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Resumen

Un protocolo para el tiempo de ionización desorción láser asistida por matriz de caracterización de la espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) de los polímeros sintéticos se describe como la optimización de la preparación de muestras, adquisición espectral y análisis de datos de vuelo.

Resumen

Hay muchas técnicas que pueden emplearse en la caracterización de los homopolímeros sintéticos, pero pocos proporcionan útiles de información para el análisis de grupo final como el tiempo de ionización de desorción láser asistida por matriz de espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF MS). Este tutorial muestra los métodos para la optimización de la preparación de muestras, adquisición espectral, y análisis de datos de polímeros sintéticos utilizando parámetros de MALDI-TOF MS. crítico durante la preparación de la muestra incluyen la selección de la matriz, identificación de una sal de embargo correspondiente y ajuste las proporciones relativas de la matriz, el catión y el analito. Los parámetros de adquisición, como el modo (lineal o reflector), polarización (positivo o negativo), voltaje de aceleración y tiempo de retardo, también son importantes. Teniendo en cuenta algunos conocimientos de la química para sintetizar el polímero y la optimización de los parámetros de adquisición de datos y las condiciones de preparación de muestra, espectros deben obtenerse con suficiente resolución y exactitud total para permitir la clara determinación de los grupos de final de la mayoría homopolímeros (masas por debajo de 10.000) además de la unidad de repetición masa y la distribución de peso molecular general. Aunque demostró en un conjunto limitado de polímeros, estas técnicas generales son aplicables a una gama mucho más amplia de polímeros sintéticos para determinar distribuciones de masa, aunque final Grupo determinación sólo es posible para los homopolímeros con estrechas dispersity.

Introducción

Con mejoras en la vida de técnicas de polimerización, polímeros de precisión con grupos finales cuantitativamente funcionalizados son cada vez más disponibles1. El desarrollo concurrente de azida-alquino y thiolene haga clic en química ha permitido el acoplamiento casi cuantitativo de macromoléculas en otras partes, de facilitar el acceso a una gama de híbridos de materiales2,3,4 . Sin embargo, técnicas analíticas precisas están necesario caracterizar la partida materiales y productos de estas reacciones de conjugación de polímero. Tiempo de desorción/ionización láser asistida por matriz de espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF MS) es una técnica analítica de ionización suave valiosos para la caracterización de polímeros porque puede generar iones de polímero en un estado de carga solo con un mínimo fragmentación5,6. MALDI-TOF MS tiene grandes ventajas sobre otros métodos convencionales de caracterización de polímeros porque puede proporcionar espectros de masas con la resolución del n-mers individual dentro de la distribución en masa del polímero. En consecuencia, tales espectros de masas puede proporcionar información precisa sobre el peso molecular promedio, repita la unidad de masa y peso molecular dispersity7, que a su vez puede dilucidar mecanismos de polimerización que compiten como transferencia de cadena8 . Sin embargo, MS de MALDI-TOF es particularmente potente en proporcionar información sobre el polímero final grupos9,10, que puede utilizarse para confirmar fin grupo modificaciones10,11 y otros transformaciones12 como polímero cyclizations11,13. Igualmente importante, la relativamente pequeña cantidad de analito (sub-microgramos) necesaria para la espectrometría de masa análisis hacen esta técnica útil para la caracterización cuando solamente cantidades de rastro de material están disponibles.

El análisis del MS de MALDI-TOF de polímeros se pueden dividir en cuatro pasos distintos: preparación, calibración del instrumento, adquisición espectral y análisis de los datos de la muestra. Preparación de la muestra es el paso más esencial para la generación optimizada de espectrometría de masas MALDI-TOF y se produce antes de la muestra se introduce en el instrumento14,15. La selección de una matriz correspondiente con los parámetros de solubilidad similares como el analito de polímero es fundamental para obtener espectros de masas de MALDI-TOF de alta calidad y las directrices para la selección de la matriz se han divulgado a otra parte14,15, 16,17. Una base de datos de polímero MALDI "recetas" para la preparación de la muestra también ha sido publicado en línea18. Para los nuevos polímeros, selección de matriz puede ser abordado entendiendo la solubilidad del polímero y selección de una matriz con similares parámetros de solubilidad14,19. Polímeros con afinidad alta protón pueden ser protonado por mayoría matrices14 (que con frecuencia contienen grupos de ácido carboxílico), pero para otros polímeros, un agente de embargo es necesario14. Los iones álcali aducción con oxígeno-que contienen especies (ej. poliésteres y poliéteres), mientras que hidrocarburos insaturados (por ejemplo. poliestireno) aducción con metales de transición como los iones de plata y cobre14, 19. porque las muestras de polímero en este experimento contenían átomos de oxígeno en la columna vertebral, trifluoroacetate del sodio o del potasio (TFA) fueron utilizados como el agente del embargo. Una vez que los agentes de matrix y el embargo han sido seleccionados, las proporciones relativas de analito, agente catiónico y matriz deben optimizarse cuidadosamente para asegurar alta señal a ruido. En este procedimiento, los parámetros para la preparación de la muestra ya se han optimizado, sin embargo un procedimiento de optimización empírica muestra (paso 1.4.1., figura 1) que varía sistemáticamente las concentraciones de los tres componentes (analito, matriz y el catión) es eficaz para determinar rápidamente su relación óptima.

