Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Zusammenfassung

Pankreasinseln, auch Die Inselchen langerhans genannt, sind ein Cluster von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulation und andere wichtige biologische Funktionen produziert. Die Inselchen bestehen in erster Linie aus fünf Arten von hormonsekretierenden Zellen: Zellen sekrete Glucagon, Zellen sezernieren Insulin, Zellen sezernieren Somatostatin, Zellen sezernieren Ghrelin und PP-Zellen sezernieren Pankreaspolypeptid. Sechzig bis 80% der Zellen in den Inselchen sind Zellen, die die wichtigste Zellpopulation sind, um die Insulinsekretion zu untersuchen. Pankreasinseln sind ein entscheidendes Modellsystem zur Untersuchung der Ex-vivo-Insulinsekretion. Der Erwerb hochwertiger Inselchen ist für die Diabetesforschung von großer Bedeutung. Die meisten Isolierungsverfahren auf Der Iseutiniten erfordern technisch schwierigen Zugriff auf die Stelle der Kollagenaseinjektion, harte und komplexe Verdauungsverfahren und Schritte zur Reinigung von Mehrfachdichtegradienten. Dieses Papier verfügt über eine einfache High-Yield-Maus-Insel-Isolationsmethode mit detaillierten Beschreibungen und realistischen Demonstrationen, die die folgenden spezifischen Schritte zeigt: 1) Injektion der Kollagenase P an der Ampulla von Vater, ein kleiner Bereich, der den Pankreaskanal verbindet und der gemeinsame Gallengang, 2) enzymatische Verdauung und mechanische Trennung der exokrinen Bauchspeicheldrüse und 3) ein einziger Gradientenreinigungsschritt. Die Vorteile dieser Methode sind die Injektion des Verdauungsenzyms mit der leichter zugänglichen Ampulla von Vater, eine vollständigere Verdauung mit Kombination enzymatischer und mechanischer Ansätze und ein einfacherer Einzelgradientenreinigungsschritt. Dieses Protokoll erzeugt ca. 250–350 Inselchen pro Maus; und Inselchen eignen sich für verschiedene Ex-vivo-Studien. Mögliche Vorbehalte dieses Verfahrens sind potenziell geschädigte Inseln aufgrund enzymatischer Verdauung und/oder längerer Gradienteninkubation, die alle durch sorgfältige Ad-Begründung der Inkubationszeit weitgehend vermieden werden können.

Einleitung

Es gibt zwei gängige Methoden in der Literatur für die Pankreas-Islet-Isolierung. Man erfordert, die Bauchspeicheldrüse auszugraben und mit einer chirurgischen Schere in kleine Stücke zu zersieben und sie dann in einer Kollagenaselösung^1,2,3zu verdauen. Eine weitere genauere Methode ist die Verwendung des In-Kanal-Netzwerks in der Bauchspeicheldrüse zur Einführung von Verdauungsenzymen. Folgende Stellen wurden für die Injektion von Verdauungsenzymen verwendet: die Verbindung des Gallen- und Cystkanals, die Gallenblase in den gemeinsamen Gallengang oder der gemeinsame Gallengang selbst^1,4,5. Es ist bekannt, dass Inselchen nicht gleichmäßig in der Bauchspeicheldrüse verteilt sind; der Splenic-Bereich enthält die meisten Inselchen⁶. Während die zweite Methode, die anatomische Wege zur Lieferung von Verdauungsenzymen verwendet, eine vollständigere Durchblutung der Bauchspeicheldrüse, einschließlich der Milzregion, ermöglicht, erfordert dieses Verfahren oft das Spannen oder DasNusn der Ampulla von Vater, die technisch schwierig. In Bezug auf die Inselreinigung wurden mehrfachdichte Gradienten sowie Zellsiebe und magnetischer Rückzug verwendet, um die Inselchen zu reinigen^3,7. Die Nutzung dieser Steigungen kann zeitaufwändig sein und die Ficoll-Gradienten können zu toxischen Schäden an Inselchen⁸führen.

