תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להגביר את ייצור כמירה ללא השימוש של ציוד חדש. שינוי כיוון פשוטה של העובר להזרקה ניתן להגדיל את מספר העוברים המיוצר, להפחית באופן פוטנציאלי את ציר הזמן germline שידור.

Abstract

במאמץ להגדיל את יעילות ביצירת עכברים מהונדסים באמצעות מתודולוגיות ES תא, אנו מציגים עיבוד בפרוטוקול הנוכחי של הזרקת הבלסטוציסט. כאן אנחנו מדווחים כי סיבוב פשוט של העובר, וכן הזרקה דרך טראנס-הפנימית תא בנפח גדול (TICM) גדל אחוז עכברים chimeric מ 31% ל- 50%, עם אין ציוד נוסף או יותר התמחה הדרכה. 26 שונים מוכלאים שיבוטים, שיבוטים הכולל 35 הוזרקו על פני תקופה של 9 חודשים. היה הבדל משמעותי ההריונות או קצב ההחלמה של העוברים בין טכניקות מסורתיות הזרקת TICM. לכן, ללא שינוי כלשהו העיקריים בתהליך הזרקה, מיצוב פשוטה של הבלסטוציסט ואת הזרקת דרך ICM, משחררים את התאים ES לתוך חלל blastocoel יכולים פוטנציאל לשפר את הכמות של ייצור chimeric ובעקבות germline שידור.

Introduction

במשך קרוב ל-25 שנים, הקמת יישוב גנטית עכברים כבר תהליך איטי, לעיתים קרובות הקשו על ידי צוואר בקבוק בשלב microinjection תא blastocysts ES לדור של germline משדר כימרות. הפיתוחים האחרונים, כולל^1,CRISPR/Cas9² פילוח תאים ES, תפוקה גבוהה ES תא דור מהמגזר כמו komp ב, השתפרו הדור/הזמינות של תאים ES מהונדסים. עם זאת, הדור של germline כימרות נשאר צוואר בקבוק ביצירת עכברים מהונדסים אלה ES תאים^3,4. תפוקה גבוהה ES תא דור פרויקטים שייסרו על ידי השתנות גבוהה באיכות תא ES, אשר הוא קריטי עבור יצירה מוצלחת של germline כימרות. בנוסף, חלק מהשורות תא ES שימוש בדרך כלל ידועים הגבוהה אנאפלואידיה וייצור קשה germline כימרות המוסמכת⁵.

פותחו שיטות רבות ליצירת עכברים עם גם שימרה גבוה יותר, או לגמרי ES תא נגזר עכברים^6,7,8,9,10. בעוד כל אחת ממערכות אלה יש את היתרונות שלה, יש להם גם החסרונות. הדור של tetraploid היו בעת יצירת תאים ES 100% נגזר עכברים, הוא לא יעיל, מוגבל בדרך כלל קווים outbred ^5,6. שיטות חדשות של הזרקת morula יכול להניב כימרות אחוז גבוה, מתקרב 100%, אבל בדרך כלל דורשים ציוד נוסף משמעותי (לייזרים או piezos) ואימונים^10,11. במעבדות איפה טכניקות אלה שכבר נמצאים במקום, מתודולוגיה חדשה זו ייתכן שלא יהיה צורך.

המטרה של מחקר זה היתה למצוא שיטה המשתמשת טכניקות נפוצות וציוד זמינים כדי להגביר את הקצב של כמירה הדור, ומגדילים את הסיכוי germline שידור של אלל mutant להקים את המושבה העכבר עוקבות.

Protocol

כל הפעולות נעשו כחלק מההתנהלות הרגילה של המתקן NIEHS לדפוק את העכבר הליבה. כל העכברים הוחזקו 12:12 מחזור אור h: כהה, היו להאכיל דיאטה של NIH-31 ומים ad libitum. כל הניסויים בוצעו בהתאם החיה אכפת והוועדה שימוש של נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה.

1. הכנה בעלי חיים

1. מתרבים התורם עכברים, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J עכברים נקבה בגיל 8-10 שבועות של הגיל באופן טבעי כדי B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J עכברים גברים בין גיל 8 ו- 26 שבועות. בדוק תקעים חזותית למחרת בבוקר (E0.5).
2. גזע עכברים הנמען, וובסטר שוויצרי עכברים הנשי בין גיל 6 ו 9 שבועות שנבחרים באופן טבעי עיקור עכברים זכרים וובסטר שוויצרי. בדוק תקעים חזותית למחרת בבוקר (E0.5).