Adquisición de datos también requiere la optimización de un número de parámetros. Los parámetros más importantes son el modo de iones positivos o negativos del espectrómetro, el modo de operación del instrumento (lineal versus reflector), el voltaje de aceleración y el tiempo de retardo de extracción. Otra forma que se puede aumentar la resolución es mediante la utilización de "reflectron" modo20,21,22,23. El modo Reflectron esencialmente duplica la trayectoria de los iones al detector reflejando los iones en el extremo del tubo de vuelo hacia un detector cerca de la fuente mientras que reenfoque iones con diferentes momentos, y por lo tanto aumentando la resolución aunque disminución de la intensidad de señal. Además, pueden obtenerse espectros de resolución mayor al disminuir la potencia del láser que reduce al mínimo la relación señal a ruido por disminuir el número y energía de las colisiones y por lo tanto reduciendo la fragmentación y la cinética inhomogeneidades24. Templando todos estos parámetros, los iones pueden ser enfocados para minimizar el efecto de cualquier inhomogeneidad en posición inicial o velocidad que se produce durante el proceso de desorción láser. Cuando se optimizan los parámetros de adquisición, resolución isotópica a menudo se logra para los iones con masas superiores a 10.000 Da, aunque también esto depende de la longitud del tubo de vuelo y el diseño del instrumento. Los compuestos más orgánicos que contienen al menos un heteroatom son propensos a la formación de complejos con cationes alcalinos tales como litio, sodio y potasio. Muchos de los metales alcalinos son monoisotopes o de isótopos limitadas y por lo tanto no ampliar la distribución.

Mientras que los parámetros del instrumento pueden ajustarse para optimizar la precisión de los datos, exactitud de los datos sólo se logra con una calibración adecuada11. Proteínas y péptidos fueron utilizados originalmente como calibradores debido a su monodispersity y disponibilidad, pero sufren de estabilidad variable y la prevalencia de las impurezas25. Alternativas más rentables y estables han incluido grupos inorgánicos y polidispersas polímeros26,27,28,29. Desafortunadamente, estas características alternativas dispersar a las masas, que complican las asignaciones totales, así como masas más pequeñas en general, haciéndolos útiles sólo para calibraciones por debajo de 10.000 Da. Para combatir estos problemas, Grayson et al. 25 desarrolló un sistema de calibración MS dendrímero-base de poliéster que es monodispersa y cuenta tanto matriz amplia y solvente compatibilidad, estabilidad de vida útil (> 8 años) y menor costo de producción. Basado en las fortalezas de este sistema, fue seleccionado como calibrant para estos experimentos.

Hay dos tipos de calibración: interna y externa30. Cuando calibrar externamente, un estándar con las masas que soporte que el analito se colocan en la placa MALDI de destino en condiciones diferentes de la muestra de analito para generar el espectro de masa separado de la que se puede generar un archivo de calibración. Por otro lado, a menudo puede conseguirse mayor precisión con una calibración interna, que consiste en mezclar el calibrant con el analito para obtener un espectro híbrido con señales calibrant y analito. En el procedimiento descrito a continuación, se aplicó una calibración externa. Después de la calibración adecuada de la escala total, pueden ser adquiridos datos masa de analito precisa. Para asegurar la calibración más precisa, es importante que la adquisición de datos se produce poco después de la calibración.

Finalmente, una vez calibrado el optimizado, los conjuntos de datos fueron adquiridos, y los datos fueron analizados para proporcionar información estructural sobre las muestras de polímero. La distancia entre n-mers dentro de la distribución del polímero puede proporcionar una medición precisa de la unidad de repetición masiva. Número peso molecular promedio (Mn) y otros cálculos de distribución de masa (p. ej., Mw (peso molecular promedio en peso) y Đ (dispersity)) también puede ser determinado de la distribución de señal en los espectros de masas ( Paso 4.2 para los cálculos). Tal vez más excepcionalmente, en el caso de los homopolímeros, la suma de las masas del grupo extremo puede confirmarse determinando el desplazamiento de la distribución de polímeros con respecto a la masa de las unidades que se repiten solo. Los espectros de masas de MALDI-TOF de ricos en información proporcionan datos de caracterización valiosa que son complementarios a los tradicionales técnicas de caracterización de polímeros como la cromatografía por exclusión de tamaño, espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier, y resonancia magnética.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Todas las reacciones fueron funcionadas en una campana de humos. Por favor lea todo Material de seguridad datos hojas (MSDS) para cualquier producto químico utilizado y tomar las precauciones apropiadas.

