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Resumo

Moléculas de DNA para microscopia de fluorescência de coloração permite que um cientista para visualizá-las durante um experimento. O método apresentado aqui, as moléculas de DNA são previamente coradas com corantes fluorescentes e digeridas com metilação e enzimas de restrição não-metilação sensíveis.

Resumo

Visualização do DNA para microscopia de fluorescência utiliza uma variedade de corantes como cianina corantes. Estes corantes são utilizados devido a sua alta afinidade e sensibilidade para DNA. A fim de determinar se as moléculas de DNA são comprimento total após a conclusão do experimento, um método é necessário para determinar se as moléculas manchadas são comprimento total por digestão com enzimas de restrição de DNA. No entanto, DNA manchada pode inibir as enzimas, portanto, um método é necessária para determinar que as enzimas se poderia usar para fluorocromo manchado de DNA. Neste método, o DNA está manchada com uma tintura de cianina durante a noite para permitir que o corante e DNA para equilibrar. Próximo, manchada de DNA é digerido com uma enzima de restrição, carregado em um gel e electrophoresed. As bandas de síntese de DNA experimentais são comparadas com um digest em silico para determinar a atividade de enzima de restrição. Se há o mesmo número de bandas como esperado, a reação é completa. Bandas mais do que o esperado indicam digestão parcial e menos bandas indicam digestão incompleta. A vantagem desse método é sua simplicidade e usa equipamento que precisaria de uma cientista para uma enzima de restrição do ensaio e electroforese do gel. Uma limitação deste método é que as enzimas disponíveis para a maioria dos cientistas são enzimas comercialmente disponíveis; no entanto, poderia ser usadas qualquer enzimas de restrição.

Introdução

A série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO e BOBO-3; A tabela 1) é utilizado em uma ampla variedade de experiências onde a visualização do DNA é necessário1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. a família de dímero de cianina é amplamente utilizada devido a sua alta afinidade por moléculas de DNA a18,19,20, sensibilidade e rendimento quântico. Cianina dímero corantes tem grande seletividade para ADN encalhado dobro e quando intercaladas têm um aumento de 100 a 1000 vezes de fluorescência21. Corantes de piridínio (YOYO-1, TOTO-1, 3-YOYO e TOTO-3) tem um emissão comprimento de onda menor do que seus quinolium tingir (BOBO-1, 1-POPO, BOBO-3 e POPO-3) homólogos (tabela 1)22. Além disso, o rendimento quântico de dímeros cianina intercalados no DNA é alto (0,2 - 0,6)22. No entanto, usando uma enzima para determinação do perfil de metilação de uma molécula de DNA2 ou esticar23 de uma molécula de DNA já manchada com uma tintura fluorescente requer um método para determinar que enzimas digerirá DNA manchada. Qualquer tipo de corante que se intercala no ADN ou qualquer enzima que dá um padrão discernível do substrato DNA pode ser usada para este método.

Meng et al primeiro determinada a taxa de digestão de DNA prestained através de eletroforese em gel usando uma variedade de diferentes corantes24. Miranda et al analisaram no mais profundo de olhar para a família de totó de corantes. Ambos determinados a taxa de digestão de DNA manchada para ver se DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima de restrição,25. Outros métodos de estudam efeitos vinculativos de corantes intercalados com DNA usando Pinça óptica26 ou NMR27. Qualquer método requer equipamento especializado; Considerando que, esse método permite que o equipamento que a maioria dos laboratórios de biologia molecular têm para determinar se uma tintura interfere com uma enzima de restrição de digestão.

Além disso, em outros métodos para medir o comprimento de uma determinada molécula, mapeamento óptico tem alongado imaculadas moléculas de DNA em uma superfície e digerido DNA para determinar a extensão e tamanho dos fragmentos. Intercalação de corante foi mostrada para aumentar o comprimento de contorno das moléculas de DNA fluorescente manchadas e dependendo do corante usado, os contorno dos comprimentos diferentes21. Este método tem sido utilizado em uma variedade de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. no entanto, se moléculas foram pre-manchadas, dependendo da tintura e a enzima, a enzima não pode ser capaz de cortar o DNA manchada com um determinado corante. Portanto, este método determina se o DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima. Além disso, dependendo da concentração de corante e o corante utilizado, a mobilidade do DNA bandas em um gel irão migrar mais lentamente do que o DNA nativo devido a desenrolar parcial do backbone DNA para fazer o quarto para a tintura inserir entre pares de bases32 .