2. ES תא הכנה

1. עבור תאים AB2.2 ES 129-derieved, התרבות תאים DMEM בתוספת 15% FBS, 1% גלוטמין, 1% פן/דלקת ו- 0.1% β-mercaptoethanol. תרבות כל התאים האחרים ES לפי ההוראות של ES תא הספק, באמצעות פרוטוקולים המומלצת שלהם.

3. העובר אוסף

1. דיסקציה בעלי חיים
   1. להכין מספר מאכלים 60 מ מ, כ 1 לכל 5 עכברים כולל תוספת 3, עם 10 מ"ל הפיצוץ אוסף המדיה (BCM) (10% FBS IN DMEM)., 4. ובכן מגישים עם 0.5 mL BCM לכל טוב. Equilibrate ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   2. המתת חסד B6 (Cg)-Tyr < c-2J > עכברים הנשי /J ב E3.5 באמצעות חנק₂ CO, עם קצב זרימה של 10%.
   3. לאחר המתות חסד, במקום העכברים במצב פרקדן, להרטיב את הבטן ביסודיות עם 70% אתנול.
   4. עשו את החתך הראשון דרך העור בלבד, אל נקודת האמצע של הבטן, ביצוע פתיחת רחבה ככל האפשר. לאחר מכן פתח דרך דופן הבטן, שוב עושה את החתך רחבה ככל האפשר.
      הערה: עושה את זה בשני שלבים מסייע להפחית או למנוע זיהום פרווה.
   5. החל מ- שחלה, והחזקת כרית השומן של השחלה עם מלקחיים בוטה, בזהירות להסיר את השחלה, oviduct, הרחם, לוקח טיפול נוסף כדי לשמור את רקמת שומן עד למינימום. הסר את הרחם כמקשה אחת, או כמו קרניים בודדים, ללא כל שינוי בהליך הבא.
   6. לאחר ההסרה, מקום הרחם תבשיל 60 מ מ המכיל הפיצוץ אוסף המדיה.
2. הסרת העובר
   1. להכין מזרק 10 מ"ל מלא BCM, ובכושר עם מחט 25 גרם.
   2. הרחם אחד בכל פעם, להסיר אותם מן המנה החזקה של BCM, למחוק אותם על טישו כדי להסיר את עודף דם, ומניחים בקערה 60 מ מ מתחת הגדלה נמוכה לנתח מיקרוסקופ.
   3. והחזקת בעדינות ובזהירות את הרחם מתחת הקצה הדיסטלי (ליד oviduct) עם מלקחיים לנתח, להוסיף את המחט אל המרכז של הרחם, במקביל מטוס ככל האפשר. הכנס את המחט מעבר קצות המלקחיים.
   4. ללחוץ כדי המלקחיים להחזיק את הרחם על המחט, לגרש כ- 1 מ ל BCM דרך הקרן של הרחם.
      הערה: יש לנקוט בשלב זה, כמו לחץ רב מדי על המזרק יגרום זרם בלתי נשלט של מדיה, לעיתים קרובות עוזב את המנה.
   5. לאחר ריקון הרחם, uteri כל עד 5 לכל צלחת 60 מ מ, מניחים את המנה חזרה בחממה עד אוסף.
3. אוסף העובר
   1. באמצעות פיפטה מזכוכית מצוירת על יד מנגנון פיפטה בפה, לאסוף את blastocysts תחת טווח ויבתר, הניצב בין 25 X 35 X. (איור 1).
      הערה: הפה פיפטה מנגנון מורכב של 30-40 ס מ, צינורות גמישים, מתחת לגיל 5 מ"מ זהות להוסיף 1, 000 µL פיפטה עצה, בשלב הראשון בקצה אחד, ולהצמיד את פיפטה מזכוכית בתוכו. להוסיף מסנן מזרק הקצה השני, עם צמוד 1 cc מזרק החבית, לא בוכנה, להתנהג כמו חתיכה הפה.
   2. הסרת מנות החממה, באמצעות תבנית רשת, לבחון כל חלק המנה עבור עוברי. עוברי נאספות למעלה בנפרד ומניחים על ירידת BCM בקערה משנית.
   3. לאחר איסוף כל המנות, לשטוף את העוברים פעם נוספת בטיפה של BCM טריים, ולאחר מכן מקם בצלחת טוב 4 להמתין הזרקה.