1. preparación de la muestra

  1. Preparación de las soluciones stock de matriz
    1. Disolver 20 mg de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA) en 1 mL de tetrahidrofurano-desestabilizaron (THF) y agitar hasta que se disuelva.
    2. Disolver 20 mg de ácido 2, 5-dihydroxybenzoic (DHB) en 1 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.
  2. Preparación de la solución madre de cationes alcalinos
    1. Disolver 2 mg de sodio trifluoroacetate (NaTFA) en 1 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.
    2. Disolver 2 mg de potasio trifluoroacetate (KTFA) en 1 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.
  3. Preparación de soluciones stock de analito
    1. Muestra 1: Disolver 2 mg de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) en 0.5 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.
    2. Ejemplo 2: Disolver 2 mg de bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000) en 0.5 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.
    3. Muestra 3: Disolver 2 mg de poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) en 0.5 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.
  4. Preparación de mezclas de muestra para análisis
    1. Preparar una serie de soluciones mediante la mezcla de matriz, analito y cationes de la solución y variando las proporciones relativas de los componentes que se hacen mezclas de nueve muestras únicas. Por ejemplo, mantener la cantidad constante de solución matriz agregada (e.g., 10 μl), variar la cantidad de solución del analito por un factor de tres (e.g., 45, 15 y 5 μl), mientras que también varía la cantidad de catión solución por un factor de tres (por ejemplo, ., 9, 3 y 1 μl). Estas muestras rendir con eficacia una cuadrícula de 3 x 3 de las muestras con las dos variables de diferente concentración en x e y ejes (figura 1).
    2. Para el ejemplo, combinar 15 μl de la solución de poly(L-lactide), con 15 μl de la solución DHB y 1 μl de la solución de NaTFA.
    3. Pipetee 1 μL de cada mezcla de la solución en una muestra individual en la placa de la blanco MALDI (figura 2). Añadir las muestras progresivamente en pequeñas porciones para evitar que la muestra fluya fuera del pozo de la muestra, permitiendo que cada alícuota se evapore a sequedad antes de agregar la muestra adicional.
      Nota: Para disolventes de punto de ebullición más alto, un rifle de aire puede ser necesario para acelerar la evaporación de solvente, aunque se debe tener precaución para evitar el calentamiento de la placa de la muestra, que pudo causar la placa a la deformación.
  5. Preparación de muestras estándar para calibración
    1. Preparar los estándares de calibración usando el protocolo del proveedor sugerido.
      Nota: Dendrímero calibradores se seleccionaron para este estudio y están disponibles como los dendrímeros puro o premezclan con matriz, calibrant y catión relaciones optimizadas.

2. optimización de la adquisición de datos

  1. Iniciar la adquisición de datos
    1. Software de adquisición de datos "FlexControl".
    2. Expulsión de la plataforma para permitir la carga de la placa de objetivo pulsando el "figure-protocol-3577" botón.
    3. Coloque suavemente la placa objetivo con las muestras calibrant y analito cargadas en la plataforma en la orientación adecuada.
    4. Utilice el software de adquisición para inyectar la placa de la blanco en la plataforma presionando el "figure-protocol-3907" otra vez el botón.
    5. Seleccione un método de adquisición de datos adecuados (método de adquisición de modo positivo) pulsando archivo | Seleccione el método de.
      Nota: Para la mayoría de las muestras de polímero, incluyendo nuestros analitos representativos, ionización se espera que a través de la complejación con un catión y por lo tanto, es más apropiado un método de adquisición de modo positivo. Dependiendo del instrumento, para rangos de masa baja (500-10.000 Da) o cuando se desea una mayor resolución, seleccione un archivo de método de modo de reflector. De peso molecular más alto muestras o cuando mayor sensibilidad de la señal es necesaria y baja resolución es aceptable, seleccione un archivo de método de modo lineal.
    6. Antes de adquirir datos, asegúrese de que un rango de masa apropiado de recogida de datos está seleccionado-la gama total incluirá la mitad de la masa más baja en la distribución esperada así como doble la masa más alta en la distribución esperada. Comprobar esto haciendo clic en la ficha detección y Masa de gamade la visión.
      Nota: Esto ayuda a asegurar esa señal de fragmentos de degradación de bajo peso molecular o agregados de peso molecular más alto (dimer) que pueden estar presentes en la muestra se incluyen en el conjunto de datos. También, tenga en cuenta que los oligómeros de matriz se notan con frecuencia con intensidades de señal alta en mayoría espectros de masas de MALDI-TOF, con ruido de masas tan altas como 1.000 Da, que complica análisis por debajo de esta masa. Aunque la calibración se requerirá antes de obtener un conjunto de datos final, un archivo de calibración de precisión puede solamente ser adquirido si se usan parámetros de adquisición idénticos que optimizado para el analito particular. Por lo tanto, es necesaria una optimización preliminar del espectro de masa del analito antes de la calibración, seguida por la readquisición de un espectro de masa del analito calibrado.
  2. Adquisición de datos preliminares
    1. El software de adquisición, seleccione la posición en la placa de la blanco que corresponde al analito deseado.
    2. Iniciar recolección de datos mientras se mueve el objetivo de láser alrededor de la muestra para maximizar la señal. Para iniciar la recolección de datos, presione Start.
      Nota: El láser puede agotar la matriz en un lugar determinado después del muestreo repetido.
    3. Utilizando la barra deslizante en el lado izquierdo de la ventana de la cámara, ajustar la potencia del láser tal que la energía mínima necesaria para lograr resolución isotópica se logra.
      Nota: Al analizar varias muestras para confirmar la relación óptima de analito, cación y matriz, utilice la misma energía del laser en cada una de las muestras del analito a determinar que muestra exhibe la mejor relación señal/ruido para los parámetros de adquisición. Continuar con la optimización de la adquisición en el futuro con la muestra que presentan la mejor relación señal a ruido.
  3. Optimización de la adquisición de datos
    1. Zoom un pico individual en medio de la gama total de interés, optimizar la resolución ajustando la diferencia de voltajes de aceleración (para los instrumentos en este estudio, se trata de ajustar el valor de «IS2»), que está en el espectrómetro tab.
      Nota: Esto es más rápido optimizado variando el valor de IS2 en grandes pasos, tomando nota de que el valor genera la mejor resolución (es decir., el más pequeño completo anchura del pico a media intensidad máxima de la señal) y luego optimizar más en pasos más pequeños de el valor de IS2. Normalmente, el valor óptimo de IS2 es mayor (cerca de IS1) polímeros de masa baja y baja de altos polímeros masa.
    2. Si lo desea, aumentar la resolución con modo reflectron.
      Nota: Modo Reflectron permite la compensación de las discrepancias en la velocidad inicial de iones de la misma m/z por obligar a los iones de velocidad más alto del mismo valor de m/z en un camino más largo para el detector. Este aumento en camino hacia el detector permite iones más lento del mismo valor de m/z para llegar al detector al mismo tiempo, centrándose con eficacia los iones de mayor resolución. Aunque el modo reflectron normalmente mejora la resolución de la señal, para muestras con intensidad de señal débil, modo lineal podría ser necesario para poder visualizar los datos.
    3. Por último, optimizar la energía láser reduciendo la potencia del láser tan baja como sea posible mientras que todavía genera una razonable relación señal a ruido (e.g., señal de ruido de aproximadamente 10).
      Nota: Debido a mayores potencias de láser generalmente reducen la resolución y pueden inducir fragmentación, los espectros de masas con la mejor calidad son adquiridos mediante láser de menor potencia pero mayor número de exploraciones.
    4. Una vez que se optimizan los parámetros de adquisición, guardar los espectros de masas sin calibrar seleccionando archivo y luego Guardar espectro archivo como. Para la calibración externa, una nueva adquisición de calibrant bajo estos parámetros idénticos, optimizados debe realizarse antes de inicia una nueva adquisición para generar el espectro de masas calibrado del analito.