Das aktuelle Protokoll basiert auf der von Li et al.⁷beschriebenen Methode, wobei zusätzliche Modifikationen hinzugefügt werden, die auf der Erfahrung von uns und anderen basieren^1,4. Die kritischsten Schritte unseres Protokolls sind das Spannen des gemeinsamen Gallengangs in der Nähe des Leberendes, das Injizieren der Kollagenase P über die Ampulla von Vater, um das Exokringewebe zu verdauen, und dann mit einem schütteren Wasserbad, um die Verdauung mechanisch zu beschleunigen^{1, 4,7}. Anschließend wird eine "STOP"-Lösung angewendet, um die weitere Verdauung der Inselchen zu hemmen; HBSS wird verwendet, um die verbleibende Kollagenase P und STOP Lösung abzuwaschen. Wenn die Ficoll-Methode verwendet wurde, um menschliche Inselchen zu reinigen, wurde berichtet, dass die Ausbeute doppelt so hoch war wie die Inseln mit größerer Funktioneller Fähigkeit (z. B. Insulinsekretion) im Vergleich zur Verwendung von Percoll-Gradienten⁹. Studien haben jedoch die Verwendung von Ficoll Gradienten aufgrund seiner toxischen Wirkung auf die Inseln^1,10in Frage gestellt. Es wurde berichtet, dass der Histopaque Gradient eine optimale Reinigungskinetik für die Isolierung von Mausinseln bietet, was eine gute Ausbeute an hochwertigen Inselchen mit einfacheren Schritten und niedrigeren^Kosten1 erzeugt. In unserem Protokoll wird Histopaque-1077 verwendet, um Inselchen aus anderen Restgeweben zu reinigen^8,11. Die geernteten Inseln können in kompletten RPMI-1640-Medien kultiviert oder direkt in der RNA/Protein-Quantitation verwendet werden.

Unser Protokoll, das eine Kombination aus Kollagenase P-Verdauung und einem einzigen Gradientenreinigungsschritt verwendet, ist einfacher als andere veröffentlichte Protokolle. Unsere Methode erfordert keine anspruchsvollen chirurgischen Eingriffe und hat nur wenige einfache Schritte. Noch wichtiger ist, dass dieses Protokoll konsequent eine gute Ausbeute an hochwertigen funktionstüchtigen Inseln (250-350/Maus) erzeugt, wie berichtet¹².

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Animal Care and Use Committee (ACUC) der Texas A&M University genehmigt. Der Bedarf an chirurgischen Werkzeugen ist in Abbildung 1 und das schematische Diagramm des Verfahrens in Abbildung 2dargestellt.

1. Lösungen

1. Bereiten Sie Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) vor, indem Sie 100 ml 10X HBSS (ab Lager) zu 900 ml destilliertem Wasser hinzufügen, um 1 L HBSS (1X) herzustellen.
2. Bereiten Stop-Lösung (muss frisch gemacht werden und sollte innerhalb von 1 h verwendet werden) durch Zugabe von 50 ml 100X fetales Rinderserum (FBS) zu 450 ml eiskalte 1X HBSS; dies macht 500 ml STOP-Lösung. Halten Sie die STOP-Lösung bei 4 °C.
3. Bereiten Sie Kollagenase P Lösung (muss innerhalb von 1 h nach der Verwendung frisch gemacht werden) durch Zugabe von 1 mg/ml Kollagenase P zu eiskalten 1X HBSS; 6 ml/Maus verwenden.
   1. Fügen Sie 0,05% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) zur Kollagenase P-Lösung hinzu (dies liefert Nährstoffe für die isolierten Inselchen). Verwenden Sie beispielsweise 3 mg BSA in 6 ml Kollagennase P-Lösung. Auf Eisbleiben.
   2. Berechnen und bereiten Sie die Menge an Kollagenase P für alle Mäuse in einem 50 ml Rohr.
4. Bereiten Sie komplette sRPMI 1640 medium durch Hinzufügen von 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, INS-1-Zellergänzung (10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol) bis 500 ml RPMI 1640 Medien mit 5,5 mM Glucose für Nachtkultur und Inkubation.

