Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para aumentar la producción de quimeras sin el uso de nuevos equipos. Un cambio de orientación simple del embrión para la inyección puede aumentar el número de embriones producidos y potencialmente reducir la línea de tiempo a la transmisión de la línea germinal.

Resumen

En un esfuerzo por aumentar la eficiencia en la creación de ratones modificados genéticamente a través de metodologías ES celular, presentamos una adaptación del protocolo actual de inyección de blastocisto. Aquí divulgamos que una simple rotación del embrión y de la inyección a través de la masa celular de Trans-interno (TICM) aumentó el porcentaje de ratones quiméricos del 31% al 50%, con ningún equipo adicional o formación más especializada. endogámicas de 26 diferentes clones y clones total 35 fueron inyectados en un período de 9 meses. No hubo diferencias significativas en la tasa de embarazo o índice de recuperación de embriones entre técnicas de inyección tradicional y TICM. Por lo tanto, sin ninguna alteración importante en el proceso de inyección y un simple posicionamiento del blastocisto e inyectar a través del ICM, liberación de las células madre embrionarias en la cavidad del blastocoel puede mejorar potencialmente la cantidad de producción quimérica y posterior transmisión de la línea germinal.

Introducción

Durante casi 25 años, la creación de ratones genéticamente apuntados ha sido un proceso lento, a menudo obstaculizado por un cuello de botella en la etapa de blastocistos ES células microinyección para la generación de germline transmisión de quimeras. Los avances recientes, incluyendo CRISPR/Cas9^1,2 en células madre embrionarias y de alto rendimiento ES célula consorcios de generación como KOMP, han mejorado la generación y disponibilidad de modificados genéticamente células madre embrionarias. Sin embargo, la generación de quimeras del germline sigue siendo un cuello de botella en la creación de ratones modificados genéticamente de estas células ES^3,4. Proyectos de generación de alto rendimiento ES la célula han estado plagados de alta variabilidad en la calidad de células ES, que es crítica para la exitosa creación de quimeras del germline. Además, algunas de las líneas de células ES comúnmente utilizadas son conocidos por aneuploidia alta y la difícil producción de germline quimeras competentes⁵.

Muchos métodos se han desarrollado para la creación de ratones con una quimera o superior, o totalmente celular ES derivado ratones^6,7,8,9,10. Mientras que cada uno de estos sistemas tiene sus propios méritos, también tienen sus defectos. La generación de quimeras tetraploides, mientras que la generación de celulares ES de 100% derivados de ratones, es ineficiente y generalmente limitado a líneas exogámica ^5,6. Más nuevos métodos de inyección de mórula pueden producir alto porcentaje quimeras, cercana al 100%, pero generalmente requieren equipo adicional significativa (láser o piezoeléctricos) y capacitación^10,11. En laboratorios donde estas técnicas ya están en marcha, esta nueva metodología puede no ser necesaria.

Objetivo de este estudio fue encontrar un método que utiliza técnicas comunes y equipos disponibles para aumentar la velocidad de generación de quimera, aumentando la posibilidad de transmisión del germline del alelo del mutante para establecer la colonia de ratón posterior.

Protocolo

Todas las operaciones se realizaron como parte del funcionamiento normal de la instalación de NIEHS Knock Out Mouse base. Todos los ratones fueron mantenidos en un 12:12 ciclo de h luz: oscuridad y se alimentan una dieta de agua y NIH-31 ad libitum. Todos los experimentos fueron realizados según el cuidado Animal y Comité de uso del nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental.

1. animal preparación

1. Raza de ratones donantes, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos/j 8-10 semanas de edad naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J ratones machos entre 8 y 26 semanas de edad. Verificación se conecta visualmente a la mañana siguiente (E0.5).
2. Se crían ratones receptores, Swiss Webster ratones hembra entre 6 y 9 semanas de edad se crían naturalmente a vasectomía ratones machos Swiss Webster. Verificación se conecta visualmente a la mañana siguiente (E0.5).