3. MALDI calibración

  1. Adquisición de espectro de masas de calibración
    1. Utilizando los parámetros de adquisición ya optimizados para el analito, adquirir un espectro de masas optimizado de la muestra de masa estándares.
      Nota: Idealmente, el sistema de calibración debe incluir una norma por encima del rango de interés, uno por debajo y al menos uno en el rango de interés. La exactitud de la calibración es mejor si todos los parámetros de adquisición son idénticos para ambas muestras.
  2. Crear un archivo de calibración
    1. Asegúrese de que cualquier calibración existente se anula o en una posición para sobrescribir presionando Calibración invalida en el espectrómetro de la lengüeta.
    2. Utilizando los mismos parámetros de adquisición (e.g., laser de potencia, voltaje de IS2), mueva el láser sobre para la muestra que contiene el calibrant (e.g., dendrímero estándar, péptido) seleccionando el correspondiente bien con el cursor y adquirir un espectro pulsando iniciar.
  3. Una vez que se ha adquirido suficiente señal, presione iniciar para terminar adquiriendo datos.
  4. Una vez que se ha adquirido un espectro de masas de la calibrant, seleccione el menú desplegable de La lista de Control de masa en la ficha de calibración que corresponde a ese estándar de calibración. La lista de control de masa apropiada tendrán las masas referencia de calibrant seleccionado con el catión correspondiente.
    Nota: Estos deben ser directamente del proveedor de calibrant y asegúrese de utilizar los valores de masa de monoisotopic cuando se logra resolución isotópica (e.g., modo de reflector debajo de m/z = 5000), y una masa media valores cuando resolución isotópica no se puede lograr (por ejemplo, modo lineal sobre m/z = 5000),
  5. Antes de que el pico de referencia correspondiente a cada pico calibrant seleccionado, asegúrese de que se está utilizando un pico adecuado protocolo de selección seleccionando la ficha de proceso .
    Nota: Protocolos de recolección de pico pueden variar en base a la resolución espectral. Para un cálculo promedio de masa, el software debe tomar el promedio de masa a través de toda la serie de picos isotópicos. Para un cálculo de masa de monoisotopic, el software debe establecerse para calcular la masa exacta de sólo el primer pico isotópica.
  6. Aplicar la masa de referencia de la lista de control de masas a la señal correspondiente para el espectro de masas calibrant seleccionando el área a la izquierda del pico de interés y luego haciendo clic en la masa correspondiente en la lista de control a aplicar. Continuar con el proceso para las restantes cumbres calibrant.
    Nota: Para calibrar más exacto y preciso, coloque las muestras del analito y calibrant tan juntos como sea posible en la placa de la blanco, debido a sutiles variaciones de altura de placa de destino pueden afectar la exactitud de la calibración.
  7. Una vez que la escala masiva de los parámetros de adquisición optimizados han sido calibradas a adquirir el espectro del analito.