2. Vorbereitung

1. Füllen Sie drei 50 ml Rohre mit 25 ml RNase-Hemmlösung,70% Ethanol oder destilliert H2 O. Diese Lösungen werden für die Reinigung von chirurgischen Werkzeugen vor und während des Eingriffs verwendet.
2. Einweichen Sie die Spitzen der Werkzeuge in RNase Hemmlösung für 30 min vor dem Start des Protokolls; Dadurch werden alle potenziellen RNase auf den Werkzeugen eliminiert.
3. Vorgeschnittene saugfähige Pads bis 6 in x 6 Größe für den Einsatz während der Operation.
4. Bereiten Sie die 1X HBSS-Lösung im Voraus vor und lagern Sie sie bei 4 °C. Bereiten Sie DIE STOP-Lösung vor der Operation vor. Bei 4 °C lagern.
5. Bereiten Sie Kollagenase P Lösung unmittelbar vor der Operation und auf Eis lagern.
   HINWEIS: Dies sollte innerhalb von 2 h nach der Zubereitung verwendet werden.
6. Etikett 50 ml Rohre für die Verdauung und Reinigung; bereiten 2 Rohre für jede Maus, eine für die Verdauung und die andere für die Inselreinigung. Stellen Sie sicher, dass sich die Tier-ID auf beiden Rohren befindet.
7. Fügen Sie 3 ml Kollagennase P-Lösung in das erste 50 ml-Rohr ein. Die restlichen 3 ml Kollagenase P werden injiziert.
8. Ziehen Sie die restlichen 3 ml Kollagenaselösung in eine 3 ml Spritze, die mit 30 G 1/2 in der Nadel montiert ist. Legen Sie die Spritze auf Eis.

