Déterminer si l’ADN colorées avec un Cyanine colorant peuvent être digérées par les Enzymes de Restriction

Résumé

Coloration des molécules d’ADN pour la microscopie de fluorescence permet de les visualiser au cours d’une expérience scientifique. Dans la méthode présentée ici, les molécules d’ADN sont pré-teint avec les colorants fluorescents et digérés par méthylation et enzymes de restriction sensibles non-méthylation.

Résumé

Visualisation de l’ADN pour la microscopie de fluorescence utilise une variété de colorants tels que colorants cyanine. Ces colorants sont utilisés en raison de leur grande affinité et la sensibilité pour l’ADN. Afin de déterminer si les molécules d’ADN pleine longueur à l’issue de l’expérience, une méthode est nécessaire pour déterminer si les molécules colorées sont pleine longueur par digestion de l’ADN avec des enzymes de restriction. Cependant, teinté d’ADN peut inhiber les enzymes, si une méthode est nécessaire pour déterminer quelles enzymes on peut utiliser pour fluorochrome ADN coloré. Dans cette méthode, l’ADN est coloré avec un colorant cyanine pendant la nuit pour permettre au colorant et l’ADN de s’équilibrer. Prochaine, vitrail de l’ADN est digéré par une enzyme de restriction, chargé un gel et PST1. Les bandes de digérer l’ADN expérimentales sont comparés à un digest en silico pour déterminer l’activité de l’enzyme de restriction. S’il y a le même nombre de bandes comme prévu, la réaction est terminée. Plus de bandes que prévu indiquent une digestion partielle et moins bandes indiquent une digestion incomplète. L’avantage de cette méthode réside dans sa simplicité, et il utilise un équipement qui aurait besoin d’un scientifique pour une enzyme de restriction de dosage et électrophorèse sur gel. Une limitation de cette méthode est que les enzymes disponibles pour la plupart des scientifiques sont disponibles dans le commerce ; Cependant, les enzymes de restriction pourrait être utilisés.

Introduction

La série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, 3-YOYO, POPO-3 et BOBO-3 ; Le tableau 1) est utilisé dans une grande variété d’expériences où la visualisation de l’ADN est nécessaire^{1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}. la famille de dimère de cyanine est largement utilisée en raison de leur rendement quantique, sensibilité et haute affinité pour l’ADN molécules^18,19,20. Cyanine dimère colorants ont grande sélectivité pour l’ADN bicaténaire et quand intercalés ont une augmentation de 100 à 1000 fois de fluorescence²¹. Pyridinium colorants (YOYO-1, TOTO-1, 3-YOYO et TOTO-3) ont une longueur d’onde d’émission plus courte que leur quinolium teindre (BOBO-1, 1-POPO, BOBO-3 et POPO-3) homologues (tableau 1)²². En outre, le rendement quantique de dimères de cyanine intercalés dans l’ADN est élevé (0,2 – 0,6)²². Cependant, utilisant une enzyme pour déterminer le profil de méthylation d’un ADN molécule² ou étirer²³ d’une molécule d’ADN déjà teintée avec colorant fluorescent requiert une méthode pour déterminer quelles enzymes digèrera ADN tachée. N’importe quel type de colorant qui s’intercale dans l’ADN ou de n’importe quel enzyme qui donne une tendance discernable du substrat de l’ADN peut être utilisé pour cette méthode.

Meng et al. détermina la vitesse de digestion de marqueur ADN par électrophorèse sur gel en utilisant une variété de différents colorants²⁴. Menad al puisé au plus profond à regarder la famille TOTO de colorants. Les deux détermine le taux de digestion de l’ADN colorée pour voir si les colorer avec un colorant donné l’ADN pourrait être digéré avec une enzyme de restriction²⁵. Autres méthodes étudient un effet contraignant des colorants intercalées avec de l’ADN à l’aide de pinces optiques²⁶ ou²⁷de la NMR. Les deux méthodes besoin d’équipement spécialisé ; considérant que, cette méthode permet aux appareils disposant de la plupart des laboratoires de biologie moléculaire pour déterminer si un colorant interfère avec une enzyme de restriction digestion.

