Enxágue oócitos 3 vezes com 500 µ l 2 x salina citrato de sódio, contendo Tween 20 (SSCT). Pré-aqueça uma alíquota (~ 500 µ l/genótipo) de 2 x SSCT + formamida 50% a 37 ° C.
      Atenção: formamida é tóxica, use proteção adequada.
    2. Lave oócitos por 10 min cada por 3 vezes em 500 µ l 2 x SSCT. Lave oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + 20% formamida. Lave oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + 40% formamida. Lave oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + formamida 50%.
    3. Retire o líquido e adicionar 500 µ l de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% da etapa 5.2.1 a amostra e incubar durante 2 h a 37 ° C com rotação.
      Nota: Um forno de hibridização equipado com um rotor funciona bem para isso. Um tubo de microcentrífuga de espuma "float" anexado para o rotator pode ser usado para proteger os tubos.
  3. Desnaturação e hibridação
    1. Para cada tubo de oócitos, use 40 µ l de tampão de hibridização 1 x contendo sonda centromérica de 2,5 ng / µ l e 0,31 pmol fluor / µ l de cada sonda de BAC. Prepare uma solução da sonda em tampão de hibridização suficiente para todos os genótipos. Vórtice sonda mistura 30 s antes de adicionar.
    2. Utilize uma ponta de pipeta P200 BSA-revestido, transferência de oócitos para um tubo PCR de 200 µ l. Manter amostras a 37 ° C e deixe oócitos settle ao fundo e, em seguida, usar uma pipeta Pasteur puxada para remover tanto líquido quanto possível.
    3. Adicione 40 µ l de solução de hibridação com sonda (preparada na seção 2) de oócitos. Coloque o tubo PCR contendo ovócitos na máquina de PCR e incubá-los da seguinte forma: 37 ° C por 5 min, 92 ° C por 3 min, em seguida 37 ° C durante a noite. Após sonda é adicionada ao oócitos, mantê-los no escuro tanto quanto possível.
  4. Lavagens de pós-hibridização
    1. Pré-aqueça o 2 x SSCT + formamida 50% a 37 ° C e mantê-lo na incubadora de hibridização. Com uma BSA revestido P200 Pipetar ponta, adicionar 100 µ l de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% para o tubo PCR com os oócitos e transferir os oócitos para um tubo de microcentrífuga de novo 500 µ l.
    2. Adicione um adicional de 400 μL de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% para o mesmo tubo e deixar que os oócitos resolver a 37 ° C na incubadora.
      Nota: Fixando-se, frequentemente, leva mais tempo para esta etapa. Não é incomum para levar 15 min ou mais. A falta de paciência resultará em perda significativa de ovócitos.
    3. Lave os oócitos por 20 min cada por 3 vezes em 500 µ l de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% a 37 ° C com rotação. Manter oócitos a 37 ° C, enquanto eles resolvem.
    4. Lave os oócitos por 10 min cada por 3 vezes em 500 µ l de 37 ° C 2 x SSCT + formamida 50% a 37 ° C com rotação. Manter oócitos a 37 ° C, enquanto eles resolvem.
    5. À temperatura ambiente, lave os oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + 40% formamida em um nutator. Lave os oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT + 20% formamida. Lave os oócitos por 10 min em 500 µ l 2 x SSCT.
  5. Mancha com DAPI
    Cuidado: DAPI é tóxica, use proteção adequada.
    1. Lave oócitos por 20 min em solução DAPI 500 µ l (1 µ g/ml) em 2 x SSCT sobre o nutator. Lave os oócitos 3 vezes em 500 µ l 2 x SSCT. Lave os oócitos 2 vezes por 10 min cada em 500 µ l 2 x SSCT sobre o nutator. As amostras podem ser armazenadas por até 4 h à temperatura ambiente no escuro até que estejam prontos para montar em lamelas.
  6. Montagem
    Nota: Consulte a Figura 3 para ferramentas necessárias.
    1. Coloque uma lamela de poli-L-lysine revestida sob o microscópio de dissecação. Retire o líquido do tubo de oócitos, ajustando o volume total de cerca de 150 µ l. Com uma BSA revestido P200 ponta da pipeta, pipeta de cima e para baixo para dispersar oócitos em toda a solução e então transfira 40 µ l da solução de oócitos para uma lamela revestida de poli-L-lisina.
    2. Retire parte do líquido da lamela utilizando uma pipeta Pasteur puxada até os oócitos furar a lamela, mas ainda estão rodeados por líquido. Com a pinça, segure o deslizamento da tampa de um lado e usar uma agulha de tungstênio para dissociar suavemente touceiras de ovócitos, movendo-os para conseguir uma única camada de não-sobreposição de ovócitos.
    3. Remova o restante do líquido ao redor de oócitos com uma pipeta Pasteur puxado. Levar uma lâmina de vidro limpa e usar o gás comprimido para explodir toda a poeira. Adicione 22 µ l de mídia (por exemplo, Prolong-ouro) para o meio da corrediça de montagem. Baixe lentamente a lâmina em direção a lamela, com os meios de montagem virado para a amostra, até os meios de comunicação em contacto com a amostra. Tensão superficial fará com que a lamela aderir ao slide.
    4. Coloque slides em um recipiente de plástico com uma tampa tight-fitting que contém uma camada de dessecante fresco (por exemplo, drierite). Deixe slides secar por 3-5 dias no escuro antes de imagem. Tempo de secagem pode variar dependendo da umidade do quarto.

