Reintegro de la búsqueda de drogas en ratones utilizando el paradigma de preferencia condicionada del lugar

Resumen

Este protocolo describe la preferencia de lugar condicionada (CPP) como un modelo de recaída. Este procedimiento permite la medición de la recaída en animales de laboratorio, considerando el impacto de señales ambientales asociada a drogas como ansias y recaída en absteniéndose de adictos es actualmente el foco de los programas de tratamiento de abuso de drogas.

Resumen

El presente Protocolo describe la preferencia de lugar condicionada (CPP) como un modelo de recaída en la adicción a las drogas. En este modelo, animales primero se entrenan para adquirir una preferencia de lugar condicionada en un compartimiento junto a drogas, y después de la prueba post acondicionado, realizan varias sesiones para extinguir la preferencia establecida. El CPP permite la evaluación de los efectos gratificantes condicionadas de señales ambientales relacionados con las drogas. Entonces, el CPP extinguido puede ser reintegrado enérgicamente por la administración no contingente de una dosis de cebado de la droga y por la exposición a estímulos estresantes. Ambos métodos se explicará aquí. Cuando el animal reinicie la respuesta conductual, un reintegro de la recompensa condicionada se considera que han tenido lugar.

Las principales ventajas de este protocolo están que es no invasivo, barato y sencillo con criterios de buena validez. Además, permite el estudio de diferentes manipulaciones ambientales, como el estrés o la dieta, que puede modular la recaída en drogas que buscan comportamientos. Sin embargo, una limitación es que si el investigador pretende explorar la motivación y efectos de refuerzo primarios de la droga, debe ser complementado con procedimientos de autoadministración, que implican respuestas operante de los animales.

Introducción

El paradigma de la preferencia de lugar condicionada (CPP) ofrece una forma simple de evaluar la recompensa condicionada inducida por diversos estímulos^1,2y se ha utilizado ampliamente para el estudio de los efectos gratificantes condicionados de drogas adictivas³ . Se basa en acondicionamiento pavloviano, evaluar el valor motivacional de señales ambientales asociada a drogas para mantener el comportamiento adictivo⁴. En este modelo, señales ambientales adquieren propiedades secundarias apetitivo (efectos gratificantes acondicionados) cuando se combina con un reforzador primario³. Por ejemplo, un lugar inicialmente neutro (como el color de un compartimiento en la jaula CPP) se empareja con los efectos específicos de una droga de abuso durante algunos acondicionado sesiones⁵, mientras que el otro compartimiento se asocia con la inyección de un vehículo. Después acondicionado, si el animal pasa más tiempo en el compartimiento previamente asociado con la droga, se supone que el CPP ha desarrollado³. El establecimiento de la preferencia se logra cuando el animal da un valor positivo a las señales ambientales vinculadas a la droga, que es el reforzador primario. Por lo tanto, animales realizará respuestas conductuales que buscan droga en respuesta a las claves contextuales⁶. El modelo CPP permite la evaluación de las propiedades gratificantes de dosis subliminal de la droga, mostrando animales en una condición específica (por ejemplo, haber sufrido previamente de derrota social) sean más vulnerables y sensibles a las dosis que son no eficaz en ingenuos animales⁷.

El modelo CPP también ha sido utilizado para evaluar extinción/reintegro como modelo animal para el estudio de recidiva³, que es el objetivo del presente Protocolo. Hay tres diferentes fases: adquisición, extinción y restitución (figura 1). En el modelo de reintegración de CPP, animales primero adquieran el CPP para un compartimiento asociado de drogas, y luego realizan varias sesiones de extinción. Definimos la extinción como el momento en que el animal reduce sus respuestas conductuales de la aproximación a un estímulo condicionado de gratificante que ha sido eliminado (por ejemplo, la droga)⁸. Durante las sesiones de extinción, animales exploran los compartimientos en la ausencia de la droga, por lo que la preferencia adquirida es gradualmente atenuado⁹. Un tema importante a considerar es que el cambio de comportamiento que exhibe el animal en extinción (la disminución progresiva en el tiempo pasado en el compartimiento asociado de drogas) puede ser debido a nuevos procesos de aprendizaje que compiten con la anterior respuesta aprendida, o debido a una disminución en el estado motivacional interno del tema³. Por último, el restablecimiento de la preferencia de lugar a través de las claves de contexto o de la droga sería nuestro modelo de reintegro¹.