En outre, dans d’autres méthodes pour mesurer la longueur d’une molécule donnée, cartographie optique a allongé les molécules d’ADN sans tache sur une surface et digéré l’ADN afin de déterminer l’étirement et la taille des fragments de. Intercalation de colorant a été montrée pour augmenter la longueur contour des molécules d’ADN fluorescent tachées et selon le colorant utilisé, les longueurs de contour sont différents²¹. Cette méthode a été utilisée dans une variété de génomes^{1,3,4,6,13,28,29,30, 31}. Toutefois, si les molécules ont été préalablement teintés, selon le colorant et l’enzyme, l’enzyme peut être pas capable de couper l’ADN teinté avec un colorant donné. Par conséquent, cette méthode détermine si les colorer avec un colorant donné l’ADN peut être digérée avec une enzyme. En outre, selon la concentration de la teinture et le colorant utilisé, la mobilité de l’ADN les bandes dans un gel vont migrer plus lentement que l’ADN natif en raison de la remise en cause partielle de l’épine dorsale de l’ADN pour faire place à la teinture à insérer entre les paires de bases³² .

Cependant, parfois ces colorants peuvent partiellement ou complètement inhibent l’action de certaines enzymes de restriction,^7,24. Ceci semble être dû à un changement structurel dans l’ADN provoqué par la fixation du colorant fluorescent, qui peut-être empêcher l’enzyme de reconnaître sa séquence spécifique. Peut aider à comprendre comment ces colorants affectent les enzymes de restriction dans les expériences où le profil de méthylation ou la portion d’ADN tachée est requise.

Dans notre méthode, l’ADN a été tachée avec un fluorochrome d’intérêt et digéré par une enzyme de restriction. Puis ADN était électrophorèse sur un gel, imagé, et a mesuré la vitesse de digestion d’enzymes de restriction. Les enzymes de restriction ont été choisis sur le modèle coupé sur un gel de la base. Trop de bandes causé le chevauchement des bandes d’ADN et trop peu de bandes ne donnaient pas une image complète de la molécule d’ADN. Il y a un sweet spot pour pouvoir déterminer le profil de la molécule d’ADN digéré ; par conséquent, il dépendra de l’ADN utilisé et l’enzyme. Un avantage de cette méthode réside dans sa simplicité ; Il suffit d’équipement utilisé dans une restriction digestion et gel d’électrophorèse.

Protocole

1. préparation de colorants, de tampons et de Gel d’Agarose

1. Préparer les solutions suivantes pour la coloration de l’ADN ou la digestion de l’ADN tachée.
   1. Préparer 1 x TE (Tris-HCl et EDTA acide ; Tampon à l’EDTA) aide 10 mM Tris-HCl et 1 mM d’EDTA dans un cylindre gradué ou une fiole jaugée. Conserver à température ambiante (18-25 ° C).
   2. Faire des parties aliquotes de chaque colorant : TOTO-1, YOYO-1, 1-POPO, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO, BOBO-3 (tableau 1). Distribuer 4 µL de colorant de 1 mM dans un ambre foncé ou noir 1,5 tube de mL et ajouter 36 µL de 1 x TE, mélanger à l’aide de la pipette ; Cette concentration permet une solution de colorant de 100 µM (total 40 µL). Terminer cette étape pour chaque colorant. Conserver à 4 ° C.
      Remarque : Évitez d’exposer la teinture à la lumière pour éviter le photoblanchiment ou dégradation du colorant.
   3. Préparer le tampon 1 à l’aide de Bis-Tris-Propane-HCl 10 mM, 10 mM MgCl₂et 100 µg/mL d’albumine sérique bovine (BSA). Préparer le tampon 2 à l’aide de 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl₂et 100 µg/mL de BSA. Préparer le tampon 3 utilisant 50 mM l’acétate de Potassium, 20 mM Tris-acétate, acétate de magnésium de 10 mM et 100 µg/mL BSA. Chaque enzyme exigera un de ces tampons spécifiques pour fonctionner.
2. Préparer les solutions suivantes pour l’électrophorèse sur gel.
   1. Fais un 6 x chargement teindre en combinant bromophénol 0.25 % bleu, 0,25 % de xylène cyanol, 15 % Ficoll dH₂O. magasin à la température ambiante.
   2. Pour faire un gel d’agarose 0,7 % gel, peser 0,07 g d’agarose élevée de la température (HGT) gélifiants pouvant être employés dans un erlenmeyer, ajouter 100 mL de tampon de x TAE 1 et placer un bécher inversé sur le dessus de la fiole.
      1. Chauffer la solution sur une plaque chauffante jusqu'à ce que les bulles commencent à se former sur le fond de la fiole et le flotteur vers le haut.
      2. Enlever la solution de la plaque chauffante, laissez le refroidir de solution jusqu'à ce que le ballon peut être touché à main nue, puis verser le gel dans un moule de gel de 24,5 cm x 21,8 cm avec un peigne de gel pour créer des puits.
      3. Retirer les bulles près le peigne ou sur la surface du gel en leur faisant éclater avec un embout de la pipette et laisser le gel se solidifier pendant au moins 15 minutes. Cela peut être stocké dans un réfrigérateur (4 ° C) enveloppé dans une pellicule plastique pour 1 semaine pour éviter le dessèchement du gel ou contamination. Pour plus d’informations sur la façon d’exécuter un gel voir Lee et al. ³³ .
         NOTE : Utiliser un peigne de gel avec 30 puits individuels. Chacun doit bien être 4,5 mm de large avec une profondeur de 2 mm. La hauteur du puits dépendra de la quantité de gel dans la boîte.
   3. Préparer 1 tampon de x TAE (Tris - acétate - EDTA) à l’aide de 40 mM Tris-HCl, l’acide acétique 20 mM et 1 mM EDTA. Conserver à température ambiante (18-25 ° C).

