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Resumo

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Resumo

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de Ilhéus de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produz hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. As ilhotas consistem principalmente em cinco tipos de células secreting-hormonais: células α secretam glucagon, células β secretam insulina, células δ secretam somatostatina, ε células secretam grelina, e células PP secretam polipeptídeo pancreático. 60 a 80% das células nas ilhotas são células β, que são a população celular mais importante para estudar a secreção de insulina. As ilhotas pancreáticas são um sistema de modelo crucial para estudar a secreção de insulina ex vivo. Adquirir ilhotas de alta qualidade é de grande importância para a pesquisa de diabetes. A maioria dos procedimentos de isolamento de Islet requer tecnicamente difícil de acessar o local de injeção de colagenase, procedimentos de digestão duras e complexas, e etapas de purificação de gradiente de densidade múltipla. Este papel caracteriza um método simples do isolamento do Islet do rato do rendimento elevado com descrições detalhadas e manifestações realísticas, mostrando as seguintes etapas específicas: 1) injeção do colagenase P no ampulla de Vater, uma área pequena que se juntar ao duto pancreatic e o ducto biliar comum, 2) digestão enzimática e separação mecânica do pâncreas exócrino, e 3) uma única etapa de purificação de gradiente. As vantagens deste método são a injeção da enzima digestiva usando a ampola mais acessível de Vater, digestão mais completa usando a combinação de abordagens enzimáticas e mecânicas, e um passo simples de purificação de gradiente único. Este protocolo produz aproximadamente 250 — 350 ilhotas por o rato; e ilhotas são adequados para vários estudos ex vivo. Possíveis advertências deste procedimento são ilhotas potencialmente danificadas devido à digestão enzimática e/ou incubação prolongada de gradiente, todas as quais podem ser largamente evitadas pela justificação cuidadosa do anúncio do tempo de incubação.

Introdução

Há dois métodos comuns na literatura para o isolamento da ilíte pancreática. Um exige excisão o pâncreas e o dicing em partes pequenas usando tesouras cirúrgicas, e então digerindo o em uma solução1,2,3do colagenase. Outro método mais preciso é usar a rede de dutos presentes no pâncreas para introduzir a enzima digestiva. Os seguintes locais foram usados para a injeção digestiva da enzima: a junção da bilis e do duto cístico, a vesícula biliar no colagogo comum, ou o colagogo comum próprio1,4,5. Sabe-se que as ilhotas não são distribuídas uniformemente no pâncreas; a região esplênica contém a maioria das ilhotas6. Enquanto o segundo método usando rotas anatômicas para entregar enzimas digestivas permite uma perfusão mais completa do pâncreas, incluindo a região esplênica, este procedimento muitas vezes requer o aperto ou sutura da ampola de Vater que é tecnicamente Desafiador. Em termos de purificação de ilhós, gradientes de densidade múltipla, bem como filtros celulares e retração magnética têm sido utilizados para purificar as ilhotas3,7. A utilização desses gradientes pode ser demorada e os gradientes de Ficoll podem resultar em dano tóxico das ilhotas8.

O protocolo atual é construído sobre o método descrito por Li et al.7, com modificações adicionais adicionadas com base na experiência de nós mesmos e de outros1,4. As etapas mais críticas do nosso protocolo são o aperto do ducto biliar comum perto da extremidade do fígado, injetando colagenase P através da ampola de Vater para digerir o tecido exócrino e, em seguida, usando um banho de água agitando para agilizar a digestão mecanicamente1, 4,7. Subseqüentemente, uma solução do "batente" é aplicada para inibir uma digestão mais adicional das ilhotas; HBSS é utilizado para lavar a solução remanescente de colagenase P e STOP. Quando o método de Ficoll foi usado para purificar as ilhotas humanas, o rendimento foi relatado para ser duas vezes as ilhotas com maior capacidade funcional (por exemplo, secreção de insulina) em comparação com o uso de gradientes de Percoll9. No entanto, estudos têm questionado o uso do gradiente Ficoll devido ao seu efeito tóxico nas ilhotas1,10. Relatou-se que o gradiente histopaque fornece a cinética óptima da purificação para a isolação da ilhotas do rato, que produz o bom rendimento de ilhotas da alta qualidade com etapas mais simples e um mais baixo custo1. Em nosso protocolo, o Histopaque-1077 é usado para purificar ilhotas de outros tecidos residuais8,11. As ilhotas colhidas podem ser cultivadas em meios completos de RPMI-1640, ou utilizadas diretamente na quantificação de RNA/proteína.