Administrar una inyección de cebado de la droga asociada puede restablecer la preferencia, que se considera un reestablecimiento de la aproximación a las claves contextuales. Reintegro de cebado de drogas ocurre debido a la persistente memoria de los efectos placenteros de la droga, que inducido por antojo y motiva a los animales a buscar las señales ambientales relacionadas con la recompensa.

Algunas ventajas del modelo de reincorporación de CPP son que el procedimiento es no invasivo (en contraste con administración propia, que requiera cirugía), barato y simple. Además, este modelo tiene una validez de buen criterio, que imita bien a lo que ocurre en los seres humanos^10,11, inducción de reintegro con los estímulos que inducen a la recaída, como exposición a las drogas^12,13 o estrés¹⁴.

Hay otras técnicas como la extinción – modelo de reincorporación de autoadministración intravenosa. Aquí, animales presionar una palanca de autoadministrarse la droga, que permite la evaluación de la respuesta operante el animal, la compulsión y la motivación^14,15,16. La principal ventaja de la CPP sobre procedimientos de autoadministración es que reintegro de CPP se considera que refleja la reactivación del valor del incentivo motivacional de los estímulos del contexto junto con la droga, consistente en la reaparición del enfoque comportamiento al contexto¹⁷. Por otra parte, estímulos no farmacológicos, como el estrés, también pueden inducir la reincorporación de^18,19. Por ejemplo, un estudio de la administración propia había descrito ningún efecto sobre el reintegro de la ingesta de heroína en ratas después de un choque de pie o retención estrés²⁰. Autores discuten que era fracasado porque los estresores fueron probados fuera de la cámara de administración propia en un contexto diferente. En cambio, cuando se utiliza el modelo CPP de reintegro, hubo un claro establecimiento de CPP inducida por morfina después de usar los mismos estresores y aplicado en un contexto diferente a la del CPP y en diferentes momentos (0 y 15 min después de la exposición de estrés)¹⁸ .

Varios estudios en la literatura han mostrado formas diferentes de fármacos y reintegro inducida por estrés. Por un lado, se ha divulgado reintegro droga-inducida en ratas y ratones utilizando morfina^5,21,22,23, cocaína^24,25, anfetamina^{26, 27}, etanol^28,29y³⁰de 3, 4-metilenedioximetanfetamina (MDMA). Por otro lado, la exposición al estrés puede ser un factor determinante en la vulnerabilidad al abuso de drogas. El estrés es conocido por aumentar los efectos gratificantes de drogas^7,31,32 y su papel en recaída es bien establecido^33,34. Por ejemplo, derrota en las interacciones sociales con un coespecíficos reinstala la morfina y la cocaína CPP^18,19. Además, animales expuestos a repetir derrota social son más vulnerables a los efectos gratificantes condicionados de subliminal dosis de cocaína y restablecer la preferencia con dosis muy bajas de cocaína⁷.

Aplicación del modelo de reincorporación de CPP es una manera útil y sensible para evaluar la vulnerabilidad a la recaída en los animales y permite la evaluación de diferentes manipulaciones ambientales sutiles, que son los principales disparadores que amenazan recaída humana, tales como reinstalación de Medicamentoso o estrés.

Protocolo

Todos los procedimientos que implica su cuidado y ratones el cumplimiento de las leyes nacionales, regionales y locales y regulaciones, que están de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo de 22 de septiembre de 2010 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos. El uso de animales y el Comité de atención de la Universidad de Valencia aprobaron el presente Protocolo.

