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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Resumen

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que produce hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Los islotes consisten principalmente en cinco tipos de células que secretan hormonas: las células secretan el glucagón, las células secretan insulina, las células secretan somatostatina, las células secretan la ghrelina y las células PP secretan polipéptido pancreático. Sesenta al 80% de las células de los islotes son células, que son la población celular más importante para estudiar la secreción de insulina. Los islotes pancreáticos son un sistema modelo crucial para estudiar la secreción de insulina ex vivo. Adquirir islotes de alta calidad es de gran importancia para la investigación de la diabetes. La mayoría de los procedimientos de aislamiento de islos requieren un sitio de inyección de colagenasa técnicamente difícil, procedimientos de digestión agresivos y complejos y pasos de purificación de gradiente de densidad múltiple. Este papel cuenta con un sencillo método de aislamiento de islotes de ratón de alto rendimiento con descripciones detalladas y demostraciones realistas, que muestra los siguientes pasos específicos: 1) inyección de colagenasa P en la ampolla de Vater, un área pequeña que une el conducto pancreático y el conducto biliar común, 2) la digestión enzimática y la separación mecánica del páncreas exocrino, y 3) un único paso de purificación de gradiente. Las ventajas de este método son la inyección de enzima digestiva utilizando la ampolla más accesible de Vater, una digestión más completa utilizando una combinación de enfoques enzimáticos y mecánicos, y un paso de purificación de un solo gradiente más simple. Este protocolo produce aproximadamente 250—350 islotes por ratón; e islotes son adecuados para varios estudios ex vivo. Las posibles advertencias de este procedimiento son islotes potencialmente dañados debido a la digestión enzimática y/ o incubación prolongada de gradiente, todo lo cual puede evitarse en gran medida mediante una cuidadosa justificación ad del tiempo de incubación.

Introducción

Hay dos métodos comunes en la literatura para el aislamiento de islotes pancreáticos. Se requiere extirpar el páncreas y picarlo en trozos pequeños usando tijeras quirúrgicas, y luego digerirlo en una solución de colagenasa1,2,3. Otro método más preciso es utilizar la red de conductos presentes en el páncreas para introducir enzima digestiva. Los siguientes sitios se han utilizado para la inyección de enzimas digestivas: la unión de la bilis y el conducto quístico, la vesícula biliar en el conducto biliar común o el propio conducto biliar común1,4,5. Se sabe que los islotes no se distribuyen uniformemente en el páncreas; la región esplénica contiene la mayoría de los islotes6. Mientras que el segundo método que utiliza vías anatómicas para entregar enzimas digestivas permite una perfusión más completa del páncreas, incluyendo la región esplénica, este procedimiento a menudo requiere la sujeción o sutura de la ampolla de Vater que es técnicamente Desafiante. En términos de purificación de islotes, se han utilizado gradientes de densidad múltiple, así como coladores celulares y retracción magnética para purificar los islotes3,7. La utilización de estos gradientes puede llevar mucho tiempo y losgradientes de Ficoll pueden resultar en daños tóxicos de los islotes 8.

El protocolo actual se basa en el método descrito por Li et al.7, con modificaciones adicionales añadidas basadas en la experiencia de nosotros mismos y otros1,4. Los pasos más críticos de nuestro protocolo son la sujeción del conducto biliar común cerca del extremo del hígado, la inyección de colagenasa P a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido exocrina, y luego el uso de un baño de agua agitada para acelerar la digestión mecánicamente1, 4,7. Posteriormente, se aplica una solución 'STOP' para inhibir la digestión posterior de los islotes; HBSS se utiliza para lavar la solución restante de colagenasa P y STOP. Cuando se utilizó el método Ficoll para purificar los islotes humanos, se informó que el rendimiento era el doble de los islotes con mayor capacidad funcional (por ejemplo, secreción de insulina) en comparación con el uso de gradientes de Percoll9. Sin embargo, los estudios han cuestionado el usodel gradiente de Ficoll debido a su efecto tóxico en los islotes 1,10. Se ha informado que el gradiente Histopaque proporciona una cinética de purificación óptima para el aislamiento de islotes de ratón, lo que produce un buen rendimiento de islotes de alta calidad con pasos más simples y menor costo1. En nuestro protocolo, Histopaque-1077 se utiliza parapurificar islotes de otros tejidos residuales 8,11. Los islotes cosechados pueden ser cultivados en medios RPMI-1640 completos, o utilizados directamente en la cuantificación de ARN/proteína.