4. interpretación y análisis de datos

  1. Pico de cosecha
    1. Abrir el espectro del analito en el software de análisis de datos (FlexAnalysis).
    2. Ampliar un pico para identificar si resolución isotópica se ha conseguido seleccionando el botón de Zoom de X .
    3. Presione masa lista | Encontrar para seleccionar picos. Si el pico de monoisotopic se resuelve, seleccione este primer pico en la distribución isotópica para determinar su masa monoisotopic peak-picking en protocolos. Si no se resuelve el pico monoisotopic, utilizar un pico de masa media selección protocolo y determinar la masa media de toda la distribución isotópica.
    4. Continuar este pico recogiendo el proceso para cada n-mer en la distribución del polímero.
  2. Cálculos de análisis de polímero caracterización y final Grupo
    Nota: Cuando se usa correctamente, MALDI-TOF MS puede proporcionar datos valiosos y precisos para el cálculo de la distribución en masa de polímeros. Cabe señalar que datos de la distribución en masa sólo están exactos cuando la Dispersidad de la muestra de polímero es relativamente baja (por ej., aproximadamente Đ= 1.3 o inferior).
    1. Calcular el peso molecular promedio en número, la media masa con respecto al número de moles de cada fracción de masa, utilizando la fórmula:
      figure-protocol-14153
      donde N = número de moléculas de peso molecular específico y M = peso molecular específico de aquellas moléculas.
    2. Calcular el peso molecular promedio peso, la masa media en relación con el peso de cada fracción de masa, utilizando la fórmula:
      figure-protocol-14539
      donde N = número de moléculas de peso molecular específico y M = peso molecular específico de aquellas moléculas.
    3. Una vez que ha calculado la Mw y Mn , cuantificar la amplitud de la distribución de peso molecular usando la relación Mw/Mn que se llama dispersity, Đ.
    4. La característica más singular y potente de análisis de datos del MS de MALDI-TOF es la capacidad de determinar o confirmar los grupos finales de homopolímeros. Determinar el grupo final de reorganización de la siguiente fórmula para la masa observada de un n-mer en el espectro de masas (Mn-mer):
      Mn-mer = n (MRU ) + MEG1 + MEG2 + Mion
      donde n = grado de polimerización,
      MEG1 = masa del grupo α-final
      MEG2 = masa del grupo final de ω,
      MRU = masa de la unidad de repetición del polímero,
      y Mion = masa del ion que complejos con el polímero.

Resultados

Ejemplo 1: Una muestra de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) (figura 3) se analizó mediante trifluoroacetate de potasio como agente embargo HCCA como matriz. El espectro exhibió el esperado K+ aductores así como ésos observados de residual Na+.

MALDI-TOF MS confirma la distribución estrecha (figura 3) de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000). Porque el pico de monoisotopic (comprende exclusivamente los más abundantes isótopos elementales, es decir, 12C, 1H 16O y 14N) no es suficientemente resuelto permitir su identificación, se utiliza un protocolo de enarbolar de selección que determina la masa promedio en toda la distribución isotópica de cada pico de n-mer. Además, todos los cálculos teóricos se determinan media, en lugar de monoisotopic, masas para cada elemento. Usando las ecuaciones del paso 4, software de análisis fue utilizado para calcular las siguientes características de la distribución masiva de polímero: Mn: 4700, Mw: 4710, Đ: 1.00.

Con el fin de confirmar la identidad de los grupos finales, un n-mer individual (104) fue seleccionado para su posterior análisis (figura 4). Como con los cálculos de la distribución en masa, porque no pudo resolver el pico monoisotopic, valores promedio de masa fueron utilizados para los cálculos posteriores. El valor teórico de la masa de la 104-mer de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter ácido acético está conformado por la masa de las unidades de repetición (44.0530 × 104) más la masa del grupo α-amino final (+ 16.02300) y la masa del grupo carboxilo ω final (+ 59.0440) además de la masa del catión potasio (+ 39.09775) que produce una masa total 104-mer de 4695.67675. El valor observado de la masa de la 104-mer + K+ es 4695.5 que coincide con el valor teórico, dado la precisión de los cálculos de masa promedio. La serie de picos más pequeños, desvío en el espectro corresponde al polímero de ionización con sodio donde el valor teórico de la masa de la 104-mer está conformado por la masa de las unidades de repetición (44.0530 × 104) más la masa del grupo α-amino final (+ 16.02300) además de la Misa de grupo carboxilo ω final (+ 59.0440) más la masa de los cationes de sodio (+ 22.98922) dando una masa total 104-mer de 4679.56822. El valor observado de la masa de la 104-mer + Na+ es 4679.4 que es de sólo 0.2 Da diferente del valor teórico. Determinaciones más precisas de final del grupo masa puede determinarse midiendo la media a través de múltiples picos y ha sido discutido en otra parte11.

El poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) muestra mantiene su estrecha distribución cuando functionalized selectivamente por la reacción (figura 5) con 2, 4-dinitrofluorobenzene (DNFB) (figura 6). El sodio espectro expuesto aductos y utiliza HCCA como matriz.

