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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.

Resumen

Visualización del ADN para microscopía de fluorescencia utiliza una variedad de tintes tales como los colorantes de Cianina. Estos colorantes son utilizados debido a su alta afinidad y sensibilidad para el ADN. Para determinar si las moléculas de ADN son completas después de la terminación del experimento, se requiere un método para determinar si las moléculas de tinción son longitud total por digestión de DNA con enzimas de restricción. Sin embargo, DNA manchada puede inhibir las enzimas, por lo que es necesario un método para determinar qué enzimas se puede usar para el fluorocromo mancharon ADN. En este método, el ADN se tiñe con un tinte de Cianina durante la noche para permitir que el tinte y el ADN se equilibren. Siguiente, tiñe ADN es digerido con una enzima de restricción, cargan en un gel y al. Las bandas de digestión de ADN experimentales son comparadas a una digestión en silico para determinar la actividad de la enzima de la restricción. Si hay el mismo número de bandas, como era de esperar, la reacción es completa. Bandas más de lo esperado indica la digestión parcial y menos bandas indican digestión incompleta. La ventaja de este método es su simplicidad y utiliza equipos que un científico necesita de una enzima de la restricción análisis y electrophoresis del gel. Una limitación de este método es que las enzimas disponibles para la mayoría de los científicos son las enzimas comercialmente disponibles; sin embargo, podría utilizarse cualquier enzimas de restricción.

Introducción

La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3 y BOBO-3; Tabla 1) se utiliza en una amplia variedad de experimentos donde la visualización de ADN es necesario1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la familia de dímeros de Cianina es ampliamente utilizada debido a su alta afinidad por las moléculas de ADN18,19,20, rendimiento cuántico y sensibilidad. Colorantes de Cianina dímero tienen gran selectividad para la DNA trenzada doble y cuando se intercalan un aumento de 100 a 1000 veces mayor de fluorescencia21. Tintes de pyridinium (YOYO-1, TOTO-1, 3 YOYO y TOTO-3) tienen una menor longitud de onda emisión de su quinolium del tinte (BOBO-1, 1 POPO, BOBO-3 y POPO 3) contrapartes (tabla 1)22. También, la producción de quántum de dímeros de Cianina intercalada en el ADN es alta (0.2 - 0.6)22. Sin embargo, utilizando una enzima para determinar el perfil de metilación de ADN molécula2 o estiramiento23 de una molécula de ADN ya teñida con colorante fluorescente requiere de un método para determinar qué enzimas digieren DNA manchada. Cualquier tipo de colorante que se intercala en el ADN o cualquier enzima que da un patrón discernible del sustrato de ADN se puede utilizar para este método.

Meng et al. en primer lugar determina la tasa de digestión de prestained ADN mediante electroforesis en gel utilizando una variedad de diferentes tintes24. Maschmann et al. profundizó en más profunda para ver a la familia TOTO de tintes. Ambos determinan la tasa de digestión de DNA manchada para ver si ADN teñida con un colorante determinado podría ser digerido con una enzima de la restricción de25. Otros métodos de estudian efectos vinculantes de tintes intercalados con el ADN usando pinzas ópticas26 o27de NMR. Cualquiera de los métodos requiere de equipo especializado; Considerando que este método permite el equipo que más laboratorios de biología molecular para determinar si un tinte interfiere con una enzima de la restricción digestión.

Además, en otros métodos para medir la longitud de una molécula dada, mapeo óptico ha alargado sin manchas las moléculas de ADN sobre una superficie y digiere ADN para determinar la extensión y tamaño de los fragmentos. Intercalación de tinte se ha demostrado para aumentar la longitud del contorno de las moléculas de ADN fluorescente manchadas y dependiendo del colorante utilizado, los contorno son diferentes21. Este método ha sido utilizado en una variedad de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. sin embargo, si las moléculas previamente teñidas, dependiendo del tinte y la enzima, la enzima puede no poder cortar ADN teñida con un colorante determinado. Por lo tanto, este método determina si ADN teñida con un colorante determinado puede ser digerido con una enzima. Además, dependiendo de la concentración de la tintura y el tinte utilizado, la movilidad de la DNA bandas en un gel migrarán más lentamente que el ADN nativo debido a la corrección parcial de la espina dorsal de la DNA para el tinte insertar entre pares de bases32 .