Nuestro protocolo, utilizando una combinación de digestión de colagenasa P y un solo paso de purificación de gradiente, es más simple que otros protocolos publicados. Nuestro método no requiere procedimientos quirúrgicos exigentes y tiene sólo unos sencillos pasos. Más importante aún, este protocolo produce consistentemente un buen rendimiento de islotes funcionales de alta calidad (250-350/ratón) como informamos12.

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Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Universidad Texas A&M. La necesidad de herramientas quirúrgicas se muestra en la Figura 1 y el diagrama esquemático del procedimiento se muestra en la Figura 2.

1. Soluciones

  1. Prepare la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank añadiendo 100 ml de 10X HBSS (de stock) a 900 ml de agua destilada para hacer 1 L de HBSS (1X).
  2. Preparar la solución STOP (debe hacerse fresca y debe utilizarse dentro de 1 h) añadiendo 50 ml de suero bovino fetal 100X (FBS) a 450 ml de hielo frío 1X HBSS; esto hace que la solución 500 mL STOP. Mantenga la solución STOP a 4oC.
  3. Preparar la solución de colagenasa P (debe hacerse fresca dentro de 1 h de ser utilizada) añadiendo 1 mg/ml de colagenasa P al frío del hielo 1X HBSS; utilizar 6 ml/ratón.
    1. Añadir 0.05% (p/v) albúmina sérica bovina (BSA) a la solución de colagenasa P (esto proporciona nutrientes a los islotes aislados). Por ejemplo, utilice 3 mg de BSA en 6 ml de solución de colagenasa P. Mantener en hielo.
    2. Calcular y preparar la cantidad de colagenasa P necesaria para todos los ratones en un tubo de 50 ml.
  4. Preparar el medio RPMI 1640 completo añadiendo un 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, suplemento celular INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM de L-glutamina, piruvato sódico de 1 mM y 0,05 mM de 2 mercaptoetanol) a 500 ml de medios RPMI 1640 que contienen 5,5 mM de glucosa para usar para la cultura y la incubación durante la noche.

2. Preparación

  1. Llene tres tubos de 50 ml de solución inhibidora de rnase de 25 ml, 70% etanol o H2O destilado. Estas soluciones se utilizarán para limpiar herramientas quirúrgicas antes y durante el procedimiento.
  2. Remoje las puntas de las herramientas de la solución inhibidora de RNase durante 30 minutos antes de iniciar el protocolo; esto elimina cualquier RNase potencial en las herramientas.
  3. Almohadillas absorbentes precortadas a 6 en x 6 de tamaño para su uso durante la cirugía.
  4. Preparar 1x solución HBSS con antelación y almacenar a 4 oC. Prepare la solución STOP antes de la cirugía. Conservar a 4oC.
  5. Preparar la solución de colagenasa P inmediatamente antes de la cirugía y almacenar en hielo.
    NOTA: Esto debe utilizarse dentro de las 2 h de la preparación.
  6. Etiqueta 50 ml tubos para digestión y purificación; preparar 2 tubos para cada ratón, uno para la digestión y el otro para la purificación de islos. Asegúrese de que la identificación del animal esté en ambos tubos.
  7. Añadir 3 ml de solución de colagenasa P en el primer tubo de 50 ml. Se inyectarán los 3 ml restantes de colagenasa P.
  8. Extraiga los 3 ml restantes de solución de colagenasa en una jeringa de 3 ml montada con 30 G 1/2 en aguja. Coloque la jeringa sobre hielo.