2. ES la célula preparación

1. Para derieved 129 AB2.2 ES cells, cultura células en DMEM suplementado con 15% FBS, 1% glutamina, 1% Penn/strep y 0.1% β-mercaptoetanol. Cultura todas las células de otras ES siguiendo las instrucciones del proveedor de celular ES, utilizando los protocolos recomendados.

3. embrión colección

1. Disección de animales
   1. Preparar varios platos de 60 mm, aproximadamente 1 por 5 ratones más suplemento 3, con 10 mL ráfaga colección los medios de comunicación (BCM) (10% FBS en DMEM), y un 4 plato bien con 0.5 mL de BCM por pozo. Equilibrar a 37 ° C, 5% CO₂.
   2. Eutanasia a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos /J en E3.5 CO₂ asfixia, con un caudal de 10%.
   3. Después euthanizing, coloque el ratón en la posición supina y mojado el abdomen con etanol al 70%.
   4. Hacer la primera incisión a través de la piel, en el punto medio del abdomen, haciendo la apertura tan amplia como sea posible. A continuación abra a través de la pared abdominal, otra vez hacer la incisión lo más amplia posible.
      Nota: Hacerlo en dos pasos ayuda a reducir o eliminar la contaminación de la piel.
   5. A partir de un ovario y sostiene la almohadilla grasa del ovario con fórceps romos, retire con cuidado el ovario, oviducto y útero, teniendo mucho cuidado para mantener el tejido adiposo a un mínimo. Extirpar el útero como una sola unidad, o como los cuernos, sin cambio en el procedimiento siguiente.
   6. Después del retiro, colocar el útero en un plato de 60 mm que contiene medios de colección ráfaga.
2. Eliminación de embriones
   1. Preparar una jeringa de 10 mL llenada de BCM y montar con una aguja de 25 G.
   2. Un útero a la vez, les quite el plato de sujeción de BCM, seque en un paño para quitar el exceso de sangre y coloque en un plato de 60 mm con un aumento bajo microscopio de disección.
   3. Sujetando con cuidado y suavemente del útero justo por debajo del extremo distal (cerca del oviducto) con pinzas de disección, inserte la aguja en el centro del útero en como paralelo un plano como sea posible. Insertar la aguja más allá de las puntas de las pinzas.
   4. Aplicar presión a las pinzas para sujetar el útero a la aguja y expulsar aproximadamente 1 mL de BCM a través del cuerno del útero.
      Nota: Debe tenerse cuidado en este paso, ya que demasiada presión sobre la jeringa causará un flujo incontrolable de los medios de comunicación, a menudo dejando el plato.
   5. Después del lavado del útero, útero entero hasta 5 por plato 60 mm, vuelva a colocar el plato en la incubadora hasta la colección.
3. Colección de embriones
   1. Utilizando una pipeta de cristal dibujado de la mano y un aparato de pipetas de boca, recoger blastocistos en un ámbito de disección, entre 25 X y 35 X. (Figura 1).
      Nota: Aparato de pipetas de boca consta de 30-40 cm de tubería flexible, menores de 5 mm de diámetro interior Inserte un 1 000 μl Punta de pipeta, punto primero en un extremo y colocar la pipeta de vidrio en él. Agregar un filtro de jeringa en el otro extremo, con un atado 1 cc jeringa barril, sin émbolo, a actuar como una pieza de la boca.
   2. Eliminar platos de la incubadora y usando un patrón cuadriculado, examinaron cada parte del plato para embriones. Embriones se recogen hasta individualmente y coloque sobre la gota de BCM en un plato secundario.
   3. Después de recoger de todos los platos, lavar los embriones una vez más en una gota de dulce BCM y luego colocar en el plato bien 4 a la espera de la inyección.