3. Verfahren

1. Entfernen Sie alle Werkzeuge aus rNase Hemmlösung, dann tauchen Sie sie zuerst in das Rohrmit 70% Ethanol, dann in die Röhre mit destilliertem H2 O, dann lufttrocken auf sauberem Papiertuch.
2. Legen Sie die Maus in eine Kammer mit 0,5 ml Isofluran, bis die Maus tief anästhesiert ist.
3. Entfernen Sie die Maus aus der Kammer und überprüfen Sie den Zustand der Anästhesie, indem Sie ein Fußpolster mit Zangen kneifen. Die tiefen Anästhesisierung basiert auf der Beobachtung, dass die Atmung stetig langsam wird und die Maus unreaktiv zum Kneifen der Füße ist. Nach der Bestätigung, dass die Maus tief anästhesiert ist, einschläfern Sie die Maus mit Zervixdislokation, und legen Sie die Maus dann auf das saugfähige Pad.
   1. Legen Sie die anästhesierte Maus auf den Bauch, setzen Sie Druck auf den Hals und verschieben Sie die Wirbelsäule aus dem Gehirn, indem Sie den Schwanz ziehen.
4. Verkleben Sie die Gliedmaßen der Maus in Supine-Position auf das saugfähige Pad, sprühen Sie den Körper mit 70% Ethanol, und wischen Sie überschüssiges Ethanol ab.
5. Verwenden Sie Abdeckung Glaszange und gekrümmte chirurgische Schere, um Schnitte zu machen. Zuerst einen horizontalen Schnitt auf der Haut des Bauchbereichs machen (ca. 3 cm), ziehen Sie die Haut weit auf, um die Bauchwand freizulegen. Dann machen Sie einen vertikalen Schnitt (ca. 3–4cm) auf dem Bauchperitoneum, um die Bauchspeicheldrüse in der Bauchhöhle vollständig freizulegen (Abbildung 3).
6. Drücken Sie die Lappen der Leber überlegen, um den Gallengang zu belichten, wird es als blassrosa Röhre erscheinen (Abbildung 3).
7. Bewegen Sie den Darm vorsichtig aus dem rechten Lenden-/Iliasbereich der Bauchhöhle nach rechts, indem Sie den Gallengang und die Leberarterie freisetzen (Abbildung 3).
8. Den gemeinsamen Gallengang vorsichtig mit den Schwartz Micro Serrefines (Abbildung 1) so nah wie möglich an der Leber zu klemmen.
9. Identifizieren Sie die Ampulla von Vater, die sich an der Zwölffingerdarmpapille befindet, die durch die Vereinigung des Bauchspeicheldrüsenkanals und des gemeinsamen Gallengangs gebildet wird. Die Ampulla von Vater erscheint geschwollen, wenn sie unter einem Seziermikroskop betrachtet wird, das der Einstiegspunkt zum gemeinsamen Gallengang ist (Abbildung 4).
   HINWEIS: Das Anpassen der Lichtintensität/des Lichtwinkels des Seziermikroskops kann das Anortiieren erleichtern.
10. Setzen Sie die Spritze mit 3 ml der Kollagenase-P-Lösung in die Ampulla von Vater ein. Drücken Sie die Nadel in den Kanal für etwa 1/4 der Länge des gemeinsamen Gallengangs (Ampulla führt in den Kanal), wie in Abbildung 5dargestellt.
11. Sobald sich die Nadel in der Ampulla befindet, stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung der Nadel so ist, dass sie parallel zum Kanal ist.
12. Stabilisieren Sie die Nadel durch Einklemmen mit Micro Adson Zangen, um zu verhindern, dass sie den Kanal durchkreuzt (Abbildung 5).
13. Langsam und stetig 3 ml der Kollagenase P-Lösung aus der Spritze in den gemeinsamen Gallengang (genug, um Widerstand zu spüren) wie in Abbildung 6dargestellt. Das Ziel ist es, Rückflussdruck zu erzeugen, um die Kollagenase zu zwingen, in den Bauchspeicheldrüsenkanal einzutreten. Die Injektion gilt als erfolgreich, wenn der Kopf-, Nacken-, Körper- und Schwanzbereich der Bauchspeicheldrüse vollständig aufgeblasen ist.
    HINWEIS: Die Islet-Ausbeute ist gering, wenn entweder die Bauchspeicheldrüse nicht vollständig aufgeblasen ist oder die Splenic-Fläche nicht vollständig aufgeblasen ist. Der Splenic-Bereich enthält die höchste Anzahl von Inselchen⁶. Die Inflation kann durch das Auftreten von offenen Räumen zwischen Bauchspeicheldrüsengewebe bestätigt werden, die mit Lösung gefüllt sind.
14. Sezieren Sie die aufgeblasene Bauchspeicheldrüse vorsichtig aus und legen Sie sie in ein 50 ml Verdauungsrohr mit 3 ml eiskalter Kollagenase P-Lösung.
    1. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse mit 2 Zangen (gekrümmt und Micro Adson; Siehe Abbildung 1): (ab der Milz, ziehen Sie die Bauchspeicheldrüse weg von der Milz und weiter aus dem Magen und entlang des Zwölffingerdarms entfernen.
       HINWEIS: Keine Schnitte erforderlich.
    2. Bauchspeicheldrüse für 3-5 s im Verdauungsrohr mit 3 ml eiskalter Kollagenase P-Lösung mit feiner chirurgischer Schere hacken (Abbildung 7A).
15. Sichern Sie das Rohr an einem Rack in 37 °C Wasserbad und schütteln Sie bei 100–120 U/min für ca. 12-13 min.
16. Nach der Inkubation die Schläuche vorsichtig von Hand schütteln, um das Gewebe zu stören, bis die Kollagenase P Verdauungslösung homogen wird (Abbildung 7B). Homogenität wird durch ein sandartiges Aussehen feiner Pankreaspartikel bestätigt. Etwa 30 s sanftes Händeschütteln reichen in der Regel aus. Halten Sie die Röhre bis zum Licht, um zu untersuchen, ob das Gewebe gut homogenisiert ist; bei Bedarf für weitere 15 s schütteln.
17. Nach dem Digestieren die Schläuche sofort auf Eis legen und 40 ml eiskalte STOP-Lösung hinzufügen, um die enzymatische Verdauung zu beenden.
    HINWEIS: An dieser Stelle können Verdauungsröhren bis zu 2 h auf Eis gelassen werden, wenn sie an mehreren Mäusen arbeiten.
18. Zentrifugieren Sie das Rohr in einer Schwing-Schaufel-Zentrifuge bei 300 x g für 30 s (die Temperatur der Zentrifuge ist flexibel).
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Schwenk-Eimer-Zentrifuge, so dass das Gewebepellet an der Unterseite des 50 ml Rohrs und nicht an der Wand des Rohres gebildet wird; dies ist entscheidend für eine bessere Islet-Ausbeute.