6. imaging

  1. Depois de retirar slides secos da caixa de dessecante, limpá-los para remover quaisquer partículas de poeira. Selar as lamelas com os esmaltes. Selado de slides podem ser armazenados indefinidamente a-20 ° C.
  2. Adquira imagens confocal com um objectivo de óleo abertura numérica elevada 40 X 6 X zoom digital de exploração do laser.
    Nota: Idealmente, software de sistema irá permitir a encontrar e marcar o local X-Y de cromossomos meióticos para vários oócitos enquanto visualiza-los usando epifluorescência. Esse recurso economiza tempo durante uma sessão de imagens. Rápida de branqueamento com um objectivo de abertura numérica elevada 60 X feito seu uso inadequado com o sistema escolhido confocal, mas pode funcionar para outros sistemas.
  3. Capture uma série de Z para cada oócito, definindo a parte superior e inferior da série usando o sinal DAPI.
    Nota: O ganho, deslocamento, e poder do laser precisará ser determinado empiricamente utilizando um subconjunto de ovócitos. Uma vez que parâmetros adequados são encontrados, apenas pequenos ajustes devem precisam ser feitas.
    Se alterou a aquisição configurações são necessárias, use a pilha de imagem previamente coletados para estimar as alterações necessárias. Para evitar o branqueamento, abster-se de pre-imagem da sonda de braço antes de capturar a série Z. Com um tamanho de passo de 0,25 µm, série Z tipicamente variar de 25 a 30 passos, dependendo da orientação e posicionamento dos cromossomos. Um tamanho de passo menor pode melhorar a capacidade de avaliar se os dois pontos de peixe são separados na dimensão axial, mas há um trade-off com o tempo necessário para capturar pequenos passos e perda de intensidade do sinal devido ao clareamento. Um objectivo X 40 com 6x zoom digital e um campo de imagem de 1.024 x 512 gera imagens com um tamanho de pixel de 0,05 µm.

7. imagem análise e pontuação para defeitos de coesão

  1. Deconvolve a série Z para otimizar a relação sinal-ruído para cada oócito19.
    Nota: Um pacote de software, como especificado na Tabela de materiais permite que se deconvolve usando restauração Integrativa, bem como de culturas e contraste-melhorar as imagens. Importante, um pacote de software que permite ver imagens e pontuação para a coesão defeitos em três dimensões é imperativo.
  2. Para cada oócito, tabular o número de braço e focos centromérica que colocalize com o sinal DAPI. Perda de coesão resulta em três ou quatro sinais distintos e separados por uma ponta de prova específica. Não é incomum observar dois focos que estão conectados por um fio fino. Pelos critérios mais rigorosos, estes focos não seriam considerados "separados".

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Resultados

A Figura 5 apresenta imagens obtidas com uma sonda de braço que se a região citológica 6E-7B no cromossomo X . Este resulta da sonda em um sinal de que co localiza com o de DAPI, é facilmente distinguível do fundo e tem sido usada com sucesso para quantificar defeitos de coesão braço em diferentes genótipos de19. Quantificação de defeitos de coesão se restringia a prometafase I e metáfase eu estágios; oócitos ant...