Sin embargo, a veces estos tintes pueden parcialmente o inhiben totalmente la acción de ciertas enzimas de restricción7,24. Esto es probablemente debido a un cambio estructural en el ADN causado por la fijación del colorante fluorescente, que puede impedir que la enzima reconoce la secuencia específica. Entender cómo estos tintes afectan enzimas de restricción puede ayudar en experimentos donde se requiere el perfil de metilación o el tramo de ADN teñido.

En nuestro método, ADN fue teñido con un fluorocromo de interés y digerido con una enzima de restricción. Luego fue electrophoresed DNA en un gel, reflejado, y se midió la tasa de digestión de la enzima de la restricción. Las enzimas de restricción fueron elegidas basándose en el patrón de corte en un gel. Superposición de bandas de ADN causadas muchas y muy pocas bandas no dio una imagen completa de la molécula de ADN. Hay un punto dulce para poder determinar el perfil de la molécula de ADN digerido; por lo tanto, dependerá de la DNA usada y la enzima. Una ventaja de este método es su simplicidad; sólo requiere equipo usado en una electroforesis de gel y digestión de restricción.

Protocolo

1. preparación de colorantes, Buffers y Gel de la agarosa

  1. Preparar las siguientes soluciones para la tinción de ADN o la digestión de ADN teñido.
    1. Preparar 1 x TE (Tris-HCl y etilendiaminotetracético ácido; Tampón EDTA) con 10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA en un cilindro graduado o un matraz aforado. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).
    2. Hacer alícuotas de cada tinte: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabla 1). Pipetear 4 μL de colorante de 1 mM en un ámbar oscuro o negro tubo de 1,5 mL y añadir 36 μl de TE 1 x, mezclar con la pipeta; Esta concentración hace que una solución de tinte de 100 μm (total 40 μL). Completar este paso para cada colorante. Almacenar a 4 ° C.
      Nota: Evite exponer el tinte a la luz para evitar fotoblanqueo o degradación del colorante.
    3. Preparar el tampón 1 usando 10 mM Bis-Tris-propano-HCl 10 mM MgCl2y 100 μg/mL albúmina sérica bovina (BSA). Preparar el tampón 2 utilizando 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2y 100 μg/mL de BSA. Preparar el tampón 3 utilizando 50 mM acetato de potasio, 20 mM Tris acetato, acetato de magnesio de 10 m m y 100 μg/mL BSA. Cada enzima requiere uno de estos búferes específicos para funcionar.
  2. Preparar las siguientes soluciones para la electroforesis del gel.
    1. Hacer 6 x carga del tinte azul, mediante la combinación de bromofenol 0.25% 0.25% xileno cyanol, 15% Ficoll en dH2O. almacén a temperatura ambiente.
    2. Para hacer una agarosa 0.7% gel, pesar 0,07 g de agarosa de temperatura (HGT) gelificación alta en un matraz Erlenmeyer, añadir 100 mL de buffer de x TAE 1 y coloque un vaso invertido sobre el matraz.
      1. Calentar la solución en una placa caliente hasta que las burbujas empiezan a formar en la parte inferior del matraz y flotador en la parte superior.
      2. Retirar la solución de la placa caliente, deje que la solución se enfríe hasta que el frasco puede ser tocado con la mano desnuda y luego Vierta el gel en un molde de gel de 24,5 x 21,8 cm con un peine de gel para crear pozos.
      3. Elimine las burbujas cerca del peine o en la superficie del gel por estallido con una punta de pipeta y permita que el gel se solidifique durante al menos 15 minutos. Esta puede almacenarse en un refrigerador (4 ° C) envuelto en plástico durante 1 semana prevenir el secado del gel o contaminación. Para obtener más información sobre cómo ejecutar un gel consulte Lee et al. 33 .
        Nota: Use un peine de gel con 30 pozos individuales. Cada uno debe ser 4,5 mm de ancho con una profundidad de 2 mm. La altura del pozo dependerá de la cantidad de gel en la caja.
    3. Preparar 1 buffer x TAE (Tris - acetato - EDTA) utilizando 40 mM Tris-HCl, ácido acético de 20 mM y 1 mM EDTA. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).