1. materiales y configuración de preferencia de lugar condicionada:

1. Manejar ratones 3 días antes de la prueba de 1-2 minutos cada uno. La base de la cola debe ser comprendida. El cuerpo debe estar apoyado si es posible. Esto se hace para minimizar el dolor y el malestar al manipular un animal y para evitar que las variables que interfieren, tales como estrés.
   Nota: De ratones machos 1 60 días de edad (adultos jóvenes) con 35-40 g de peso se emplearon en los presentes experimentos. Puede realizar reintegro droga-inducida en ratones de ambos sexos. Sin embargo, sobre reintegro de inducida por el estrés, el paradigma social derrota está diseñado sólo para roedores machos, como hembras no inducen una respuesta agresiva en los ratones residente.
2. Para el acondicionamiento del lugar, utilice cajas idénticas hechas con dos compartimientos idénticos (30,7 cm largo 31,5 cm ancho × alto 34,5 cm) separados por un área gris central más pequeño (13,8 largo 31,5 cm ancho × 34,5 alto).
   Nota: Los compartimientos tienen piso diferentes texturas y colores de la pared (un piso liso en el compartimiento negro y un suelo áspero en el blanco). Cada compartimiento de la caja CPP contiene cuatro haces de luz infrarrojas y seis en el compartimento central. Esto permite la grabación de los cruces entre compartimentos y la posición del animal.
3. Situado encima de las luces de la habitación (apagadas o bajadas) cada día. Usar luces rojas (recomendadas), como los animales no lo perciben y se atenúa por el experimentador (aproximadamente 40 lux medido a 1 m sobre el nivel del piso).
4. Configurar el programa para registrar a 15 min de acondicionamiento pre y post prueba (véase la Tabla de materiales para software) (figura 2)
5. Preparar la solución de cocaína necesaria para el experimento entero. Disolver el clorhidrato de cocaína en 0.9% NaCl (solución salina) en un volumen de 0,1 mL/10 g de peso corporal. Mezcla de vórtice y conservar a 4 ° C al final del día.
   Nota: Las concentraciones de cocaína pueden variar dependiendo del propósito del estudio. Si el objetivo es evaluar las dosis subliminal de la cocaína, podría usarse una concentración de 1 mg/kg, que es ineficaz en los animales de control, como se ha visto en anteriores estudios^24,35. Si una dosis efectiva es el propósito, una concentración de 6 mg/kg puede ser elegido, que es efectiva pero no induce reintegro²⁴, o una concentración de 25 mg/kg, que es eficaz e induce la reinstalación de preferencia¹⁹.
6. Los animales de prueba durante la fase oscura y utilice la misma caja para cada animal en días.
7. Traer animales todos los días a la sala de pruebas en sus jaulas hogar y dejarlos inalterados durante 15 min como un periodo de habituación a todos los sonidos relacionados con la prueba.

