Rétablissement de la recherche de drogue chez les souris en utilisant le paradigme de préférence de Place conditionnée

Résumé

Ce protocole décrit la préférence de Place conditionnée (RPC) comme un modèle de rechute. Cette procédure permet de mesurer des rechutes chez les animaux de laboratoire, compte tenu de l’impact des signaux environnementaux associés aux drogues comme la soif et la rechute chez les toxicomanes abstentionnistes est actuellement la mise au point des programmes de traitement de toxicomanie.

Résumé

Le présent protocole décrit la préférence de Place conditionnée (RPC) comme un modèle de rechute en toxicomanie. Dans ce modèle, animaux est formés tout d’abord d’acquérir une préférence de place conditionnée dans un compartiment jumelé à la drogue, et après l’essai après le conditionnement, ils effectuent plusieurs séances pour éteindre la préférence établie. Le CPP permet l’évaluation des effets enrichissantes conditionnés des signaux liés à l’environnement de médicaments. Puis, le RPC éteint peut être réintégré fermement par l’administration non dépendant d’une dose d’amorçage de la drogue et par l’exposition à un stimulus stressant. Les deux méthodes seront expliqués ici. Lorsque l’animal reinitiates la réponse comportementale, une réintégration de la récompense conditionnée est considéré comme ayant eu lieu.

Les principaux avantages du présent protocole sont qu’il est non invasive, peu coûteux et simple avec les critères de validité bon. En outre, il permet l’étude des différentes manipulations environnementales, tels que le stress ou l’alimentation, qui peut moduler la rechute en médicament cherchant des comportements. Toutefois, une limitation est que si le chercheur a pour but d’explorer les motivations et les effets primaires de renfort de la drogue, il devrait être complété par des procédures de gestion autonome, car elles impliquent des réponses opérante des animaux.

Introduction

Le paradigme de la préférence de Place conditionnée (RPC) offre un moyen simple d’évaluer la récompense conditionnée induite par des stimuli divers^1,2et a été utilisé largement pour étudier les effets enrichissantes conditionnés de drogues toxicomanogènes³ . Elle est basée sur le conditionnement pavlovien, évaluation de la valeur motivationnelle des signaux environnementaux associés aux drogues pour le maintien de comportements toxicomanes⁴. Dans ce modèle, signaux environnementaux acquièrent propriétés appétence secondaires (effets enrichissantes conditionnés) lorsqu’il est associé avec un agent renforçateur primaire³. Par exemple, un lieu initialement neutre (par exemple la couleur d’un compartiment dans la cage du RPC) est jumelé avec les effets spécifiques d’une drogue d’abus au cours de certaines conditionnement séances⁵, alors qu’un autre compartiment est associée à l’injection d’un véhicule. Après conditionnement, si l’animal passe plus de temps dans le compartiment précédemment associé au médicament, il est supposé que le personnel du PPC a acquis³. La mise en place de la préférence est atteinte lorsque l’animal donne une valeur positive pour les signaux environnementaux liés à la drogue, qui est l’agent renforçateur primaire. Par conséquent, animaux se produiront des réponses comportementales de recherche de la drogue en réponse à ces indices contextuels⁶. Le modèle CPP permet l’évaluation des propriétés enrichissantes d’une dose de la drogue, indiquant si les animaux dans une condition spécifique (par exemple, ayant subi de défaite sociale précédemment) est plus vulnérables et sensibles aux doses qui sont pas efficace pour naïve animaux⁷.