19. Dekantieren und wiederholen Sie die Zentrifugation mit STOP-Lösung 2 weitere Male, dekantieren Sie die Lösung nach jeder Drehung. Verwenden Sie 20 ml STOP-Lösung für jede nachfolgende Wäsche.
    1. Vor jeder Drehung das Pellet durch sanftes Schütteln des Gewebepellets im 50 ml-Rohr in 20 ml STOP-Lösung stören.
20. Das Gewebepellet mit 40 ml eiskaltem HBSS und Zentrifuge bei 300 x g für 30 s wieder aufhängen.
21. Dekantieren und wiederholen Sie die Zentrifugation mit einer Schwing-Bock-Zentrifuge mit HBSS-Lösung zwei weitere Male, wodurch die Lösung nach jeder Drehung dekantiert wird. Verwenden Sie 20 ml HBSS für jede Wäsche.
    1. Vor jeder Drehung das Pellet stören, um es von der Unterseite des Rohres zu lösen, indem Sie das Rohr mit 20 ml HBSS-Lösung sanft schütteln.
22. Entfernen Sie nach der letzten Zentrifugation alle HBSS.
23. Fügen Sie dann 5 ml Raumtemperaturgradient in das 50 ml-Rohr, das das Pellet enthält. Wirbel kurz bei niedriger Geschwindigkeit bis zur Homogenisierung.
24. Fügen Sie dem 50 ml-Rohr weitere 5 ml des Raumtemperaturgradienten hinzu. Wirbel/Mix nicht.
    HINWEIS: Es ist wichtig, stabil zu bleiben und trotzdem, um eine bessere Steigung ohne Unterbrechung zu ermöglichen.
25. Pipette 10 ml Raumtemperatur HBSS Puffer in das Rohr (mit dem Dichtegradienten), Tropfen für Tropfen sanft und langsam, um einen Gradienten bilden zu lassen. Verwenden Sie eine Pipettenpistole mit einer 10 ml Pipette, um HBSS tropfenweise hinzuzufügen.
26. Drehen Sie die Rohre mit einer Schwenk-Bock-Zentrifuge 15 min mit einer Schwenk-Bock-Zentrifuge. Stellen Sie sicher, dass Sie die Geschwindigkeit der Beschleunigung/Verzögerung auf die niedrigste Einstellung ändern, um den Farbverlauf beizubehalten (Abbildung 7C).
27. Entfernen Sie nach der Drehung die Rohre vorsichtig, ohne den Gradienten zu stören. Mit einer Pipette-Pistole, die mit kaltem HBSS (Pipette HBSS nach oben und unten) vorbenetzt ist, wird die zwischen dem Dichtegradienten und HBSS gebildete Inselschicht (5–10 ml) in das neue 50-ml-Inselsammelrohr ausgepipettet.
    HINWEIS: Es ist hilfreich, die Pipette mit kaltem HBSS zu befeuchten, bevor die Inselchen pipetiert werden, um zu verhindern, dass die Inselchen an den Innenwänden der Pipette kleben.
    1. Falls die Trennung unvollständig ist, wären Inselchen in der Dichtegradientenschicht sichtbar, pipette die gesamte 10 ml des Dichtegradienten (untere Schicht) zusammen mit der an der Schnittstelle gebildeten Inselschicht (nur um etwa 8–10 ml der HBSS-Oberschicht hinter sich zu lassen).
       HINWEIS: Das Sammeln sowohl der Islet-Schicht als auch der Dichtegradientenschicht (untere Schicht) kann zu einer Sammlung von Schmutz führen, was die Kommissionierzeit der Islet verlängern kann, aber keine anderen Schritte werden geändert. Das Sammeln dieser beiden Schichten ist nicht erforderlich, wenn die Isletschicht gut ausgebildet ist.
28. 20 ml eiskalteHBSS in das neue 50 ml-Rohr mit Inselchen geben, dann zentrifugieren bei 350 x g für 3 min in einer Schwing-Eimer-Zentrifuge.
29. Nach dem Drehen, sorgfältig Pipette (nichtdekantieren) aus dem Überstand (lassen Sie 3 ml an der Unterseite), ohne das Pellet mit den Inseln an der Unterseite stören. Entsorgen Sie den Überstand.
30. Waschen und Zentrieren mindestens 3 Mal wiederholen. Fügen Sie jedes Mal 20 ml HBSS hinzu, und stellen Sie sicher, dass Sie das Pellet vor jeder Drehung anhalten.
31. Erwärmen Sie die komplette Medienflasche RPMI-1640 im Wasserbad bei 37 °C. Nach der letzten Zentrifugation entfernen Sie alle HBSS und fügen Sie 4 ml zuvor vorbereiteter vollständiger RPMI-1640-Medien (mit FBS, INS-1-Zellergänzung und Penicillin/Streptomycin) in das Pellet ein.
32. Lösen Sie das Pellet, indem Sie das Rohr sanft wirbeln und gießen Sie das RPMI-1640 Medium sofort in eine 100 mm Petrischale. Fügen Sie weitere 5 ml RPMI-1640-Medien in das Rohr und wirbeln Sie es vorsichtig, um alle verbleibenden Inselchen abzuwaschen, dann gießen Sie die Medien auch in die gleiche Petrischale.
    1. Wählen Sie unter einem Seziermikroskop gesunde Inselchen aus der Petrischale mit einer 20-L-Pipette aus und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit 10 ml kompletten RPMI 1640-Medien. Unter einem Seziermikroskop betrachtet, sollten Inselchen sphärisch/länisch und goldbraun mit einer glatten Oberfläche im Vergleich zum relativ transparenten, wispy exokrinen Gewebe erscheinen.
       HINWEIS: Die Vergrößerung des Seziermikroskops wird in der Regel auf 12,5–16x eingestellt. Die Islet-Ausbeute variiert je nach verschiedenen Faktoren wie Stamm, Alter und Geschlecht der Maus. Dieses Protokoll ergibt in der Regel 250–350 gesunde Inselchen aus gesunden C57BL/6J Maus alter 4–10 Monate alt.
33. Inkubieren Sie die Inseln in einem sterilen Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2-Infusion und 95% befeuchteter Luft über Nacht für Experimente am nächsten Tag, oder frieren Sie die Inseln für die gewünschte Analyse zu einem späteren Zeitpunkt ein.
    1. Sobald Inselchen eingefroren sind, können sie nicht mehr für Sekretionstests verwendet werden, sondern nur für die RNA- oder Proteinquantifizierung. Um Zellen zum Einfrieren zu sammeln, legen Sie sie in den HBSS-Puffer, sammeln Sie alle Inselchen in 200–500 l Puffer, übertragen Sie in 1,5 ml Rohr, Zentrifuge 350 x g für 1-2 min, entfernen Sie den Überstand verlassen nicht mehr als 30–40 l Lösung, legen Sie in -20 °C für kurzfristige Lagerung ( mehrere Tage) oder -80 °C für die Langzeitlagerung.