2. preparación de DNA manchada

  1. Lambda DNA (300-800 ng) con alícuotas diferentes de tintes de la mancha. Cada tinte (tabla 1) tendrá seis diferentes concentraciones probadas, para un total de 48 reacciones por enzima de la restricción. El siguiente proceso describe un conjunto para arriba para la 1 reacción (figura 1).
    1. Diluir lambda DNA usando TE de x 1 a 100 ng / μl. almacenar a 4 ° C. Hacer una solución con un volumen total de 300 μl.
    2. Mancha de lambda unmethylated DNA. Para cada banda de la recopilación, estimación de 75-100 ng/banda. Añadir cantidades apropiadas de colorantes para producir concentraciones de 1,9 μm μm 3,8, 19,4 μm, 32.2 μm, μm 48.3, 63.5 μm / 100 ng de ADN.
    3. Incubar durante una noche (15 h - 18 h) a 4 ° C.
    4. Dejar uno reacción de la mancha para actuar como un control25.
      Nota: Use unmethylated DNA por la reacción de digestión. Enzimas sensibles metilación no cortar regiones metiladas en el ADN y le dará un aspecto de una digestión incompleta.

3. preparación del ensayo enzimático de la restricción

  1. Resumen de teñido DNA con una enzima de restricción para determinar si esa enzima puede digerir DNA prestained (figura 1).
    1. Al día siguiente, añadir 20 U del enzima de restricción, 3 μl del tampón apropiado (tabla 2) y agua destilado, esterilizado y filtrado para un total de 30 μl. Para cada reacción de la enzima, elegir el tampón con la más alta eficiencia de corte, que se puede encontrar en la web del fabricante.
    2. Lugar las reacciones en un baño de agua a la temperatura de la actividad enzimática óptima, listado en la tabla 2 para las 6 enzimas utilizadas en Maschmann et al., para 2-4 h (tabla 2)25.
    3. Detener la reacción agregando 2 μl de pH de EDTA de 0.5 M 8.0.

4. Electroeluting tinción de DNA en un Gel de agarosa

  1. Desmoldar los lados 24,5 x 21,8 cm gel (paso 1.2.2) y coloque el gel en la caja de la electroforesis de gel. Vierta 2,5 L de tampón de x TAE 1 en el cuadro. Retire cuidadosamente el peine del gel del gel, por lo que los pozos son accesibles33.
  2. Pipetear las reacciones de la enzima de la restricción en una película de plástico y combinar cada reacción con 6 x carga del tinte. Para cada solución de reacción, añadir 1 μl de 6 x carga colorante por 5 a 6 μl de solución de ADN (1 x). Luego pipetear las reacciones (que contiene el tinte de la carga, < 18 μL) en los pocillos.
  3. Mezclar 1 μl de escalera de 1 kb, 9 μl de TE 1 x y 2 μl de 6 x carga del tinte. Cargar la solución en los pozos que flanquean las otras soluciones.
  4. Cubrir el gel caja con tela o papel negro o azul oscuro. Conecte la caja del gel a una fuente de alimentación la fuente de alimentación a 30 V y ejecutar toda la noche (15-20 h). Apague las luces cuando el gel esté funcionando, para evitar fotorrotura de la DNA etiquetada.
  5. A la mañana siguiente apague la fuente de alimentación. Tomar el gel usando la bandeja y transferir a un envase con 45 bromuro de etidio μl y 1 L de tampón de x TAE 1. Almacenar el envase a temperatura ambiente en la oscuridad o cubierta en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Mancha de gel que por menos de 45 min a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: Utilizar bromuro de etidio con guantes y gafas de seguridad. Al limpiar el contenedor con solución de bromuro de etidio y tirar el gel, consulte sus pautas de disposición de los Estados para determinar cómo tratar con bromuro de etidio utilizado; Además, otras manchas pueden utilizarse en lugar de bromuro de etidio.