2. préparation de l’ADN coloré

1. Tache d’ADN de lambda (300-800 ng) en utilisant différentes parties aliquotes de colorants. Chaque colorant (tableau 1) aura six différentes concentrations testées, pour un total de 48 réactions par enzyme de restriction. Le processus suivant décrit un ensemble vers le haut pour 1 réaction (Figure 1).
   1. Diluer l’ADN de lambda à l’aide de 1 x TE à 100 ng / µL. stocker à 4 ° C. Préparez une solution avec un volume total de 300 µL.
   2. Tache d’ADN non méthylé lambda. Pour chaque tranche, prévu par la digestion, estimer les 75 à 100 ng/band. Ajouter une quantité appropriée de colorant pour produire des concentrations de 1,9 µM, 3,8 µM, 19,4 µM, 32,2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM / 100 ng d’ADN.
   3. Incuber pendant la nuit (15 h - 18 h) à 4 ° C.
   4. Laisser une réaction non souillées enregistrée pour agir comme un contrôle²⁵.
      Remarque : Utiliser l’ADN non méthylé pour la réaction de la digestion. Méthylation enzymes sensibles ne peuvent pas couper des régions méthylées de l’ADN et donneront une apparence d’une digestion incomplète.

3. préparation de l’essai de l’Enzyme de Restriction

1. Digérer l’ADN coloré avec une enzyme de restriction afin de déterminer si cette enzyme peut digérer marqueur ADN (Figure 1).
   1. Le lendemain, ajouter 20 U de l’enzyme de restriction, 3 µL de tampon appropriée (tableau 2) et l’eau distillée, stérilisés à l’autoclave et filtrée pour un total de 30 µL. Pour chaque réaction enzymatique, choisissez le tampon avec la plus grande efficacité de coupe, qui se trouve sur le site du constructeur.
   2. Placer les réactions dans un bain d’eau à la température de l’activité enzymatique optimale, figurant au tableau 2 pour les 6 enzymes utilisées dans menad et al., pour 2-4 h (tableau 2)²⁵.
   3. Arrêter la réaction en ajoutant 2 µL de 0,5 M EDTA pH 8.0.

4. Electroeluting l’ADN dans un Gel coloré

1. Enlever les côtés du moule de gel de 24,5 cm x 21,8 cm (étape 1.2.2) et placer le gel dans la boîte de l’électrophorèse sur gel. Dans la boîte, verser 2,5 L de 1 x TAE tampon. Retirer soigneusement le peigne de gel du gel, alors que les puits sont accessibles³³.
2. Déposer les réactions de l’enzyme de restriction sur un film plastique et combiner chaque réaction 6 x chargement colorant. Pour chaque solution de réaction, ajouter 1 µL de 6 x colorant par 5-6 µL de solution d’ADN (1 x) de chargement. Déposer ensuite les réactions (contenant le colorant de chargement, < 18 µL) dans les puits.
3. Mélanger 1 µL d’échelle 1 kb, 9 µL de TE 1 x et 2 µL de 6 x chargement colorant. Chargez la solution dans les puits qui flanquent les autres solutions.
4. Couvrir la zone de gel foncé bleu ou noir papier ou de tissu. Raccorder le boîtier de gel sur une alimentation, définissez l’alimentation à 30 V et exécutez-le pendant la nuit (15-20 h). Éteindre les lumières pendant que le gel fonctionne, pour empêcher les photoclivage de l’ADN marqué.
5. Le lendemain matin couper l’alimentation. Prendre le gel à l’aide de la barre d’État et le transférer dans un récipient avec 45 du bromure d’éthidium µL et 1 L de 1 x TAE tampon. Stocker le bac à température de la pièce dans l’obscurité ou le couvercle en aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Laisser le gel teinté pendant au moins 45 min à température ambiante.
   ATTENTION : Utiliser du bromure d’éthidium avec gants et lunettes de sécurité. Lorsque vous nettoyez le bac contenant la solution de bromure d’éthidium et jeter le gel, consulter vos directives de disposition États pour déterminer comment traiter avec du bromure d’éthidium usagés ; en outre, les autres taches peuvent être utilisées au lieu de bromure d’éthidium.