2. prueba

1. Adquisición
   Nota: El procedimiento del lugar acondicionado, imparcial en cuanto a la preferencia espontánea inicial, consta de tres etapas: acondicionamiento previo, acondicionamiento y condicionamiento posterior (figura 1).
   1. Acondicionamiento previo (Pre-C) (3 días) (figura 2, figura 3, figura 4)
      Nota: Aquí se evalúa el valor neutro de los compartimientos en el cuadro de CPP. Medir el tiempo empleado en cada compartimiento y después compararlo con el pasó en el mismo compartimiento en la prueba post acondicionado.
      1. Llevar los animales a la sala de ensayo y dejar habituado durante 15 minutos.
      2. Compruebe que las guillotinas se quitan de la jaula.
      3. Configurar la computadora y el programa. Introduzca animales ID y pulse el "Juicio" y "Start" comando (figura 2).
      4. Coloque el ratón suavemente en la cámara intermedia (compartimiento gris) y dejar el cuarto de prueba con mínimo ruido.
      5. Poner todos los animales en sus jaulas hogar y guardar los datos cuando se termine el juicio.
      6. Permiten ratones a ambos compartimientos del aparato durante 15 minutos (900 s) por día durante 3 días consecutivos.
      7. El día 3, anote el tiempo empleado en cada compartimento durante un período de s 900 y guárdelo para la asignación de compartimientos en la siguiente fase (figura 3).
      8. Asignar la mitad de los animales en cada grupo para recibir el medicamento o el vehículo en un compartimiento (por ejemplo, negro) y la otra mitad en el otro compartimiento (por ejemplo, blanco) (figura 4).
         Nota: La distribución final de los animales debe asegurarse de que la mitad de los animales se asignan en el compartimiento inicialmente preferido y la otra mitad del compartimiento no-preferidas. Además, la mitad de los animales recibió la droga en un compartimiento (por ejemplo, el uno negro) y la otra mitad en el otro (en este caso, el uno blanco).
      9. Cuentas de balance en el grupo en ambos compartimientos, así como a través de grupos (prueba de diferencias de grupos con un análisis de varianza (ANOVA)). Como guía aproximada, los valores deben ser alrededor de 360-370 s en la prueba Pre-C (figura 4). Nota: no debe detectarse ninguna diferencia significativa entre el tiempo empleado en los compartimientos emparejado de droga y vehículo junto durante la prueba Pre-C.
      10. Excluir a los animales que presentan una fuerte aversión o preferencia de cualquier compartimiento. Considerar aversión como pasar menos tiempo que el 33% en el compartimiento y considerar la preferencia cuando el animal pasó más de un 67% del tiempo total en eso compartimiento.
   2. Acondicionado (4 días) (figura 5)
      1. Pesan los animales y estos pesos para dosis de cocaína durante el acondicionado.
      2. Preparar las jeringuillas con cocaína o solución salina basada en peso corporal.
      3. Inyectar un ratón a la vez por vía intraperitoneal (ip) e inmediatamente colóquelo suavemente en el compartimiento asignado de negro o blanco de su caja.
      4. Después de un intervalo de 4 h, inyectar la dosis de la droga inmediatamente antes de que el ratón se limita al compartimiento asociado de drogas por 30 min (figura 5).
      5. Alterne este procedimiento cada día, comenzando con la cocaína en los días 1 y 3 y solución salinos los días 2 y 4.
      6. Asegúrese de confinamiento se lleva a cabo en ambos casos por el cierre de la puerta de guillotina que separa los dos compartimientos, haciendo inaccesible la zona central.
         Nota: En esta fase, no hay para configurar el programa de PC.
   3. Acondicionado después (Post-C) (1 día)
      1. Llevar los animales a la sala de ensayo y dejar habituado durante 15 minutos.
      2. Retire la puerta de guillotina separa los dos compartimientos.
      3. Configurar la computadora y el programa. Introduzca animales ID y pulse el comando "start".
      4. Registrar el tiempo empleado por los ratones no tratados en cada compartimento durante un período de observación s 900.
      5. Cuando termine el juicio, recuperar todos los animales en sus jaulas hogar y guardar los datos.
      6. Consideran que la droga ha inducido a preferencia de lugar si el tiempo empleado en el compartimiento asociado de drogas durante el Post-C es significativamente mayor que en la prueba Pre-C. Si ocurre lo contrario, considere una aversión para el compartimiento asociado de drogas.
2. Extinción
   1. Realizar una sesión semanal de extinción en todos los grupos/animales que desarrollaron una preferencia por el compartimiento asociado de drogas.
   2. Coloque el animal en el aparato (sin guillotinas) durante 15 minutos (igual que las pruebas previas y Post-C) (figura 1).
      Nota: Si la dosis empleada en el CPP es alta (25 mg/kg), realizar 1 sesión de extinción por semana. Si una dosis subliminal es usado (1 mg/kg), luego realizar 2 sesiones de extinción por semana (por ejemplo el lunes y el jueves).