Nosso protocolo, usando uma combinação de digestão do colagenase P e uma única etapa da purificação do inclinação, é mais simples do que outros protocolos publicados. Nosso método não exige procedimentos cirúrgicos exigentes e tem apenas alguns passos simples. Mais importante, este protocolo consistentemente produz um bom rendimento de ilhotas funcionais de alta qualidade (250-350/mouse) como nós relatado12.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais (ACUC) da Universidade do Texas A & M. A necessidade de ferramentas cirúrgicas é mostrada na Figura 1 e o diagrama esquemático do procedimento é mostrado na Figura 2.

1. soluções

  1. Prepare a solução de sal equilibrado de Hank (HBSS) adicionando 100 mL de 10X HBSS (do estoque) a 900 mL da água destilada para fazer 1 L HBSS (1X).
  2. Prepare a solução STOP (deve ser feita fresca e deve ser usada dentro de 1 h) adicionando 50 mL de soro bovino fetal 100X (FBS) a 450 mL de gelo frio 1X HBSS; Isto faz 500 mL de solução STOP. Mantenha a solução STOP a 4 ° c.
  3. Prepare a solução de colagenase p (deve ser feita fresca dentro de 1 h de ser usado) adicionando 1 mg/ml de colagenase p ao gelo frio 1x HBSS; Use 6 mL/mouse.
    1. Adicionar 0, 5% (w/v) albumina sérica bovina (BSA) à solução de colagenase P (isto fornece nutrientes para as ilhotas isoladas). Por exemplo, use 3 mg de BSA em 6 ml de solução de colagenase P. Continue no gelo.
    2. Calcule e prepare a quantidade de colagenase P necessária para todos os camundongos em 1 50 mL de tubo.
  4. Prepare o meio completo de RPMI 1640 adicionando 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, suplemento de células INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio e 0, 5 mM 2-Mercaptoetanol) para 500 mL RPMI 1640 mídia contendo 5,5 mM de glicose para a cultura e incubação durante a noite.

2. preparação

  1. Encha 3 50 tubos de mL de solução inibidora de 25 mL de RNase, 70% de etanol ou H2O destilado. Estas soluções serão utilizadas para a limpeza de ferramentas cirúrgicas antes e durante o procedimento.
  2. Mergulhe as pontas das ferramentas na solução de inibição de RNase por 30 minutos antes de começar o protocolo; Isso elimina qualquer potencial RNase nas ferramentas.
  3. Pré-corte almofadas absorventes para 6 em x 6 em tamanho para uso durante a cirurgia.
  4. Prepare a solução 1X HBSS com antecedência e armazene a 4 ° c. Prepare a solução STOP antes da cirurgia. Conservar a 4 ° c.
  5. Prepare a solução de colagenase P imediatamente antes da cirurgia e armazene no gelo.
    Nota: este deve ser usado dentro de 2 h de preparação.
  6. Rótulo 50 mL tubos para digestão e purificação; Prepare 2 tubos para cada rato, um para a digestão e o outro para a purificação do Islet. Assegure-se de que a identificação animal esteja em ambos os tubos.
  7. Adicionar 3 ml de solução de colagenase P no primeiro tubo de 50 ml. Os restantes 3 mL de colagenase P serão injetados.
  8. Desenhe os restantes 3 mL de solução de colagenases numa seringa de 3 mL montada com 30 G 1/2 na agulha. Coloque a seringa no gelo.