No entanto, às vezes estes corantes podem parcialmente ou completamente, inibir a ação de determinadas enzimas de restrição7,24. Isto é pensado para ser devido a uma mudança estrutural no causada pelo acessório do corante fluorescente, que pode impedir que a enzima reconhecendo sua sequência específica de DNA. Compreender como estes corantes afetam as enzimas de restrição pode ajudar em experiências onde o perfil de metilação ou trecho de DNA manchada é necessário.

Em nosso método, o DNA foi manchada com um fluorocromo de interesse e digerido com uma enzima de restrição. Então o DNA foi electrophoresed em um gel, cuja imagem, e a taxa de digestão de enzima de restrição foi medida. As enzimas de restrição foram escolhidas com base no padrão de corte em um gel. Muitas bandas causaram a sobreposição das bandas de DNA e muito poucas bandas não deu uma imagem completa da molécula de DNA. Há um ponto doce para ser capaz de determinar o perfil da molécula de DNA digerido; Portanto, dependerá do DNA usado e a enzima. Uma vantagem deste método é sua simplicidade; exige somente equipamentos utilizados em uma eletroforese de gel e digestão de restrição.

Protocolo

1. preparação de corantes, Buffers e Gel de Agarose

  1. Prepare as seguintes soluções para coloração de DNA ou a digestão do DNA manchada.
    1. Preparar 1 x TE (Tris-HCl e ácido etilenodiaminotetracético ácido; Buffer de EDTA) usando 10 mM Tris-HCl e 1 mM de EDTA em uma proveta ou balão volumétrico. Armazenar em temperatura ambiente (18-25 ° C).
    2. Fazer alíquotas de cada tintura: TOTO-1, 1-YOYO, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO, BOBO-3 (tabela 1). Pipete 4 µ l de tintura de 1 mM em um âmbar escuro ou preto tubo de 1,5 mL e adicionar µ l 36 de 1x et, misture com a pipeta; Esta concentração torna uma solução de tintura de 100 µM (40 µ l total). Conclua esta etapa para cada tintura. Loja a 4 ° C.
      Nota: Evite expor a tintura à luz para evitar fotobranqueamento ou degradação do corante.
    3. Prepare o tampão 1 usando 10 mM Tris-HCl-propano-Bis 10 mM MgCl2e 100 µ g/mL albumina de soro bovino (BSA). Preparar o tampão 2 usando 50mm NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2e 100 µ g/mL BSA. Prepare o tampão 3 usando 50 mM acetato de potássio, 20 mM Tris-Acetato, acetato de magnésio de 10 mM e BSA 100 µ g/mL. Cada enzima exigirá um desses buffers específicos para funcionar.
  2. Prepare as seguintes soluções para a electroforese do gel.
    1. Faça um 6 x carregamento tingir combinando 0,25% bromofenol azul, 0,25% de xileno cianol, 15% Ficoll em dH2O. armazenar em temperatura ambiente.
    2. Para tornar um agarose 0.7% gel, pesar 0,07 g de agarose de temperatura (HGT) coagulação alta em um Erlenmeyer, adicionar 100 mL de tampão de x TAE 1 e colocar um copo invertido no topo do balão.
      1. Aqueça a solução em uma chapa quente até que as bolhas começam a se formar no fundo do frasco e flutuar para o topo.
      2. Remover a solução da placa quente, deixe arrefecer o solução até que o balão pode ser tocado com uma mão nua e em seguida despeje o gel em um molde de gel de 24,5 x 21,8 cm com um pente de gel para criar poços.
      3. Remover bolhas perto o pente ou na superfície do gel por estourá-los com a ponta da pipeta e permitir que o gel solidificar durante pelo menos 15 minutos. Isso pode ser armazenado em um refrigerador (4 ° C), envolvido em filme plástico por 1 semana impedir a secagem do gel ou contaminação. Para obter mais informações sobre como executar um gel referir Lee et al . 33 .
        Nota: Use um pente de gel com 30 poços individuais. Cada um bem deve ser de 4,5 mm de largura, com uma profundidade de 2 mm. A altura do poço vai depender da quantidade de gel derramado em caixa.
    3. Prepare 1 buffer de x TAE (Tris - Acetato - EDTA) usando 40 mM Tris-HCl, ácido acético de 20 mM e 1 mM de EDTA. Armazenar em temperatura ambiente (18-25 ° C).