5. imagerie du Gel d’Agarose

1. Placer le gel sur le dessus un Transilluminateur de lumière bleu, qui émet une puissance lumineuse maximale entre 400-500 nm. Prendre des photos avec l’appareil photo connecté à la station.
   ATTENTION : Veillez à utiliser la couverture de l’illuminateur et chaussez des lunettes de protection avant d’allumer la source de lumière.
   Remarque : Cette étape peut également être complétée à l’aide de toute source de lumière UV ou gel standard scanner.
2. Voir toutes les photos dans ImageJ en faisant glisser le fichier dans la barre d’État ImageJ et l’image apparaîtra.
3. Déterminer le taux de digestion pour l’expérience en comparant les bandes sur le gel vers le modèle de gel prévu en silico . Pour déterminer le taux de digestion, le nombre de bandes expérimentales est divisé par le nombre moyen d’ADN bandes^24,25. Si le patron de bandes ADN digéré expérimental a le modèle prévu, le taux de digestion est 1. Si le modèle a des fragments de plus que prévu, le taux de digestion est supérieur à 1. Si le modèle a des fragments de moins que prévu, le taux de digestion est inférieur à un.

Résultats

Afin de déterminer que si un colorant intercalant affectera une enzyme de restriction digestion de l’ADN, l’ordre correct des étapes doit être suivies (Figure 1). Une fois que l’ADN est tachée et digéré par une enzyme donnée, une image du gel peut être prise pour déterminer le nombre de fragments et leur taille (Figure 2). Afin de déterminer l’efficacité de l’enzyme, le nombre total de bandes visibles attendu...

Discussion

Pour digérer l’ADN fluorescent étiquetés (Figure 1), une série d’étapes sont nécessaires. Tout d’abord, l’ADN est taché avec un fluorochrome du jour au lendemain. L’ADN peut être incubée avec dimères de cyanine pendant une courte période de temps ; Cependant, Carlsson et al a conclu que les ADN créé doubles bandes pour chaque taille d’ADN en raison de la coloration incomplète²⁰. Pour remédier à cela, l’ADN peut ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unmethylated lambda DNA	NEB	N3013S
YOYO-1	ThermoFisher Scientific	Y3601
TOTO-1	ThermoFisher Scientific	T3600
POPO-1	ThermoFisher Scientific	P3580
BOBO-1	ThermoFisher Scientific	B3582
YOYO-3	ThermoFisher Scientific	Y3606
TOTO-3	ThermoFisher Scientific	T3604
POPO-3	ThermoFisher Scientific	P3584
BamHI	NEB	R0136S
PmlI	NEB	R0532S
ScaI	NEB	R3122S
EcoRI	NEB	R0101S
HindIII	NEB	R0104S
SmaI	NEB	R0141S
Tris	Fisher	BP152-1	Irritant
EDTA	Fisher	S316-212	Toxic
HCl	Fisher	S25358	Corrosive and irritant
Buffer 1	NEB	B7201S	NEB 1.1
Buffer 2	NEB	B7202S	NEB 2.1
Buffer 3	NEB	B7204S	NEB Cutsmart
High gelling temperature agarose gel	Lonza	50041
Acetic Acid	Fisher	S25118	Hazardous
Blue light transilluminator	Dark Reader	DR196	Wear correct eyewear
Ethidium bromide	Fisher	15585011	Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.
Cannon EOS Rebel T3I camera	Cannon
Apogee Model H4	Biorad	1704510
Power Pac Basic Power Supply	Biorad	1645050
Ficoll	Fisher Scientific	BP525-25
Bromophenol blue	Fisher Scientific	B-392
Xylene Cyanol	Eastmen	T1579