Le modèle CPP a aussi servi à évaluer l’extinction/réintégration comme modèle animal pour étudier la rechute³, qui est le but du présent protocole. Il y a trois phases différentes : acquisition, extinction et la réintégration (Figure 1). Dans le modèle de rétablissement du RPC, animaux d’abord obtenir le RPC pour un compartiment jumelé à la drogue, et ensuite ils exécutent plusieurs séances d’extinction. Nous définissons d’extinction comme le moment où l’animal a réduit ses réactions comportementales de rapprochement à un stimulus conditionné d’enrichissant qui a été supprimé (par exemple, le médicament)⁸. Pendant les sessions de l’extinction, animaux explore les compartiments en l’absence de la drogue, de sorte que la préférence acquise est progressivement atténué⁹. Une question importante à considérer est que le changement de comportement que l’animal présente au cours de l’extinction (la diminution progressive du temps passé dans le compartiment de drogue-jumelé) peut être due à nouveaux processus d’apprentissage qui sont en concurrence avec la réponse précédente de savante, ou due à une diminution de l’état de motivation interne du sujet³. Enfin, le rétablissement de la préférence de place à travers les repères du contexte ou de la drogue serait notre modèle de rétablissement¹.

Administrer une injection d’amorçage du médicament associé peut rétablir la préférence, ce qui est considéré comme une reconstitution de l’approximation pour les indices contextuels. Rétablissement de drogue d’amorçage se produit en raison de la mémoire persistante des effets agréables de la drogue, ce qui induit la soif et motive les animaux à chercher les signaux environnementaux associés à la récompense.

Certains avantages du modèle de rétablissement du RPC sont que la procédure est non invasif (contrairement à l’administration autonome, nécessitant une intervention chirurgicale), peu coûteux et simple. En outre, ce modèle a une validité de critère bonne, car elle imite bien ce qui se passe dans les êtres humains^10,11, induisant la réintégration avec stimuli qui induisent la rechute, comme re-exposition à la drogue^12,13 ou souligner le¹⁴.

Il existe d’autres techniques telles que l’extinction – modèle de rétablissement de l’administration intraveineuse de self. Ici, les animaux appuyer sur un levier pour s’auto-administrer de la drogue, qui permet l’évaluation de la réponse opérante de l’animal, compulsivité et motivation^14,15,16. Le principal avantage du RPC sur les procédures d’administration autonome est que rétablissement du RPC est censé refléter la réactivation de la valeur d’encouragement-motivation des stimuli contexte associé à la drogue, consistant en la réapparition de l’approche comportement au contexte¹⁷. En outre, des stimuli non médicamenteux, tels que le stress, peuvent induire également rétablissement^18,19. Par exemple, une étude de l’auto-administration ne décrit aucun effet sur le rétablissement de la consommation d’héroïne chez les rats après un choc de pied ou de la retenue soulignent²⁰. Auteurs discuté qu’il a échoué parce que les facteurs de stress ont été testés à l’extérieur de la chambre d’auto-administration dans un contexte différent. En revanche, lorsque vous utilisez le modèle CPP de remise en état, il y avait un clair restitutio in integrum RPC induite par la morphine après avoir utilisé les mêmes facteurs de stress et appliquée dans un contexte différent à celui du PPC et à des moments différents (0 et 15 min après stress exposition)¹⁸ .

Plusieurs études dans la littérature ont montré différentes façons de drogue et réintégration induite par le stress. D’une part, réintégration médicamenteuse a été signalée chez des rats et des souris morphine^5,21,22,23, cocaïne^24,25, amphétamine^{26, 27}, éthanol^28,29et³⁰de la 3, 4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA). En revanche, l’exposition au stress peut être un facteur déterminant dans la vulnérabilité aux abus de drogues. Stress est connu pour augmenter les effets enrichissantes de drogues^7,31,32 et leur rôle dans la rechute est bien établie^33,34. Par exemple, la défaite dans les interactions sociales avec un congénère rétablit la morphine et la cocaïne RPC^18,19. En outre, les animaux exposés à répété défaite sociale sont plus vulnérables aux effets enrichissantes conditionnés d’une dose de cocaïne et rétablissement la préférence avec de très faibles doses de cocaïne⁷.

Application du modèle de rétablissement du RPC est un moyen utile et sensible pour évaluer la vulnérabilité de rechute chez les animaux et permet l’évaluation des différentes manipulations environnementales subtiles, qui sont les principaux déclencheurs qui menacent les humain rechute, tels que réintégration médicamenteuse ou stress.