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Discussão

O uso de peixes sondas para avaliar o estado da coesão de braço em prometafase I e metáfase eu Drosophila oócitos é um avanço significativo no campo da drosófila meiose. Historicamente, a drosófila pesquisadores foram limitados ao testes genéticos para inferir a perda prematura da coesão de braço em oócitos maduros11,18,19. Agora, com os métodos apresentados aqui, o estado da coesão do br...

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Divulgações

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant GM59354 atribuído a Sharon E. Bickel. Agradecemos Huy p. Nguyen assistência no desenvolvimento do protocolo para a geração de sondas fluorescentes braço, Ann Lavanway para ajuda com microscopia confocal e J. Emiliano Reed para assistência técnica. Agradecemos também a numerosos colegas na Comunidade da drosófila para discussões úteis e conselhos.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
Midi Prep kitQiagen12143Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) KitSigmaWGA2Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kitInvitrogenA21676Label BAC clone DNA
PCR purification kitQiagen28104Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chlorideFisher ScientificC75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfateSigmaD-8906
DrieriteDrierite Company23001
Dithiothreitol (DTT)Invitrogen15508-013Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl)Boehringer Mannheim1277049Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)Fisher ScientificS311-500Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof)Decon Laboratories2716
Tris (Ultra Pure)Invitrogen15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)SigmaE-3889
16% formaldehydeTed Pella, Inc.18505Toxic: wear appropriate protection
FormamideInvitrogenAM9342Toxic: wear appropriate protection
GlucoseFisher ScientificD16-1
GlycogenRoche901393
HEPESBoehringer Mannheim737-151
HeptaneFisher ScientificH350-4Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acidMilliporeHX0603-4Toxic: wear appropriate protection.
HydroxylamineSigma438227Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chlorideSigma104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2OFisher ScientificS373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2OFisher ScientificS369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml)SigmaP8920-100
Potassium acetateFisher ScientificBP364-500
Sodium acetateFisher ScientificS209-500Prepare 3M stock
Sodium cacodylatePolysciences, Inc.1131Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrateFisher ScientificBP327-1
Sodium chlorideFisher ScientificS271-3Sodium chloride
SucroseFisher ScientificS5-500
10% Tween 20Thermo Scientific28320Surfact-Amps
10% Triton X-100Thermo Scientific28314Surfact-Amps
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate)3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solutionToxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solutionToxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase)1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
NameCompanyCatalog NumberComments
Enzymes
AluINew England BiolabsR0137S
HaeIIINew England BiolabsR0108S
MseINew England BiolabsR0525S
MspINew England BiolabsR0106S
RsaINew England BiolabsR0167S
BfuCINew England BiolabsR0636S
100X BSANew England BiolabsComes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2New England BiolabsRestriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µlRoche/Sigma3333566001
TdT bufferRoche/SigmaComes with TdT enzyme
Cobalt chlorideRoche/SigmaToxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL)Thermo-ScientificEN0531
NameCompanyCatalog NumberComments
Cytology Tools etc.
ForcepsDumont#5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettesFisher13-678-20CAutoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dishCustom made
Deep well dish (3 wells)Pyrex7223-34
Fisherfinest Premium microscope slidesFisher Scientific22-038-104Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mmVWR Scientific48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thickThermo-Scientific3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5Thermo-Scientific3405
Tungsten needlehomemade
Prolong GOLD mounting mediaMolecular ProbesP36930
Compressed-air in canVarious
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR machineVarious
Nanodrop 2000, spectrophotometerThermo-Scientificmicrovolume spectrophotometer
VortexerVarious
Table top microfuge at room temperatureVarious
Table top microfuge at 4 °CVarious
Heat blockVarious
Hybridization oven or incubator with rotatorVarious
NutatorVarious
A1RSi laser scanning confoalNikon40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables etc.
50 mL conical tubesVarious
15 mL conical tubesVarious
1.5 mL microfuge tubesVarious
500 µl microfuge tubesVarious
200 µl PCR tubesVarious
Plastic container with tight fitting lidVariousTo hold Drierite
KimwipesVariousdisposable wipes
ParafilmVariousparaffin film
NameCompanyCatalog NumberComments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesCy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis SoftwarePerkinElmerVersion 6.3

Referências

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