3. procedimento

  1. Remova todas as ferramentas da solução de inibição de RNase, a seguir mergulha-as primeiramente no tubo com o etanol 70%, então no tubo que contem H2o destilado, a seguir ar-seque na toalha de papel limpa.
  2. Coloque o rato numa câmara contendo 0,5 mL de isoflurano até que o rato esteja profundamente anestesiado.
  3. Retire o mouse da câmara e verificar o estado de anestesia por beliscar uma almofada de pé com fórceps. A anestesia profunda baseia-se na observação de que a respiração se torna progressivamente lenta e o rato não é reactivo a beliscar o pé. Depois de confirmar que o mouse está profundamente anestesiado, eutanizar o mouse com luxação cervical e, em seguida, coloque o mouse sobre a almofada absorvente.
    1. Coloc o rato anestesiados em seu estômago, aplicando a pressão à garganta e deslocando a coluna espinal do cérebro puxando a cauda.
  4. Tape os membros do mouse em posição supina para a almofada absorvente, pulverizar o corpo com etanol 70%, e limpe o excesso de etanol em excesso.
  5. Use fórceps de vidro da tampa e tesouras cirúrgicas curvadas para fazer incisões. Primeiramente faça uma incisão horizontal na pele da área abdominal (~ 3 cm), puxe a pele largamente aberta para expor a parede abdominal. Em seguida, faça uma incisão vertical (~ 3 – 4cm) no peritônio abdominal para expor totalmente o pâncreas na cavidade abdominal (Figura 3).
  6. Empurre os lóbulos do fígado superiormente para expor o ducto biliar, ele aparecerá como um tubo rosa pálido (Figura 3).
  7. Mova cuidadosamente os intestinos da região lombar/ilíaca direita da cavidade abdominal para a direita, expondo o ducto biliar e a artéria hepática (Figura 3).
  8. Aperte cuidadosamente o ducto biliar comum usando os micro serrefes de Schwartz (Figura 1) o mais próximo possível do fígado.
  9. Identifique a ampola de Vater, que está localizada na papila duodenal, formada pela União do ducto pancreático e do ducto biliar comum. O ampulla de Vater aparece inchado quando visto um microscópio de dissecção que é o ponto de entrada para o ducto biliar comum (Figura 4).
    Nota: ajustar a intensidade/ângulo de luz do microscópio de dissecção pode torná-lo mais fácil de localizar.
  10. Insira a seringa com 3 mL da solução de colagenase P na ampola de Vater. Empurre a agulha para dentro do duto por cerca de 1/4 do comprimento do ducto biliar comum (ampulla conduz ao duto) como mostrado na Figura 5.
  11. Uma vez que a agulha está na ampola, assegure-se de que a orientação da agulha seja tal que é paralela com o duto.
  12. Estabilize a agulha apertando com o micro fórceps de Adson para impedi-lo de perfurar o duto (Figura 5).
  13. Injete lentamente e firmemente 3 mL da solução de colagenase P da seringa para o ducto biliar comum (o suficiente para sentir resistência), como mostrado na Figura 6. O objetivo é criar pressão de refluxo para forçar a colagenase a entrar no duto pancreático. A injeção é considerada bem sucedida se a cabeça, a garganta, o corpo e a região da cauda do pâncreas forem inflados inteiramente.
    Nota: a produção de Islet será baixa se o pâncreas não estiver totalmente inflado, ou se a área esplênica não estiver totalmente inflada. A área esplênica contém o maior número de ilhotas6. A inflação pode ser confirmada pelo aparecimento de espaços abertos entre o tecido pancreático que são preenchidos com solução.
  14. Dissecar cuidadosamente o pâncreas inflado e colocá-lo em um tubo de digestão de 50 mL contendo 3 mL de solução de colagenase P gelada.
    1. Retire o pâncreas usando 2 fórceps (curvo e micro Adson; Veja a Figura 1): (partindo do baço, puxe o pâncreas para longe do baço e continue removendo do estômago e ao longo do duodeno.
      Nota: não são necessárias incisões.
    2. Pique o pâncreas para 3 – 5 s no tubo de digestão com 3 mL de solução de colagenase de gelo fria usando uma tesoura cirúrgica fina (Figura 7a).
  15. Fixe o tubo a uma cremalheira no banho de água do ° c 37 e agitar em 100 – 120 rpm por aproximadamente 12 – 13 minutos.
  16. Após a incubação, agitar suavemente os tubos à mão para interromper o tecido até que a solução de digestão da colagenase P se torne homogênea (Figura 7B). A homogeneidade é confirmada por uma aparência semelhante à areia de partículas finas de pâncreas. Cerca de 30 s de aperto de mão suave é geralmente suficiente. Segure o tubo até a luz para examinar se o tecido está bem homogeneizado; agitar para outro ~ 15 s, se necessário.
  17. Depois de digerido, coloque imediatamente os tubos no gelo e adicione 40 mL de solução STOP gelada para encerrar a digestão enzimática.
    Nota: neste ponto os tubos da digestão podem ser deixados no gelo até 2 h, se trabalhando em ratos múltiplos.
  18. Centrifugue o tubo em um centrifugador da balanç-cubeta em 300 x g para 30 s (a temperatura do centrifugador é flexível).
    Nota: Use um centrifugador do balanç-cubeta de modo que o pellet do tecido esteja dado forma na parte inferior do tubo 50 mL e não na parede do tubo; Isto é crítico para o melhor rendimento da Illet.
  19. Decantar e repetir a centrifugação com a solução STOP mais 2 vezes, decantando a solução após cada giro. Utilize 20 mL de solução STOP para cada lavagem subsequente.