   3. Considerar la preferencia extinguida cuando los datos de la prueba de extinción no muestran diferencias significativas con respecto a la prueba de Pre-C, pero muestran diferencias con respecto a la prueba de Post-C.
   4. Repita la prueba de 24 h más tarde para confirmar la extinción.
3. Reintegro de CPP
   1. Reintegro de cebado-inducida
      1. Evaluar los efectos de una dosis de cebado de cocaína 24 h después de extinción ha sido confirmada.
         Nota: Dosis de cebado son mitad de la dosis anterior que ha recibido el animal durante el acondicionado. El mismo protocolo como en C Pre y Post-C pruebas somete a la prueba de reintegro, salvo que los animales reciban la dosis de cocaína en un no-contingente lugar 15 min antes del examen. Puede mejorarse la eficacia de cebado de drogas en la inducción de reintegro después de extinción/reintegro repetida experiencias de²³, aunque el orden de las dosis no parece jugar un papel en los resultados obtenidos³⁶.
      2. Llevar los animales a otra habitación de la sala de ensayo (lugar no contingentes) (figura 6).
      3. Inyectar con la mitad de la dosis anterior de la cocaína (por ejemplo, si los animales se acondicionaron con 25 mg/kg de cocaína, una dosis de cebado sería 12.5 mg/kg).
      4. Traer de vuelta a su vivero durante 15 minutos.
      5. Tenerlas en el cuarto de prueba y colocar los animales en el aparato inmediatamente (sin las puertas de guillotina separa los compartimientos) durante 15 minutos (igual que el pre- y Post-C pruebas).
      6. Considerar la diferencia en segundos entre el tiempo empleado en el compartimiento asociado de drogas durante la última sesión de extinción y la prueba de restablecimiento como una medida del grado de restablecimiento de la preferencia inducida por la droga.
      7. Repita el procedimiento de reintegro de extinción cada vez con la disminución de dosis hasta que se confirma para ser ineficaz.
         Nota: Un control de la inyección de solución salina puede utilizarse para controlar la capacidad de cebado de la cocaína (y no de la inyección de sí mismo) para inducir el reintegro.
   2. Reintegro inducida por estrés
      1. Evaluar los efectos de un reintegro de estrés 24 h después de extinción ha sido confirmada
         Nota: Pruebas de reposición son las mismas que las llevadas a cabo en el Post-C (deambulación libre durante 15 minutos), salvo que los animales son probados 15 min después de la derrota social en un agónico encuentro (figura 6)
      2. Llevar los animales a otra habitación de la sala de CPP.
      3. Coloque el ratón experimental con un agresivo sexo oponente comparable de igual edad y peso corporal en la jaula de plástico (figura 6).
         Nota: El agónico encuentro consiste en una prueba de 10 minutos en una jaula plástica transparente neutro (23x13.5x13cm) con un resultado de derrota para el ratón experimental. Para preparar al oponente agresivo, primero aislar diversos animales que coinciden en edad y peso corporal como los ratones experimentales durante 3 semanas. Entrenarlos para adquirir la experiencia de lucha y prueba de ellos para tener altos niveles de comportamiento agresivo territorial. Para obtener sus congéneres agresivos, ratones deben ser aislados por al menos 3 semanas y entonces entrenados en agresivo y atacar a comportamientos. Entrenan a los animales en un medio neutro, frente a ellos en pares. Dejamos que muerden los tiempos oponente 2 o 3 y sacarlos de la jaula, siempre terminando el entrenamiento antes de que uno de los dos ratones demuestra sumisión, para que la experiencia del encuentro refuerza el comportamiento agresivo. Después de sufrir la agresión (amenaza y ataque de coespecíficos agresivos), ratones experimentales presente evitar/huir y comportamiento defensivo/sumiso. El criterio es adoptar una postura concreta de la derrota, caracterizada por una posición sumisa, cojera patas delanteras, cabeza inclinada hacia arriba y orejas (figura 6) retractó. Según Burke et al., 2016, consideramos que el encuentro social se termina antes si el intruso muestra una sumisa postura supina para > 8 s o si ocurrieron 13 mordeduras de ataque. Otra opción a los animales de la pantalla sin riesgo de lesión significativa podría ser el animal en una caja de acoplamiento con un agujero, no lo suficientemente grande como para cualquier animal pasar el ritmo.  Agresión podría detectarse sin someter animales para dirigir el comportamiento agresivo.  Si un animal sostiene una lesión con una herida de 1cm de diámetro o exposición directa del músculo, se excluyeron del estudio y deben ser sacrificado.
      4. Después de 10 minutos de encuentro agonístico, tomar los ratones en el cuarto de prueba y colocar los animales en el aparato CPP inmediato (sin las puertas de guillotina separa los compartimientos) durante 15 minutos (igual que el pre- y Post-C pruebas).