Protocole

Toutes les procédures impliquant les souris et leurs soins respectées les lois nationales, régionales et locales et les règlements qui sont conformes à la Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés pour fins scientifiques. L’utilisation de l’Animal et le Comité de protection de l’Université de Valence a approuvé le présent protocole.

1. les matériaux et la mise en place de préférence de Place conditionnée :

1. Gérer les souris 3 jours avant le test pour 1-2 minutes chacun. La base de la queue doit être saisie. Le corps doit être soutenu si possible. Ceci est fait pour minimiser la douleur et la détresse lors de la manipulation d’un animal et éviter les variables parasites, tels que le stress.
   Remarque : Des souris mâles 1 60 jours (jeunes adultes) 35 à 40 grammes travaillaient dans ces expériences. Rétablissement de médicamenteuse peut être effectuée chez les souris des deux sexes. Toutefois, concernant la réintégration induite par le stress, le paradigme de la défaite sociale est conçu uniquement pour rongeurs mâles, comme le font les femelles n’induisent une réponse agressive chez les souris résidentes.
2. Pour le conditionnement de la place, utilisez boîtes identiques fabriqués avec deux compartiments identiques (30,7 cm de longueur x 31,5 cm large × 34,5 cm de haut), séparés par une zone d’ombre centrale (13,8 longueur x 31,5 cm large × 34,5 élevé) plus petite.
   Remarque : Les compartiments doivent plancher différentes textures et couleurs de la paroi (un plancher lisse dans le compartiment noir et un sol rugueux dans le blanc). Chaque compartiment de la boîte de CPP contient quatre faisceaux de lumière infrarouges et six dans le compartiment central. Cela permet l’enregistrement des passages entre compartiments et la position de l’animal.
3. La valeur vers le haut les lumières de la pièce (arrêt ou diminution) chaque jour. Utiliser les feux rouges (recommandés), car animaux ne perçoit pas il et il est atténué pour l’expérimentateur (environ 40 lux mesuré à 1 m au-dessus du niveau du plancher).
4. Mettre en place le programme s’inscrire 15 min pour un conditionnement pré et post test (voir la Table des matières pour les logiciels) (Figure 2)
5. Préparer la solution de cocaïne requise pour l’expérience entière. Dissoudre le chlorhydrate de cocaïne à 0,9 % NaCl (solution saline) dans un volume de 0,1 mL/10 g de poids corporel. Mélange de vortex et conserver à 4 ° C à la fin de la journée.
   NOTE : Des concentrations de cocaïne peuvent varier selon l’objectif de l’étude. Si le but est d’évaluer l’une doses de cocaïne, une concentration de 1 mg/kg peut être utilisée, qui est inefficace chez les animaux témoins, comme dans les précédentes études^24,35. Si une dose efficace est le but, une concentration de 6 mg/kg peut être choisie, ce qui est efficace, mais n’induit pas de rétablissement²⁴, ou une concentration de 25 mg/kg, ce qui est efficace et induit de rétablissement de la préférence¹⁹.
6. Les animaux de laboratoire au cours de leur période d’obscurité et utiliser de la même boîte pour chaque animal sur jours.
7. Apporter des animaux tous les jours à la salle d’examen dans leur maison et les laisser pendant 15 min comme une période d’accoutumance, à tous les bruits liées aux tests.