    1. Antes de cada centrifugação, interrompa o pellet agitando suavemente a pelota do tecido no tubo de 50 mL em 20 mL de solução STOP.
  20. Re-suspender a pelota do tecido com 40 mL de gelo frio HBSS e centrifugar a 300 x g por 30 s.
  21. Decantar e repetir a centrifugação usando um centrifugador da balanç-cubeta com solução de HBSS mais duas vezes, decantação a solução após cada rotação. Use 20 mL de HBSS para cada lavagem.
    1. Antes de cada centrifugação, interrompa o pellet, para o separar da parte inferior do tubo, agitando suavemente o tubo contendo 20 mL de solução HBSS.
  22. Após a última centrifugação, retire todos os HBSS.
  23. Em seguida, adicione 5 mL de gradiente de densidade de temperatura ambiente ao tubo de 50 mL contendo o pellet. Vortex brevemente em baixa velocidade até homogeneizado.
  24. Adicione mais 5 mL do gradiente de densidade da temperatura ambiente ao tubo de 50 mL. Não vórtice/misturar.
    Nota: é crítico para permanecer estável e ainda assim para permitir melhor gradiente de forma sem interrupção.
  25. Pipete 10 mL de temperatura ambiente HBSS tampão no tubo (contendo o gradiente de densidade), drop-by-gota suavemente e lentamente para permitir que um gradiente de forma. Use uma pistola de pipeta com uma pipeta de 10 mL para adicionar o HBSS Dropwise.
  26. Usando um centrifugador do balanç-cubeta, os tubos da rotação em 1700 x g por 15 minutos. Certifique-se de mudar a velocidade de aceleração/desaceleração para a configuração mais baixa para manter o gradiente (Figura 7C).
  27. Após a rotação, Retire cuidadosamente os tubos sem perturbar o gradiente. Usando uma pistola de pipeta pré-molhada com HBSS frio (pipeta HBSS para cima e para baixo), pipetar a camada de ilhotas (5 – 10 mL) formada entre o gradiente de densidade e HBSS no novo tubo de coleta de ilhotas de 50 mL.
    Nota: é útil molhar a pipeta com HBSS frio antes de Pipetar as ilhotas para evitar que as ilhotas aderindo às paredes internas da pipeta.
    1. No caso de a separação estar incompleta, as ilhotas seriam visíveis na camada de gradiente de densidade, pipetando para fora todo o 10 mL do gradiente de densidade (camada inferior) junto com a camada de ilhós formada na interface (apenas para deixar cerca de 8 – 10 mL da camada superior de HBSS atrás).
      Nota: a coleta da camada de Illet e da camada de gradiente de densidade (camada inferior) pode resultar na coleta de detritos que podem alondar o tempo de picking da Ilina, mas nenhuma outra ação será alterada. A coleta de ambas as camadas não é necessária quando a camada de Illet é bem formada.
  28. Adicionar 20 mL de gelo frio HBSS para o novo 50 mL tubo contendo ilhotas, em seguida, centrifugar a 350 x g por 3 min em um balanço-balde centrífuga.
  29. Após a rotação, cuidadosamente pipeta (nãodecantar) para fora do sobrenadante (deixar ~ 3 ml na parte inferior) sem perturbar o pellet contendo as ilhotas na parte inferior. Descarte o sobrenadante.
  30. Repita a lavagem e centrifugação pelo menos 3 vezes. Adicione 20 mL de HBSS cada vez, e seja certo suspender a pelota antes de cada rotação.
  31. Aqueça a garrafa de mídia completa RPMI-1640 em um banho de água a 37 ° c antes de usar. Após a última centrifugação, retire todos os HBSS e adicione 4 mL de meios de comunicação RPMI-1640 completos previamente preparados (contendo FBS, suplemento de células INS-1 e penicilina/estreptomicina) ao pellet.
  32. Desalojar a pelota delicadamente girando o tubo e despeje imediatamente a mídia RPMI-1640 em um prato de Petri de 100 mm. Adicione outro 5 mL de mídia RPMI-1640 ao tubo e gire-o suavemente para lavar as ilhotas remanescentes, então também despeje a mídia na mesma placa de Petri.
    1. um microscópio de dissecção, escolha ilhotas saudáveis da placa de Petri usando uma pipeta de 20 μL, e põr as em um prato de Petri novo que contem 10 mL de meios completos de RPMI 1640. Quando visto um microscópio de dissecção, as ilhotas devem aparecer cor esférica/oblonga e dourado-marrom com uma superfície lisa comparada ao tecido exócrina relativamente transparente, wispy.
      Nota: a ampliação do microscópio da dissecção é ajustada geralmente em 12.5-16x. O rendimento da Islet variará dependendo de vários fatores, incluindo tensão, idade e sexo do mouse. Este protocolo geralmente produz 250 – 350 ilhotas saudáveis de idade do mouse C57BL/6J saudável 4 – 10 meses de idade.
  33. Incubar as ilhotas em uma incubadora estéril em 37 ° c com infusão de 5% CO2 e 95% de ar humidificado durante a noite para experimentos no dia seguinte, ou congelar as ilhotas para a análise desejada em um momento posterior.
    1. Uma vez que as ilhotas são congeladas, elas não podem ser usadas para ensaios de secreção, apenas para quantificação de RNA ou proteína. Para recolher as células para congelar, coloque-as no tampão HBSS, colete todas as ilhotas em 200 – 500 μL de tampão, transfira para 1,5 mL de tubo, centrifugador 350 x g durante 1 – 2 min, retire o sobrenadante não deixando mais de 30 – 40 μL de solução, coloque em-20 ° c para armazenamento de curto prazo ( vários dias) ou-80 ° c para o armazenamento a longo prazo.