3. Procedimiento

  1. Retire todas las herramientas de la solución inhibidora de RNase, luego sumerja primero en el tubo con 70% de etanol, luego en el tubo que contiene H2O destilado, luego seque al aire en una toalla de papel limpia.
  2. Coloque el ratón en una cámara que contenga 0,5 ml de isoflurano hasta que el ratón esté profundamente anestesiado.
  3. Retire el ratón de la cámara y compruebe el estado de la anestesia pellizcando una almohadilla para los pies con fórceps. La anestesia profunda se basa en la observación de que la respiración se vuelve constantemente lenta y el ratón no es reactivo al pellizco de los pies. Después de confirmar que el ratón está profundamente anestesiado, eutanasia el ratón con luxación cervical, y luego coloque el ratón en la almohadilla absorbente.
    1. Coloque el ratón anestesiado sobre su estómago, aplicando presión en el cuello y dislocando la columna vertebral del cerebro tirando de la cola.
  4. Tape las extremidades del ratón en posición supina a la almohadilla absorbente, rocíe el cuerpo con 70% de etanol y limpie el exceso de etanol.
  5. Utilice fórceps de vidrio de cubierta y tijeras quirúrgicas curvas para hacer incisiones. En primer lugar, haga una incisión horizontal en la piel de la zona abdominal (3 cm), tire de la piel abierta para exponer la pared abdominal. A continuación, haga una incisión vertical (3-4 cm) en el peritoneo abdominal para exponer completamente el páncreas en la cavidad abdominal (Figura3).
  6. Empuje los lóbulos del hígado superiormente para exponer el conducto biliar, aparecerá como un tubo de color rosa pálido (Figura3).
  7. Mueva cuidadosamente los intestinos de la región lumbar/ilíaca derecha de la cavidad abdominal hacia la derecha, exponiendo el conducto biliar y la arteria hepática (Figura3).
  8. Sujete cuidadosamente el conducto biliar común usando los micro serrefines Schwartz (Figura 1) lo más cerca posible del hígado.
  9. Identificar la ampolla de Vater, que se encuentra en la papila duodenal, formada por la unión del conducto pancreático y el conducto biliar común. La ampolla de Vater aparece hinchada cuando se ve bajo un microscopio de disección que es el punto de entrada al conducto biliar común (Figura4).
    NOTA: Ajustar la intensidad/ángulo de luz del microscopio de disección puede facilitar la localización.
  10. Inserte la jeringa con 3 ml de la solución de colagenasa P en la ampolla de Vater. Empuje la aguja en el conducto durante aproximadamente 1/4 de la longitud del conducto biliar común (la ampolla conduce al conducto) como se muestra en la Figura5.
  11. Una vez que la aguja está en la ampolla, asegúrese de que la orientación de la aguja es tal que es paralela al conducto.
  12. Estabilice la aguja sujetando con fórceps micro Adson para evitar que punde el conducto (Figura5).
  13. Inyecte lenta y constantemente 3 ml de la solución de colagenasa P de la jeringa en el conducto biliar común (suficiente para sentir resistencia) como se muestra en la Figura6. El objetivo es crear presión de contraflujo para forzar la colagenasa a entrar en el conducto pancreático. La inyección se considera exitosa si la cabeza, el cuello, el cuerpo y la región de la cola del páncreas están completamente inflados.
    NOTA: El rendimiento del islet será bajo si el páncreas no está completamente inflado, o si el área esplénica no está completamente inflada. El área esplénica contiene elmayor número de islotes 6. La inflación puede ser confirmada por la aparición de espacios abiertos entre el tejido pancreático que están llenos de solución.
  14. Diseccione cuidadosamente el páncreas inflado y colóquelo en un tubo de digestión de 50 ml que contenga 3 ml de solución de colagenasa P helada.
    1. Retire el páncreas usando 2 fórceps (curvado y Micro Adson; Ver Figura 1): (a partir del bazo, tire del páncreas lejos del bazo y continúe extirpando del estómago y a lo largo del duodeno.
      NOTA: No se requieren incisiones.
    2. Picar el páncreas durante 3-5 s en el tubo de digestión con 3 ml de solución de colagenasa P helada con tijeras quirúrgicas finas (Figura7A).
  15. Fije el tubo a un bastidor en un baño de agua de 37 oC y agite a 100-120 rpm durante aproximadamente 12-13 min.
  16. Después de la incubación, agitar suavemente los tubos a mano para interrumpir el tejido hasta que la solución de digestión de la colagenasa P se vuelva homogénea (Figura7B). La homogeneidad se confirma por una apariencia similar a la arena de partículas finas de páncreas. Por lo general, es suficiente con unas 30 s de suave temblor de manos. Sujete el tubo a la luz para examinar si el tejido está bien homogeneizado; agitar para otros 15 s si es necesario.
  17. Una vez digeridos, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo y agregue 40 ml de solución STOP helada para terminar la digestión enzimática.
    NOTA: En este punto, los tubos de digestión se pueden dejar en hielo hasta 2 h, si se trabaja en varios ratones.
  18. Centrifugar el tubo en una centrífuga oscilante a 300 x g durante 30 s (la temperatura de la centrífuga es flexible).
    NOTA: Utilice una centrífuga de cubo oscilante para que el pellet de tejido se forme en la parte inferior del tubo de 50 ml y no en la pared del tubo; esto es fundamental para un mejor rendimiento del islet.