5. la proyección de imagen del Gel de agarosa

  1. Coloque el gel sobre un transiluminador de luz azul, que emite la máxima potencia de luz entre 400-500 nm. Tomar fotos con la cámara acoplada a la estación.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de que utilice la cubierta para el iluminador y ponerse gafas de protección antes de encender la fuente de luz.
    Nota: Este paso puede también completarse usando cualquier fuente de luz UV o el explorador de gel estándar.
  2. Ver las fotos de ImageJ arrastrando el archivo a la barra de estado de ImageJ y aparecerá la imagen.
  3. Determinar la tasa de digestión para el experimento comparando las bandas en el gel con el patrón esperado en silico gel. Para determinar la tasa de digestión, el número de bandas experimentales se divide por el número esperado de DNA bandas24,25. Si el patrón de bandas ADN digerido experimental tiene el patrón esperado, la tasa de digestión es 1. Si el patrón tiene fragmentos más de lo esperado, la tasa de digestión es mayor que 1. Si el patrón tiene menos fragmentos de lo esperado, la tasa de digestión es menor que uno.

Resultados

Con el fin de determinar que si un colorante intercalante afecta una enzima de restricción que digiere ADN, el orden correcto de pasos debe ser seguidos (figura 1). Una vez que el ADN es manchado y digerido con una enzima dada, una imagen del gel puede tomarse para determinar el número de fragmentos y su tamaño (figura 2). Para determinar la eficiencia de la enzima, el número total de bandas visibles esperados dividido por el...

Discusión

Para digerir el ADN etiquetado fluorescente (figura 1), se requieren una serie de pasos. En primer lugar, ADN se tiñe con un fluorocromo durante la noche. ADN puede incubarse con dímeros de Cianina por un período más corto de tiempo; sin embargo, Carlsson et al encontraron que ADN creado bandas doble para cada tamaño de ADN debido a la tinción incompleta20. Para remediar esto, el ADN puede mancharse durante la noche para evitar que band...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional para el General médico Ciencia (NIGMS) (5605100122001), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH), así como la Universidad de Nebraska en Kearney (UNK) verano estudiante investigación programa (SSRP) y UNK Beca de pregrado (URF).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Unmethylated lambda DNANEBN3013S
YOYO-1ThermoFisher ScientificY3601
TOTO-1ThermoFisher ScientificT3600
POPO-1ThermoFisher ScientificP3580
BOBO-1ThermoFisher ScientificB3582
YOYO-3ThermoFisher ScientificY3606
TOTO-3ThermoFisher ScientificT3604
POPO-3ThermoFisher ScientificP3584
BamHINEBR0136S
PmlINEBR0532S
ScaINEBR3122S
EcoRI NEBR0101S
HindIIINEBR0104S
SmaINEBR0141S
TrisFisherBP152-1Irritant
EDTAFisherS316-212Toxic
HClFisherS25358Corrosive and irritant
Buffer 1NEBB7201SNEB 1.1
Buffer 2NEBB7202SNEB 2.1
Buffer 3NEBB7204SNEB Cutsmart
High gelling temperature agarose gelLonza50041
Acetic AcidFisherS25118Hazardous
Blue light transilluminatorDark ReaderDR196Wear correct eyewear 
Ethidium bromideFisher15585011Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.
Cannon EOS Rebel T3I cameraCannon
Apogee Model H4Biorad1704510
Power Pac Basic Power SupplyBiorad1645050 
FicollFisher ScientificBP525-25
Bromophenol blueFisher ScientificB-392
Xylene CyanolEastmenT1579

Referencias

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