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Resultados

A conclusão apropriada deste procedimento exige alguma compreensão da anatomia do rato na cavidade abdominal. Isto permite a identificação apropriada do ampulla de Vater e do aperto do colagogo comum. Todo o procedimento normalmente leva 1 – 2 h. É mais eficiente isolar ilhotas de 4 a 6 camundongos ao mesmo tempo, para que várias amostras possam ser centrifugadas juntas. O tempo para a Islet-colheita varia, dependendo do número de ilhotas e da eficiência da digestão; pode demorar cerca de uma hora para escolhe...

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Discussão

Este protocolo inclui perfusão de colagenases e digestão, seguida de purificação de ilhotas. As etapas mais críticas deste protocolo são a injeção efetiva e a perfusão completa do pâncreas1,4,7. O método de parto deste protocolo permite que a enzima atravesse as vias anatômicas para melhor digerir o tecido exócrino que circunda as ilhotas1. Além disso, esta técnica é bem adequada para a di...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Estamos extremamente gratos à Sra. Jennifer Munguia por sua ilustração artística do diagrama esquemático. Agradecemos ao Sr. Michael R. Honig na estação de rádio pública da comunidade de Houston KPFT por sua assistência editorial. Este estudo foi apoiado pela American Diabetes Association #1-177 (YS), e NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de alimentação e agricultura do USDA, projeto Hatch 1010840 (YS) e R01 DK095118 (SG).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
3 mL syringeBD309657Hoding collagenase P
Coverglass forcepsVWR82027-396Holding skin of mouse to aid incision procedure
Curved forcepsSigma-AldrichZ168696Holding tissues during pancreas removal
IsofluranePiramalB13B16ATo anaesthetize mice prior surgery
100 mm petri dishesVWR30-2041Used for islet culture
30 G. ½ inch needleBD305106For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs
50ml tubeVWR89039-658Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets
Absorbent pads with waterproof moisture barrierVWR82020-845To absorb blood from syurgical procesdudes
Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capabilityEppendorf5811FJ478114Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.
Collagenase P- 1gRoche Diagnostics11249002001For digestion of exocrine pancreas
Curved surgical scissorsFisher-Scientific13-804-21For cutting open mouse abdomen
Dissection microscopeOlympusSZX16Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas
Hank's Balanced Salt Solution 10xCorning20-023-CVWashing cells
Histopaque-1077SigmaRNBF5100For gradient formation
Light sourceLeedsLR92240Enhancing visibility of microscope
RNaseZapFisher-ScientificAM9780For removing RNase
RPMI-1640 Media w/o L-GlutamineCorning15-040-CVCulturing Islets
Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)Fine Science Tools18052-01Clamping common bile duct and hepatic artery
Shaking waterbathBoekel/Grant8R0534008Important for mechanical digestion of exocrine tissue
Small surgical scissorsVWR82027-578Cuttitng tissue that atached to pancreas

Referências

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  13. Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).

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