  19. Decantar y repetir la centrifugación con la solución STOP 2 veces más, decantándose la solución después de cada giro. Utilice 20 ml de solución STOP para cada lavado posterior.
    1. Antes de cada giro, interrumpa el pellet agitando suavemente el pellet de tejido en el tubo de 50 ml en 20 ml de solución STOP.
  20. Vuelva a suspender el pellet de tejido con 40 ml de HBSS helado y centrífuga a 300 x g durante 30 s.
  21. Decantar y repetir la centrifugación utilizando una centrífuga de cucharón oscilante con solución HBSS dos veces más, decantándose la solución después de cada giro. Utilice 20 ml de HBSS para cada lavado.
    1. Antes de cada giro, interrumpa el pellet, para separarlo de la parte inferior del tubo agitando suavemente el tubo que contiene 20 ml de solución HBSS.
  22. Después de la última centrifugación, retire todos los HBSS.
  23. A continuación, añada 5 ml de gradiente de densidad de temperatura ambiente al tubo de 50 ml que contiene el pellet. Vórtice brevemente a baja velocidad hasta que se homogeneice.
  24. Añadir otros 5 ml del gradiente de densidad de temperatura ambiente al tubo de 50 ml. No vórtice/mezcle.
    NOTA: Es fundamental mantenerse estable y aún así permitir que se forme un mejor gradiente sin interrupciones.
  25. Pipetear 10 ml de búfer HBSS a temperatura ambiente en el tubo (que contiene el gradiente de densidad), gota a gota suavemente y lentamente para permitir que se forme un gradiente. Utilice una pistola de pipeta con una pipeta de 10 ml para añadir HBSS en sentido de gota.
  26. Usando una centrífuga de cucharón oscilante, gira tubos a 1700 x g durante 15 min. Asegúrese de cambiar la velocidad de aceleración/desaceleración al ajuste más bajo para mantener el gradiente (Figura7C).
  27. Después del giro, retire cuidadosamente los tubos sin alterar el gradiente. Usando una pistola de pipeta premojada con HBSS frío (pipeta HBSS arriba y abajo), pipetea la capa de islotes (5-10 mL) formada entre el gradiente de densidad y HBSS en el nuevo tubo de recolección de islotes de 50 ml.
    NOTA: Es útil mojar la pipeta con HBSS frío antes de pipetear los islotes para evitar que los islotes se peguen a las paredes internas de la pipeta.
    1. En caso de que la separación esté incompleta, los islotes serían visibles en la capa de gradiente de densidad, pipeta hacia fuera todo el gradiente de densidad (capa inferior) junto con la capa de islotes formada en la interfaz (sólo para dejar alrededor de 8-10 mL de la capa superior HBSS detrás).
      NOTA: La recopilación de la capa de islet y la capa de degradado de densidad (capa inferior) puede dar lugar a la recopilación de residuos que pueden alargar el tiempo de selección de islos, pero no se modificarán otros pasos. La recopilación de ambas capas no es necesaria cuando la capa de islet está bien formada.
  28. Añadir 20 ml de HBSS helado al nuevo tubo de 50 ml que contiene islotes, luego centrifugar a 350 x g durante 3 minutos en una centrífuga de cubo oscilante.
  29. Después del giro, cuidadosamente pipeta (no decantar) hacia fuera el sobrenadante (dejar 3 ml en la parte inferior) sin molestar el pellet que contiene los islotes en la parte inferior. Descarta el sobrenadante.
  30. Repita el lavado y centrifugar al menos 3 veces. Añadir 20 ml de HBSS cada vez, y asegúrese de suspender el pellet antes de cada giro.
  31. Caliente la botella de medios completa RPMI-1640 en un baño de agua a 37 oC antes de su uso. Después de la última centrifugación, retire todo el HBSS y agregue 4 ml de medios RPMI-1640 completos previamente preparados (que contienen FBS, suplemento celular INS-1 y penicilina/estreptomicina) al pellet.
  32. Desaloje el pellet girando suavemente el tubo e inmediatamente vierta el medio RPMI-1640 en una placa Petri de 100 mm. Añadir otros 5 ml de medios RPMI-1640 al tubo y agitar suavemente para lavar los islotes restantes, a continuación, también verter el medio en el mismo plato Petri.
    1. Bajo un microscopio de disección, escoge islotes sanos de la placa Petri usando una pipeta de 20 l, y ponlos en una nueva placa Petri que contenga 10 ml de medios COMPLETOs RPMI 1640. Cuando se ven bajo un microscopio de disección, los islotes deben aparecer de color esférico/oblongo y marrón dorado con una superficie lisa en comparación con el tejido exocrina relativamente transparente y esposa.
      NOTA: La ampliación del microscopio de disección suele ajustarse a 12,5–16x. El rendimiento de los islos variará dependiendo de varios factores, incluyendo la tensión, la edad y el sexo del ratón. Este protocolo generalmente produce entre 250 y 350 islotes sanos a partir de una edad saludable del ratón C57BL/6J de 4 a 10 meses de edad.
  33. Incubar los islotes en una incubadora estéril a 37 oC con una perfusión deCO2 al 5% y un 95% de aire humidificado durante la noche para experimentos al día siguiente, o congelar los islotes para el análisis deseado en un momento posterior.
    1. Una vez que los islotes están congelados, no se pueden utilizar para ensayos de secreción, sólo ARN o cuantificación de proteínas. Para recoger las células para congelar, colóquelas en el tampón HBSS, recoja todos los islotes en 200–500 l de tampón, transfiera a un tubo de 1,5 ml, centrífuga 350 x g durante 1-2 min, retire el sobrenadante dejando no más de 30-40 l de solución, coloque en -20 oC para almacenamiento a corto plazo ( varios días) o -80 oC para almacenamiento a largo plazo.