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Ergebnisse

Der ordnungsgemäße Abschluss dieses Verfahrens erfordert ein gewisses Verständnis der Mausanatomie in der Bauchhöhle. Dies ermöglicht eine ordnungsgemäße Identifizierung der Ampulla von Vater und das Spannen des gemeinsamen Gallengangs. Die gesamte Prozedur dauert normalerweise 1-2 h. Es ist effizienter, Inselchen von 4–6 Mäusen gleichzeitig zu isolieren, so dass mehrere Proben zusammen zentrifugiert werden können. Die Zeit für die Pflückerung variiert je nach Anzahl der Inselchen und der Effizienz der Verda...

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Diskussion

Dieses Protokoll umfasst Kollagenase-Perfusion und Verdauung, gefolgt von der Reinigung von Inselchen. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die effektive Injektion und vollständige Perfusion der Bauchspeicheldrüse^1,4,7. Die Abgabemethode dieses Protokolls ermöglicht es dem Enzym, die anatomischen Wege zu durchqueren, um das Exokringewebe, das die Inselchen umgibt, besser zu verdauen¹. Darüb...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL syringe	BD	309657	Hoding collagenase P
Coverglass forceps	VWR	82027-396	Holding skin of mouse to aid incision procedure
Curved forceps	Sigma-Aldrich	Z168696	Holding tissues during pancreas removal
Isoflurane	Piramal	B13B16A	To anaesthetize mice prior surgery
100 mm petri dishes	VWR	30-2041	Used for islet culture
30 G. ½ inch needle	BD	305106	For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs
50ml tube	VWR	89039-658	Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets
Absorbent pads with waterproof moisture barrier	VWR	82020-845	To absorb blood from syurgical procesdudes
Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability	Eppendorf	5811FJ478114	Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.
Collagenase P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	For digestion of exocrine pancreas
Curved surgical scissors	Fisher-Scientific	13-804-21	For cutting open mouse abdomen
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas
Hank's Balanced Salt Solution 10x	Corning	20-023-CV	Washing cells
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	For gradient formation
Light source	Leeds	LR92240	Enhancing visibility of microscope
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	For removing RNase
RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine	Corning	15-040-CV	Culturing Islets
Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)	Fine Science Tools	18052-01	Clamping common bile duct and hepatic artery
Shaking waterbath	Boekel/Grant	8R0534008	Important for mechanical digestion of exocrine tissue
Small surgical scissors	VWR	82027-578	Cuttitng tissue that atached to pancreas