4. העובר הזרקה

1. לאסוף תאים ES בנפרד עם מחט ההזרקה המבוסס על אישור.
   1. להכין צלחת הזרקת על-ידי הוספת 5-7 מ של הזרקת מדיה (DMEM, 10% FBS ו 20 מ מ HEPES) על צלחת זכוכית הזרקת התחתון. זריקות נעשים בטמפרטורת החדר.
   2. שימוש microinjector אוויר או שמן, להחיל ואקום המחט הזרקת כדי למשוך תאים ES. לטפל כדי לשמור, על שטח קטן ככל האפשר בין תאים. לספור את התאים ES כאן, או בשלב ההזרקה.
   3. בחר תאים ES שהם בינוניים עד קטנים בגודלם בהשוואה לאוכלוסייה הכללית של תאים, עם משטח חלק, וללא פגמים ברור כגון וקואלות.
      הערה: אוכלוסיות תאים ES להשתנות במידה רבה באיכות מורפולוגי, הסטנדרטים בשימוש יהיה צורך להתאים איתם.
2. להזריק העוברים עם תאים ES כ 15 (איור 1).
   1. לצרף פיפטה החזקה של עצה כדי microinjector השני אוויר, והצב העובר ליד הפתח של בעל. החל ואקום כדי לאבטח את העובר עם בעלי.
   2. להתאים עבור ציר z באמצעות הזזת פיפטה החזקה של למעלה או למטה כך העובר רק נוגע השקופית, ואחריו בסדר התמקדות סונה. לאחר מכן, להתאים ציר Z של המחט הזרקת כך ES תאים ליד הקצה הם בפוקוס.
   3. להתאים את העובר כעת על ידי דחיפת בעדינות מן המחט הזרקת בחלק העליון או התחתון, סיבוב זה כדי לשים את ICM במיקום הרצוי.
   4. הכנס את המחט הזרקה של סונה, את ICM או trophoblast, באמצעות דחיפה חזקה אבל מבוקרת. חלות לחץ קל microinjector של המחט הזרקת כדי לסייע למנוע את blastocoel קורסת.
   5. ברגע שהמחט שחדר את blastocoel, הפעילו לחץ מ microinjector כדי להעביר תאים ES blastocoel של העובר. השהה בקצרה כמו שפוע של המחט מתחיל לצאת העובר כדי לאפשר את הלחץ בתוך העובר יחזור לקדמותו, תוך שמירה על התאים.
      הערה: תאים ES קבוצת התייחסות הוזרקו בדרך כלל, בעקבות ES המסורתי של תא הזרקת פרוטוקול⁹, מטפל לא לגעת את ICM. תאים ES הוזרקו גם באמצעות ICM, דוחף את המחט ישירות דרך ICM (TICM) (איור 2הסרט משלים).

5. העברת eEmbryos

1. העברת העוברים וובסטר שוויצרי עכברים-E2.5, באמצעות התקן העברה ניתוחי העובר, לפי נהלי ייצור. הליך כירורגי זה מחייב ללא הרדמה או טיפול מיוחד לאחר הניתוח. עכברים בבית בנפרד לאחר המעבר של העוברים, וכן באמצעות משלוח הגמילה עוקבות.

תוצאות

מודל לינארי אפקטים מעורבים בטיפול קו תא כאפקט אקראי, שימש כדי לנתח את הנתונים התוכנה (למשל SAS (גרסה 9.2)). כל ניתוח מבוקר על המספר של עוברי העבירה לבין הקו הסלולרי. הניתוח השני מבוקר גם עבור מספר הגורים ששרדו.

במחקר זה, כל שורת ES התאים ולשכפל הו...

Discussion

זה זמן רב כבר חשבה כי כל הפרעה של ICM יכול להוביל התמותה, למעשה, הנוכחי הבלסטוציסט microinjection פרוטוקולים עדיין מזהירים זה^12,13. מה שהראתי כאן זה microinjection דרך ICM אינה פוגעת העובר, והיא מגדילה את היבול של כימרות.

המנגנון המדויק בשביל האפקט הזה לא זוהתה. ע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ES Cell injection needle	Humagen	MSC-20-0
NSET device	Paratechs	60010
DMEM	Gibco (life technologies)	11965-092
FBS	Gibco (life technologies)	10439-024	lots should be individually tested for ES Cell compatibility.
HEPES	Sigma	H0887
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
Micro manipulator	Leica	Micro manipulator
micro injector	Eppendorf AG	Cell Tram Air 5176
Microscope	Leica	DM IRB
4 well dish	Thermo Scientific	176740
60 mm dish	Sarstedt	83.3901
B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J	Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA	000058
Swiss Webster mice	Taconic, USA	Tac:SW
Injection Dish	MatTek Corp.	P50G-0-30-F