2. cycle d’essai

1. Acquisition
   Remarque : La procédure de Place conditionnée, impartiale en termes de préférence spontanée initiale, comprend trois phases : le préconditionnement, climatisation et après le conditionnement (Figure 1).
   1. Conditionnement préalable (Pre-C) (3 jours) (Figure 2, Figure 3, Figure 4)
      NOTE : Ici, la valeur neutre des compartiments dans la zone du RPC est évaluée. Mesurer le temps passé dans chaque compartiment et plus tard le comparer avec celui passé dans le même compartiment dans le test après le conditionnement.
      1. Amener les animaux à la salle d’essai et laissez-les habitués pendant 15 min.
      2. Vérifiez que les guillotines sont enlevés de la cage.
      3. Configurer l’ordinateur et le programme. Animal ID et appuyez sur la commande de « Procès » et « Start » (Figure 2).
      4. Placez la souris doucement dans la chambre intercalaire (compartiment gris) et quitter la salle d’examen avec le minimum de bruit.
      5. Ramener tous les animaux dans leur cage maison et enregistrer les données lorsque le procès est terminé.
      6. Autoriser les souris accéder aux deux compartiments de l’appareil pendant 15 minutes (900 s) par jour sur 3 jours consécutifs.
      7. Le jour 3, notez le temps passé dans chaque compartiment pendant 900 s et l’enregistrer pour l’affectation de compartiments dans la phase suivante (Figure 3).
      8. Attribuer la moitié des animaux dans chaque groupe pour recevoir le médicament ou le véhicule dans un compartiment (par exemple, noir) et l’autre moitié dans l’autre compartiment (p. ex., blanc) (Figure 4).
         Remarque : La distribution finale des animaux doit s’assurer que la moitié des animaux sont affectée dans le compartiment préféré au départ puis l’autre moitié au compartiment non préférés. En outre, la moitié des animaux ont reçu le médicament dans un compartiment (par exemple, l’un noir) et l’autre moitié dans l’autre (dans ce cas, l’un blanc).
      9. Solde des scores du groupe dans les deux compartiments ainsi qu’entre les groupes (différences de groupe test avec une analyse de variance (ANOVA)). Comme guide approximatif, les valeurs doivent être autour de 360-370 s lors du test de pré-C (Figure 4). Remarque : aucune différence significative devrait être détectée entre le temps passé dans les compartiments jumelés à la drogue et appariés véhicule pendant l’essai de pré-C.
      10. Exclure les animaux qui présentent une forte aversion ou la préférence pour un compartiment quelconque. Envisager l’aversion en passant moins de temps à 33 % dans le compartiment et envisager de préférence quand l’animal a passé plus de 67 % du temps total dans ce compartiment.
   2. (4 jours) de conditionnement (Figure 5)
      1. Peser les animaux et utiliser ces poids pour les doses de cocaïne au cours de la climatisation.
      2. Préparer les seringues avec cocaïne ou physiologique, basée sur le poids.
      3. Injecter une souris à la fois par voie intrapéritonéale (ip) et placez-le immédiatement doucement dans le compartiment noir ou blanc affecté de leur boîte.
      4. Après un intervalle de 4 h, injecter la dose de médicament immédiatement avant que la souris se limite au compartiment appariés drogue pendant 30 min (Figure 5).
      5. Alterner cette procédure chaque jour, commençant par la cocaïne aux jours 1 et 3 et salines les jours 2 et 4.
      6. Vérifiez que l’accouchement est effectué dans les deux cas en fermant la porte guillotine qui sépare les deux compartiments, rendant la zone centrale inaccessibles.
         Remarque : Dans cette phase, il n’y a pas besoin de mettre en place le programme PC.
   3. Après le conditionnement (Post-C) (1 jour)
      1. Amener les animaux à la salle d’essai et laissez-les habitués pendant 15 min.
      2. Enlever la porte guillotine qui sépare les deux compartiments.
      3. Configurer l’ordinateur et le programme. Animal ID et appuyez sur la commande « start ».
      4. Enregistrer le temps passé par les souris non traitées dans chaque compartiment pendant une période d’observation s 900.
      5. Une fois le procès terminé, ramener tous les animaux dans leur cage maison et enregistrer les données.
      6. Considérer que le médicament a provoqué préférence de place si le temps passé dans le compartiment de drogue-jumelé au cours de la Post-C est significativement plus élevé que dans le test de pré-C. Si le contraire se produit, pensez à une aversion pour le milieu de la drogue-jumelé.
2. Extinction
   1. Mener une séance hebdomadaire d’extinction chez tous les groupes/animaux qui ont développé une préférence pour le compartiment associé à la drogue.
   2. Placer l’animal dans l’appareil (sans guillotines) pendant 15 min (le même que les tests préalables- et Post-C) (Figure 1).
      Remarque : Si la dose employée dans le RPC est élevé (25 mg/kg), effectuer 1 extinction séance / semaine. Si une dose subthreshold est utilisé (1 mg/kg), puis effectuer 2 séances d’extinction par semaine (par exemple lundi et jeudi).