MALDI-TOF MS confirma la distribución estrecha (figura 6) de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) cuando modifica con DNFB. Usando las ecuaciones del paso 4, software de análisis fue utilizado para calcular las siguientes características de la distribución masiva de polímero: Mn: 4940, Mw: 4950 Đ: 1.00.

Para determinar si la funcionalización de la poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) había ocurrido con DNFB, un n-mer individual de la distribución fue seleccionado para el análisis (figura 7). La masa teórica de la 104-mer funcionalizado de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético ácido reaccionado con 2, 4-dinitrofluorobenzene se compone de 44.0530 × 104 (la masa de las unidades de repetición) + 182.115 (masa del grupo α-amino reacciona con 2, 4 - dinitrofluorobenzene) 59.044 (masa del grupo carboxilo) + 22.98922 (masa del catión sodio) = 4845.66022. El valor observado n = 104 es 4845.8 que es -0,1 Da diferente del valor teórico. Este acuerdo estrecha entre los valores teóricos y observados es indicativo de una modificación completa del material de partida al producto, pero más significativamente, la falta de señales asociadas con el material de partida, 4811.72722 y 4855.78022 para esto intervalo de masa o cualquier subproductos adicionales confirma la funcionalización selectiva cuantitativa de la amina. Se observa un segundo pico en el 4823.8 que coincide con el 103-mer de los polímeros funcionalizados, pero con la pérdida del protón del ácido carboxílico final grupo que complejos con otros iones de sodio con una masa teórica de 4823.58899 que tiene diferencia de -0.2 Da.

Ejemplo 2: Una muestra de bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000) (figura 8) se analizó mediante sodio trifluoroacetate como embargo y HCCA como matriz y sólo exhibió la esperada Na+ aductores.

Debido a la resolución alcanzada en esta gama de masa más baja, los picos de monoisotopic para cada uno de lo n-mers podrían resolverse fácilmente, y así un pico de monoisotopic selección protocolo fue seleccionado (con un promedio de sólo la señal de masa del primer pico en la distribución isotópica ) y todos los cálculos correspondientes utilizaron el monoisotopic las masas de cada elemento. MALDI-TOF MS confirma la distribución estrecha (figura 8) de bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000). Usando las ecuaciones del paso 4, software de análisis fue utilizado para calcular las siguientes características de la distribución masiva de polímero: Mn: 1940, Mw: 1950, Đ: 1.01.

Para confirmar el final Grupo funcionalización, fue seleccionado un individuo n-mer (42) (figura 9). Como con las distribuciones de masa determinada anteriormente, las masas monoisotopic fueron utilizadas porque los picos monoisotopic fueron bien resueltos en la distribución isotópica de cada n-mer. El valor teórico de la 42-mer de polioxietileno bis(azide) corresponde a 44.02621 × 42 (la masa de las unidades de repetición), 42.00922 (masa del grupo azido final), 70.04052 (masa del grupo final azidoethyl) + 22.98922 (masa del catión sodio) = 1984.13978. El valor observado n = 42 es 1983.95 que es diferente del valor teórico 0.19 Da. Cabe señalar que especialmente en energías más altas de láser, la funcionalidad azida puede exhibir fragmentos metaestables; sin embargo, esto no se observó en este caso específico31.

La bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000) muestra mantiene su estrecha distribución cuando functionalized selectivamente por una reacción de cicloadición de azidas catalizada cobre-alquino (figura 10) con 1-ethynyl-4-fluorobenzene(EFB) ()Figura 11) para un grupo de 4-fluorophenyltriazolyl (FPT). Los espectros exhibieron la esperada Na+ aductos de utilizar sodio trifluoroacetate como embargo y HCCA como la matriz.

MALDI-TOF MS confirma la estrecha distribución ()figura 11) de bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000) después de funcionalización con EFB. Usando las ecuaciones del paso 4, software de análisis fue utilizado para calcular las características del polímero siguientes: Mn: 2240, Mw: 2250, Đ: 1.00.

Para confirmar el funcionamiento completo de la muestra, las masas monoisotopic se usaron para analizar un seleccionado n-mer individual (42) (figura 12). El valor teórico de la 42-mer de polioxietileno bis(azide) reaccionó con 1-ethynyl-4-fluorobenzene corresponde a 44.02621 × 42 (la masa de las unidades de repetición), 162.04675 (masa del grupo final FPT) + 190.07805 (masa de la grupo FPT etílico extremo con 1-ethynyl-4-fluorobenzene) + 22.98922 (masa del catión sodio) = 2224.21484. El valor observado n = 42 es 2224.16 que es diferente del valor teórico 0.05 Da.

Ejemplo 3: Una muestra de poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) (figura 13) se analizó mediante trifluoroacetate de sodio como agente de embargo y sólo exhibió la esperada Na+ aductores y DHB como matriz.

MALDI-TOF MS confirma la estrecha distribución de poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) (figura 13). Usando las ecuaciones del paso 4, el programa de análisis se utilizó para calcular las características del polímero siguientes: Mn: 2310, Mw: 2360, Đ: 1.02.