3. estadístico análisis

Nota: Tamaño de la muestra Ideal debe tener un mínimo de 15 animales por grupo.

1. Analizar el tiempo medio pasado en el compartimiento asociado de drogas del grupo por medio de un ANOVA mixto con uno entre la variable tratamiento, con dos niveles (grupo Control, Grupo Experimental, ejemplo de dos grupos es en la figura 7 c) y en un plazo variable, días, con 2 niveles (C Pre y Post-C).
   Nota: En el grupo control, animales reciben la droga pero no tienen manipulaciones ambientales. Por otra parte, en el grupo experimental los animales están expuestos a diferentes condiciones ambientales. Comparar el tiempo pasado en el compartimiento asociado de drogas en el día Post-C con respecto al Pre-C prueba a ver si hay diferencias significativas en la sensibilidad a la droga.
2. Además, realizar análisis post-hoc de Bonferroni para comprobar cualquiera de los puntos importantes.
3. Analizar los datos relacionados con la extinción y restablecimiento de valores en los grupos que preferencia desarrollado mediante pruebas de t de Student´s para continuar con el procedimiento de reintegro de extinción durante el curso del experimento, pero en el momento final, analizarlas con un ANOVA con un plazo variable (días) con el número de niveles dependiendo de cada grupo.
   Nota: Cuando se incrementa el número de comparaciones, el número de los que será importante por casualidad también aumentó. Como tal, para evitar falsos positivos (errores de tipo 1) que 'corregir' el valor de p para la prueba más conservador con la corrección de Bonferroni de varias pruebas de t. Sin embargo, para el examen de reincorporación, la comparación debe hacerse entre el reintegro y la última prueba de extinción. Por lo tanto, no es necesario para la corrección.

Resultados

En primer lugar, resultados representativos de la reincorporación de inducida por el estrés y el cebado se muestran en la figura 7 con adultos ratones machos OF1.

Los datos en la figura 7a-b que representa el tiempo pasaron en el compartment(s) vinculado a drogas en el pre y Post-C prueba se analizaron con una medidas repetidas ANOVA con día variable...

Discusión

El punto clave de la investigación de la adicción a la droga es el desarrollo de tratamientos que disminuyen el deseo y, en consecuencia, reducir la vulnerabilidad a la recaída. Gracias al modelo de reposición del paradigma CPP, es posible estudiar la influencia de diversos factores ambientales y de procedimientos que modulan la recaída, que es una prioridad de investigación futura. Hay algunos puntos importantes a considerar, como el paradigma de la CPP es una prueba que es altamente sensible a factores ambientale...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MONPRE 2Z software	CIBERTEC S.A., Spain	N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area.	CIBERTEC S.A., Spain	N/A	The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride	Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain	N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain	Charles River, Barcelona Spain	N/A	Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014	Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain)		13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415			45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g