   3. Envisager la préférence éteinte lorsque les données de l’essai d’extinction ne montrent pas de différences en ce qui concerne le test de pré-C, mais elles montrent des différences en ce qui concerne le test Post-C.
   4. Refaites le test 24h plus tard afin de confirmer l’extinction.
3. Rétablissement de la RPC
   1. Induite par l’amorçage de réintégration
      1. Évaluer les effets d’une dose d’amorçage de cocaïne 24h après que extinction a été confirmée.
         Remarque : Des doses d’amorçage sont moitié de la dose précédente que l’animal a reçu au cours de la climatisation. Le test de rétablissement subit le même protocole que dans le pré-C et les tests Post-C, sauf que les animaux reçoit la dose de cocaïne dans un non-contingent placer 15 min avant l’essai. L’efficacité de l’amorçage de la drogue dans l’induction de rétablissement peut être renforcée après que extinction répétée/réintégration expériences²³, bien que l’ordre des doses ne semble pas jouer un rôle dans les résultats obtenus³⁶.
      2. Amener les animaux dans une pièce différente de la salle d’examen (lieu non conditionnelle) (Figure 6).
      3. Injecter avec la moitié de la dose précédente de cocaïne (par exemple, si les animaux était conditionnées avec 25 mg/kg de cocaïne, une dose d’amorçage serait 12,5 mg/kg).
      4. Ramener à leur vivarium pour 15 min.
      5. Prenez-les dans la salle d’examen et placer les animaux dans l’appareil immédiatement (sans les portes guillotine séparant les compartiments) pendant 15 min (identique à l’avant et les tests Post-C).
      6. Considérez la différence en secondes entre le temps passé dans le compartiment de drogue-jumelé au cours de la dernière session de l’Extinction et le test de réintégration comme une mesure du degré de rétablissement de la préférence induite par la drogue.
      7. Répétez la procédure d’extinction-rétablissement chaque fois avec la diminution des doses jusqu'à ce qu’il est confirmé pour être inefficaces.
         Remarque : Un contrôle de l’injection saline peut être utilisé pour contrôler la capacité d’amorçage de cocaïne (et non d’injection elle-même) pour induire la réintégration.
   2. Rétablissement d’induite par le stress
      1. Évaluer les effets d’un stress induit par le rétablissement 24h après que extinction a été confirmée
         Remarque : Les tests de rétablissement sont les mêmes que ceux effectués en Post-C (déambulation libre pendant 15 min), sauf que les animaux est testés 15 min après la défaite sociale dans un agoniste rencontre (Figure 6)
      2. Prendre les animaux dans une pièce différente de la salle de la RPC.
      3. Placez votre souris expérimentale avec un sexe adversaire agressif, assorti du même âge et du poids corporel dans la cage en plastique (Figure 6).
         Remarque : La rencontre agonistique se compose d’un test de 10 min dans une cage en plastique transparent neutre (23x13.5x13cm), avec un résultat de la défaite pour la souris expérimental. Pour préparer l’adversaire agressif, tout d’abord isoler les différents animaux qui correspondent en âge et du poids que les souris expérimentales pendant 3 semaines. Habituez-les à acquérir une expérience de combat et de les tester pour avoir des niveaux élevés d’un comportement territorial agressif. Pour obtenir leurs congénères agressifs, souris doivent être isolées pendant au moins 3 semaines et puis formés dans agressifs et attaquent les comportements. Animaux sont entraînés dans un environnement neutre, auxquels ils sont confrontés dans les paires. Nous les laisser mordre les fois adversaire 2 ou 3 et de les sortir de la cage, toujours se terminant la formation avant une des deux souris montre soumission, afin que l’expérience de la rencontre renforce le comportement agressif. Après avoir subi d’agression (menace et attaque le congénère agressif), souris expérimentales devraient présenter évitement/fuir et le comportement défensif/soumission. Le critère consiste à adopter une position spécifique de la défaite, caractérisée par une position verticale soumise, limp ses pattes, la tête inclinée vers le haut et rentré des oreilles (Figure 6). Selon Burke et al., 2016, nous considérons que la rencontre sociale se termine plus tôt si l’intrus affiche une posture couchée soumise pour > 8 s ou si 13 piqûres d’attaque s’est produite. Une autre option aux animaux d’écran sans risque de lésion significative pourrait être pour rythmer l’animal dans un boîtier de maille avec un trou, pas assez gros pour chaque animal de passer.  L’agression peut être décelée sans soumettre animaux pour diriger le comportement agressif.  Si un animal subit une blessure avec une plaie de 1cm de diamètre et/ou une exposition directe du muscle, il est exclu de l’étude et devrait être euthanasié.
      4. Après 10 min de rencontre agonistique, prendre les souris dans la salle d’examen et de placer les animaux dans l’appareil de PPC immédiatement (sans les portes guillotine séparant les compartiments) pendant 15 min (identique à l’avant et les tests Post-C).