4. embrión inyección

1. Recoger células madre embrionarias individualmente con la aguja de inyección basada en la confirmación.
   1. Preparar un plato de inyección mediante la adición de 5-7 mL de medio de inyección (DMEM, 10% FBS y 20 mM HEPES) a un plato de inyección de fondo de cristal. Las inyecciones se realizan a temperatura ambiente.
   2. Uso microinyector aire o aceite, aplique vacío a la aguja para extraer células madre embrionarias. Tenga cuidado de mantener como poco espacio como sea posible entre las células. Cuentan las células ES aquí o en la etapa de inyección.
   3. Seleccione las celdas ES que son de mediano a pequeño tamaño en comparación con la población en general de las células, con una superficie lisa y sin defectos obvios como las vacuolas.
      Nota: Poblaciones celulares ES varían mucho en calidad morfológica, y las normas utilizadas tendrán que ajustar con ellos.
2. Inyectar los embriones con aproximadamente 15 células madre embrionarias (figura 1).
   1. Colocar una pipeta de sujeción punta un microinyector segundo de aire y coloque un embrión cerca de la abertura del titular. Se aplica vacío para sujetar el embrión al titular.
   2. Ajuste para el eje z moviendo la pipeta holding hacia arriba o hacia abajo para que el embrión apenas toca la diapositiva, seguida de concentración de la multa en la zona. A continuación, ajuste el eje Z de la aguja de inyección para que células madre embrionarias cerca de la punta están en foco.
   3. Ajuste el embrión ahora empujando suavemente de la aguja de inyección en la parte superior o inferior, girando para poner el ICM en la posición deseada.
   4. Inserte la aguja a través de la zona y el ICM o trofoblasto, usando una presión firme pero controlada. Aplicar una ligera presión a la microinyectora de la aguja de inyección para ayudar a mantener el blastocoel de derrumbarse.
   5. Una vez que la aguja ha penetrado el blastocoel, aplicar presión de la microinyectora para transferir células madre embrionarias para el blastocoel del embrión. PAUSE brevemente como el bisel de la aguja empieza a salir el embrión para permitir la presión en el embrión para volver a la normalidad, al tiempo que conserva las células.
      Nota: Referencia grupo células madre embrionarias fueron inyectados normalmente, siguiendo un tradicional ES la célula de inyección protocolo⁹, teniendo cuidado de no para tocar el ICM. También se inyectaron células madre embrionarias a través del ICM, empuja la aguja directamente a través de la ICM (TICM) (figura 2película suplementario).

5. transferencia de eEmbryos

1. Transferencia de embriones de ratones Swiss Webster en E2.5, utilizando un dispositivo de transferencia embrionaria no quirúrgica, por procedimientos de fabricación. Este procedimiento no quirúrgico no requiere anestesia ni cuidados especiales después de la operación. Ratones de la casa individualmente después de la transferencia de embriones y a través de la entrega y posterior al destete.

Resultados

Tratamiento de la línea celular como el efecto aleatorio, un modelo lineal de efectos mixtos se utilizó para analizar los datos en el software (e.g. SAS (versión 9.2)). Cada análisis para el número de embriones transferidos y la línea celular. El segundo análisis también controlado por el número de cachorros que sobrevivieron.

Para este estudio, cada línea ES celular y el clon fue inyectado con tradicionales y técnica...

Discusión

Durante mucho tiempo se ha pensado que cualquier disturbio del ICM podría conducir a la mortalidad, de hecho, los protocolos actuales de microinyección blastocisto todavía advierten de esta^12,13. Lo que hemos mostrado aquí es la microinyección a través de la RIC no es perjudicial para el embrión y aumenta la producción de quimeras.

El mecanismo exacto de este efecto no ha sido identificado. Sin embargo, la interrupción mecáni...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ES Cell injection needle	Humagen	MSC-20-0
NSET device	Paratechs	60010
DMEM	Gibco (life technologies)	11965-092
FBS	Gibco (life technologies)	10439-024	lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES	Sigma	H0887
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Micro manipulator	Leica	Micro manipulator
micro injector	Eppendorf AG	Cell Tram Air 5176
Microscope	Leica	DM IRB
4 well dish	Thermo Scientific	176740
60 mm dish	Sarstedt	83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J	Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA	000058
Swiss Webster mice	Taconic, USA	Tac:SW
Injection Dish	MatTek Corp.	P50G-0-30-F