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Resultados

La realización adecuada de este procedimiento requiere cierta comprensión de la anatomía del ratón en la cavidad abdominal. Esto permite una adecuada identificación de la ampolla de Vater y la sujeción del conducto biliar común. Todo el procedimiento normalmente toma 1–2 h. Es más eficiente aislar islotes de 4-6 ratones al mismo tiempo, por lo que varias muestras pueden ser centrifugadas juntas. El tiempo de recogida de islotes varía, dependiendo del número de islotes y la eficiencia de la digestión; puede t...

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Discusión

Este protocolo incluye perfusión y digestión de la colagenasa, seguida de la purificación de los islotes. Los pasos más críticos de este protocolo son la inyección efectiva y la perfusión completa del páncreas1,4,7. El método de administración de este protocolo permite a la enzima atravesar las rutas anatómicas para digerir mejor el tejido exocrino que rodea los islotes1. Además, esta técnica...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos a la Sra. Jennifer Munguia por su ilustración artística del diagrama esquemático. Agradecemos al Sr. Michael R. Honig en la Community Public Radio Station KPFT de Houston por su asistencia editorial. Este estudio fue apoyado por la Asociación Americana de la Diabetes #1-15-BS-177 (YS), y NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA, el proyecto Hatch 1010840 (YS) y el R01 DK095118 (SG).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3 mL syringeBD309657Hoding collagenase P
Coverglass forcepsVWR82027-396Holding skin of mouse to aid incision procedure
Curved forcepsSigma-AldrichZ168696Holding tissues during pancreas removal
IsofluranePiramalB13B16ATo anaesthetize mice prior surgery
100 mm petri dishesVWR30-2041Used for islet culture
30 G. ½ inch needleBD305106For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs
50ml tubeVWR89039-658Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets
Absorbent pads with waterproof moisture barrierVWR82020-845To absorb blood from syurgical procesdudes
Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capabilityEppendorf5811FJ478114Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.
Collagenase P- 1gRoche Diagnostics11249002001For digestion of exocrine pancreas
Curved surgical scissorsFisher-Scientific13-804-21For cutting open mouse abdomen
Dissection microscopeOlympusSZX16Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas
Hank's Balanced Salt Solution 10xCorning20-023-CVWashing cells
Histopaque-1077SigmaRNBF5100For gradient formation
Light sourceLeedsLR92240Enhancing visibility of microscope
RNaseZapFisher-ScientificAM9780For removing RNase
RPMI-1640 Media w/o L-GlutamineCorning15-040-CVCulturing Islets
Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)Fine Science Tools18052-01Clamping common bile duct and hepatic artery
Shaking waterbathBoekel/Grant8R0534008Important for mechanical digestion of exocrine tissue
Small surgical scissorsVWR82027-578Cuttitng tissue that atached to pancreas

Referencias

  1. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
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  3. O'Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
  4. Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632(2015).
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  9. Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374(1987).
  10. Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
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  13. Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).

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