3. analyse statistique

Remarque : La taille de l’échantillon idéal doit être un minimum de 15 animaux par groupe.

1. Analyser le temps moyen passé dans le compartiment de drogue-jumelé du groupe au moyen d’une ANOVA mixte avec un conflit entre variable, traitement, avec deux niveaux (groupe contrôle, groupe expérimental, exemple des deux groupes est en Figure 7 c) et l’autre au sein de la variable – jours, avec 2 niveaux (pré- et Post-C).
   Remarque : Dans le groupe témoin, animaux reçoit le médicament, mais il n’a aucune manipulations environnementales. En revanche, dans le groupe expérimental, les animaux sont exposés à des conditions environnementales différentes. Comparer le temps passé dans le compartiment de drogue-jumelé le jour Post-C avec respect le pré-C tester pour voir si il existe des différences significatives dans la sensibilité au médicament.
2. En outre, effectuer des analyses a posteriori Bonferroni pour vérifier ou l’autre des scores importants.
3. Analyser les données relies aux valeurs extinction et réintégration dans les groupes que développés de préférence au moyen de tests t Student´s de poursuivre la procédure d’extinction-rétablissement au cours de l’expérience, mais pour le moment final, analysez-la avec une analyse de la variance avec un intérieur variable (jours) avec le nombre de niveaux en fonction de chaque groupe.
   Remarque : Lorsque le nombre de comparaisons est augmenté, le nombre de ceux qui seront importantes par hasard également augmenté. Par conséquent, pour éviter d’avoir des faux positifs (erreurs de Type 1) nous « correct » la p-value, ce qui rend le test plus conservatrice avec la correction de Bonferroni pour t-tests multiples. Toutefois, pour l’essai de la réintégration, la comparaison convient entre le critère de la réintégration et la dernière extinction. Il n’y a donc pas besoin de correction.

Résultats

Tout d’abord, des résultats représentatifs de la réintégration d’amorçage induite et le stress sont illustrés Figure 7 à l’aide de souris mâles adultes de1.

Les données dans la Figure 7a-b représentant le temps passé dans le (s) à drogue appariés dans le pré et Post-C test ont été analysés avec une analyse de la variance avec un j...

Discussion

Le point clé de la recherche sur la dépendance des médicaments est le développement de traitements qui diminuent la soif et, par conséquent, réduire la vulnérabilité à la rechute. Grâce au modèle de rétablissement du paradigme du RPC, il est possible d’étudier l’influence de différents facteurs procédurales et environnementales qui modulent la rechute, qui constitue une priorité de la recherche future. Il y a quelques points importants à considérer, comme le paradigme du RPC est un test qui est trè...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MONPRE 2Z software	CIBERTEC S.A., Spain	N/A
Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area.	CIBERTEC S.A., Spain	N/A	The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.
Cocaine hydrochloride	Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain	N/A
Animals: mice of the OF1 outbred strain	Charles River, Barcelona Spain	N/A	Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.
Standard Diet- Teklad Global Diet 2014	Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain)		13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g
High fat diet TD.06415			45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g