2. preparação do ADN manchado

  1. Mancha de lambda DNA (300-800 ng) usando diferentes alíquotas de corantes. Cada tintura (tabela 1) terá seis diferentes concentrações testadas, para um total de 48 reações por enzima de restrição. O processo a seguir descreve um conjunto acima para a 1 reação (Figura 1).
    1. Diluir o lambda DNA usando 1 x TE a 100 ng / µ l. loja em 4 ° C. Faça uma solução com um volume total de 300 µ l.
    2. Mancha de lambda unmethylated DNA. Para cada banda esperada de digest, estime 75-100 ng/banda. Adicionar quantidades apropriadas de corante para produzir concentrações de 1,9 µM µM 3.8, 19,4 µM, 32,2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM / 100 ng de DNA.
    3. Incubar durante uma noite 15 h - 18 h a 4 ° C.
    4. Deixe uma reação inocente para atuar como um controle de25.
      Nota: Use unmethylated DNA para a reação de digestão. Enzimas sensíveis de metilação não podem cortar regiões metiladas no DNA e vão dar uma aparência de uma digestão incompleta.

3. preparação do ensaio enzima de restrição

  1. Digest manchadas de DNA com uma enzima de restrição para determinar se essa enzima pode digerir prestained DNA (Figura 1).
    1. No dia seguinte, adicionar 20 U da enzima de restrição, 3 µ l de buffer apropriado (tabela 2) e água destilada, água esterilizada e filtrada para um total de 30 µ l. Para cada reação enzimática, escolha o buffer com a mais alta eficiência de corte, que pode ser encontrada no site do fabricante.
    2. Coloque as reações em um banho de água à temperatura de atividade enzimática ideal, listada na tabela 2 para as 6 enzimas usadas em Miranda et al., por 2-4 h (tabela 2)25.
    3. Pare a reação adicionando 2 µ l de pH de EDTA 0,5 M 8.0.

4. Electroeluting manchado de DNA em um Gel de Agarose

  1. Remover os lados do molde gel de 24,5 x 21,8 cm (etapa 1.2.2) e coloque o gel na caixa de electroforese do gel. Despeje a caixa de 2,5 L de 1 x TAE de buffer. Retire cuidadosamente o pente gel de gel, assim que os poços são acessíveis33.
  2. Pipetar as reações de enzima de restrição em um filme plástico e combinar cada reação com 6 x tintura de carregamento. Para cada solução de reação, adicione 1 µ l de 6 x carregamento tintura por 5-6 µ l da solução de DNA (1x). Em seguida Pipetar as reações (contendo o corante de carregamento, < 18 µ l) nos poços.
  3. Misture 1 µ l de escada de 1 kb, 9 µ l de TE 1x e 2 µ l de 6 x tintura de carregamento. Carregar a solução para os poços que ladeiam as outras soluções.
  4. Cubra a caixa de gel com papel preto ou azul escuro ou tecido. A caixa de gel de conectar uma fonte de alimentação, conjunto de alimentação para 30 V e executá-lo durante a noite (15-20 h). Apague as luzes, enquanto o gel está sendo executado, para evitar a photocleavage do DNA etiquetado.
  5. Na manhã seguinte, desligue a fonte de alimentação. Pegue o gel usando a bandeja e transferi-lo para um recipiente com 45 brometo de etídio µ l e L 1 de 1 x TAE de buffer. Armazene o recipiente na temperatura ambiente no escuro ou de cobertura em papel alumínio para evitar a exposição à luz. Deixe o gel mancha pelo menos 45 min à temperatura ambiente.
    Cuidado: Use brometo de etídio com luvas e óculos de segurança. Quando limpar o recipiente contendo a solução de brometo de etídio e jogando fora o gel, consultar suas diretrizes de eliminação de Estados para determinar como lidar com brometo de etídio usados; Além disso, outras manchas podem ser utilizadas em vez de brometo de etídio.