Para confirmar el funcionamiento completo de la muestra, las masas monoisotopic se usaron para analizar un seleccionado n-mer individual (26) (figura 14). El valor teórico de la masa de la mer 26 de poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) corresponde a 72.02113 × 26 (la masa de las unidades de repetición), 17.00274 (masa del grupo del oxhidrilo), 61.0112 (masa del grupo final de ω-tiol) + 22.98922 (masa del sodio catión) = 1973.55254. El valor observado n = 26 es 1973.62 que es -0,07 Da diferente del valor teórico. Una señal más pequeña se observa en el 2045.74 que corresponde a 72.02113 × 27 (la masa de las unidades de repetición), 17.00274 (masa del grupo hidroxilo finales), 61.0112 (masa del grupo final de ω-tiol) + 22.98922 (masa del catión de sodio). La masa teórica es 2045.57367 que es una diferencia de 0,17 de la masa observada. Esta pequeña intensidad, impares repita la unidad es indicativa de transesterificación durante el polimerización del ácido láctico de la abertura del anillo. Un tercer pico muy menor se observa en 2057.73. Se trata de -0,14 Da diferente la masa teórica de un poly(L-lactide) con un grupo final de ácido carboxílico (más que el grupo tiol de extremo) con una masa teórica de 72.02113 × 27 (la masa de las unidades de repetición), 17.00274 (masa del grupo hidroxilo final) + 73.02895 (masa del ácido carboxílico) + 22.98922 (masa del catión sodio) = 2057.59142. Esta impureza menor adicional es probablemente la consecuencia de la iniciación del agua durante el polimerización del monómero de láctido la abertura del anillo.

Poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) muestra mantiene su estrecha distribución cuando functionalized selectivamente por la reacción de un tiol-ene (figura 15) con maleimida (figura 16). Los espectros exhibieron la esperada Na+ aductos de utilizar sodio trifluoroacetate como embargo y DHB como la matriz.

MALDI-TOF MS confirma la estrecha distribución de poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) después de la reacción de un tiol-ene con maleimida (figura 16). Usando las ecuaciones del paso 4, software de análisis fue utilizado para calcular las características del polímero siguientes: Mn: 2310, Mw: 2340, Đ: 1.01. Cabe señalar que la disminución de Mn y Mw en comparación con el material de partida es debido a sesgo de ionización (uno de los defectos de MALDI-TOF MS). Cuando la modificación en el material de partida es relativamente pequeña (~ 97 Da en esta modificación particular) y el dispersity disminuye después de la modificación, MALDI-TOF MS cálculos de peso molecular promedio pueden llegar a ser menos precisos.

Para confirmar el funcionamiento completo de la poly(L-lactide), terminó tiol (Mn = 2500) con maleimida vía la reacción de un tiol-ene, masas monoisotopic se usaron para analizar un seleccionado n-mer individual (26) (figura 17). El valor teórico de la masa de la mer 26 de tiol poly(L-lactide) terminado corresponde a 72.02113 × 26 (la masa de las unidades de repetición), 17.00274 (masa del grupo hidroxilo finales), 158.02757 (masa de ω-tiol final grupo vinculado a maleimida) + 22.98922 (masa de la catión de sodio) = 2070.56891. El valor observado n = 26 es 2070.54 que es diferente del valor teórico 0,03 Da. La misma especie iónica con potasio se observa también en el 2086.49, que corresponde a una forma de diferencia Da 0.05 la masa teórica. Se observa un pico muy pequeño en el 2167.58 que corresponde a 72.02113 × 28 (la masa de las unidades de repetición) 17.00274 (masa del grupo hidroxilo final) + 72.02168 (masa del anión carboxilato) + 22.98922 (masa del catión sodio) + 38.96371 (masa de cationes de potasio). La masa teórica es 2167.56844 que es un -0.01 de la diferencia de masa observada y es indicativo de la impureza misma de rastro de iniciación de agua que se observa en el material de partida. Este polímero presenta ionización con un equivalente de sodio, de potasio y la pérdida de un protón. La pérdida del protón del ácido carboxílico y complejación con dos cationes es un modo común de ionización para polímeros funcionalizados ácidos monocarboxílicos. Es importante tener en cuenta que el mismo cambio en la masa que se observa para los productos de reacción tiol-ene no se produce para este compuesto de terminado de ácido carboxílico que además indica que carecía el grupo tiol de extremo para experimentar la reacción de funcionalización.