5. imagem latente do Gel do Agarose

  1. Coloque o gel em cima de um transiluminador de luz azul, que emite luz de saída máximo entre 400-500 nm. Tire fotos com a câmera acoplada à estação.
    Atenção: Certifique-se de usar a capa para o iluminador e colocar óculos de proteção antes de ligar a fonte de luz.
    Nota: Este passo pode também ser concluído usando qualquer fonte de luz UV ou padrão do gel de scanner.
  2. Visualizar as fotos em ImageJ arrastando o arquivo para a barra de status do ImageJ e a imagem irá aparecer.
  3. Determine a taxa de digestão para a experiência, comparando as bandas no gel para o padrão esperado em silico gel. Para determinar a taxa de digestão, o número de bandas experimentais é dividido pelo número esperado de bandas de DNA24,25. Se o padrão de banda de DNA digerido experimental tem o padrão esperado, a taxa de digestão é 1. Se o padrão tem fragmentos mais do que o esperado, a taxa de digestão é maior que 1. Se o padrão tem menos fragmentos do que o esperado, a taxa de digestão é menor que 1.

Resultados

A fim de determinar que se um corante intercalante afetará uma enzima de restrição, digerindo o DNA, a ordem correta dos passos deve ser seguidos (Figura 1). Uma vez que o DNA é manchada e digerido com uma determinada enzima, uma foto do gel pode ser tomada para determinar o número de fragmentos e seu tamanho (Figura 2). A fim de determinar a eficiência da enzima, o número total de bandas visíveis esperados, dividido pelo...

Discussão

A fim de digerir fluorescente etiquetadas DNA (Figura 1), uma série de passos são necessários. Primeiro, DNA está manchada com um fluorocromo durante a noite. DNA pode ser incubada com dímeros cianina, por um período mais curto de tempo; no entanto, Carlsson et al encontraram que o DNA criado bandas duplas para cada tamanho de DNA devido à coloração incompleta20. Para remediar esta situação, o DNA pode ser manchado durante a noite ...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional para geral médica ciência (NIGMS) (5605100122001), um componente do National Institutes of Health (NIH), bem como a Universidade de Nebraska em Kearney (UNK) programa de pesquisa de estudante verão (SSRP) e UNK Bolsa de iniciação científica (Al-URF).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Unmethylated lambda DNANEBN3013S
YOYO-1ThermoFisher ScientificY3601
TOTO-1ThermoFisher ScientificT3600
POPO-1ThermoFisher ScientificP3580
BOBO-1ThermoFisher ScientificB3582
YOYO-3ThermoFisher ScientificY3606
TOTO-3ThermoFisher ScientificT3604
POPO-3ThermoFisher ScientificP3584
BamHINEBR0136S
PmlINEBR0532S
ScaINEBR3122S
EcoRI NEBR0101S
HindIIINEBR0104S
SmaINEBR0141S
TrisFisherBP152-1Irritant
EDTAFisherS316-212Toxic
HClFisherS25358Corrosive and irritant
Buffer 1NEBB7201SNEB 1.1
Buffer 2NEBB7202SNEB 2.1
Buffer 3NEBB7204SNEB Cutsmart
High gelling temperature agarose gelLonza50041
Acetic AcidFisherS25118Hazardous
Blue light transilluminatorDark ReaderDR196Wear correct eyewear 
Ethidium bromideFisher15585011Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.
Cannon EOS Rebel T3I cameraCannon
Apogee Model H4Biorad1704510
Power Pac Basic Power SupplyBiorad1645050 
FicollFisher ScientificBP525-25
Bromophenol blueFisher ScientificB-392
Xylene CyanolEastmenT1579

Referências

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