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Figura 1:3 x 3 rejilla para determinación de proporción muestra. Utilizando una cuadrícula de 3 x 3 de las muestras, las concentraciones relativas de embargo agente-analito-matriz pueden variar sistemáticamente para determinar empíricamente una preparación de muestras optimizado. Esto normalmente se hace mediante la celebración de la constante de tres variables (15 μl de solución de analito) aumentando la cantidad de los otros dos (agente de embargo (eje y) y matriz (eje x)) componentes de un sistema múltiple (3-fold en el ejemplo representado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: placa de destino de MALDI-TOF MS. La placa de destino de MS de MALDI-TOF es una placa de metal que sostiene las muestras de maestría-TOF MS en pocillos individuales para el análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: espectro de masas MALDI-TOF de muestra de 1. Este amplio espectro muestra la distribución general de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn= 5000) ionizado con Na+ y K+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: espectro de masas MALDI-TOF de una unidad individual de repetición de muestra de 1. Este espectro muestra una unidad de repetición individual de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) para el análisis de grupo final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: esquema de reacción para la modificación de la muestra 1. Para confirmar los grupos finales del material de partida, poly(ethylene glycol) 2-aminoetil éter ácido acético fue reaccionado con 2, 4-dinitrofluorobenzene (también conocido como reactivo de Sanger). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: espectro de masas MALDI-TOF de modificación de la muestra 1. Este amplio espectro muestra la distribución general de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) funcionalizados con 2, 4-dinitrofluorobenzene. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: espectro de masas MALDI-TOF de una unidad individual de repetición de muestra 1modification. Para confirmar el final Grupo funcionalización, este espectro muestra una unidad de repetición individual de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) después de la reacción con 2, 4-dinitrofluorobenzene. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: espectro de masas MALDI-TOF de muestra de 2. Este amplio espectro muestra la distribución general de bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000) ionizado con Na+ aductores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: espectro de masas MALDI-TOF de una unidad individual de repetición de muestra de 2. Este espectro muestra una unidad de repetición de polioxietileno bis-azida (Mn = 2000) con el fin de confirmar los grupos finales haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 10: esquema de reacción para la modificación de la muestra 2. Para confirmar los grupos de final de la partida material, polioxietileno bis-azida (Mn = 2000) fue reaccionado con 1-ethynyl-4-fluorobenzene vía una cicloadición de azidas-alquino catalizada por cobre (CuAAC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 11: espectro de masas MALDI-TOF de modificación de la muestra 2. Este amplio espectro muestra la distribución general de bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000) funcionalizados con 1-ethynyl-4-fluorobenzene. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 12: espectro de masas MALDI-TOF de una unidad de repetición individual de modificación de la muestra 2. Este espectro muestra una unidad de repetición individual de bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000) reaccionó con 1-ethynyl-4-fluorobenzene mediante cicloadición cobre azida-alquino catalizada para confirmar fin grupo funcionalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 13: espectro de masas MALDI-TOF de muestra de 3. Este amplio espectro muestra la distribución general de poly(L-lactide), terminó tiol (Mn = 2500). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 14: espectro de masas MALDI-TOF de una unidad individual de repetición de la muestra 3. El espectro muestra una unidad de repetición individual de poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) para confirmar los grupos finales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 15: esquema de reacción para la modificación de la muestra 3. Para confirmar los grupos finales del material de partida, poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) fue reaccionado con maleimida vía un acoplamiento de tiol-ene. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 16: espectro de masas MALDI-TOF de modificación de la muestra 3. Este amplio espectro muestra la distribución total del producto de la reacción entre poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) y maleimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 17: espectro de masas MALDI-TOF de una unidad de repetición individual de modificación de la muestra 3. Para confirmar el final Grupo funcionalización, este espectro muestra una unidad de repetición individual de poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) después de la reacción tiol-ene con maleimida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Espectrometría de masas MALDI-TOF es una valiosa herramienta analítica para la caracterización de polímeros debido a su capacidad para generar iones de polímero en el estado cargado por separado y con la mínima fragmentación. Esta técnica de ionización suave utiliza pulsos de láser corto para la desorción de las muestras de estado sólidas del analito polímero embebidas en una matriz compuesta para generar iones de polímero en la fase gaseosa. Típicamente, las macromoléculas se ionizan por formación de complejos con cationes que se agregan a la matriz para permitir su análisis por espectrometría de masas. Estos iones macromoleculares entonces son acelerados por un voltaje de extracción para llevar a la región libre de campo del tubo de vuelo que permita su m/z para determinarse basado en su tiempo de vuelo entre la fuente de iones y el detector5 , 32.

En comparación con otras técnicas de caracterización de polímeros, MALDI-TOF MS espectros calidad es fuertemente dependiente de los parámetros de adquisición de datos y preparación de la muestra. Aunque no hay ninguna determinada fórmula para preparación de muestras, comprender la función de cada componente de la preparación de la muestra permite optimización empírica más rápido. El factor más importante en la preparación de la muestra MALDI es selección de la matriz porque la compatibilidad de la matriz con el analito de polímero es crítica para permitir que la matriz emocionado generar macromoléculas desorbidas, solo en un estado ionizado5, 15,17,19. Una vez que han sido seleccionados agentes de matrix y embargo apropiados, debe determinarse la proporción correcta de agente de analito, matriz y embargo. Esto puede lograrse empíricamente mediante la creación de una rejilla de dos dimensiones de las muestras (figura 1) en la placa de la blanco del MALDI-TOF MS (figura 2) con aumento de la concentración de la matriz en un eje y aumento de la concentración de agente de embargo en la otros.

Similar a la preparación de la muestra MALDI, no hay determinada fórmula para la determinación de parámetros de adquisición de datos; sin embargo, deben considerarse ciertas tendencias para acelerar la optimización espectral. Modo Reflectron, que aumenta la resolución pero disminuye la señal global, por lo general es elegido para gamas más bajas masivas (en estos ejemplos, a continuación Da 4.000) donde se logra resolución isotópica. En estos casos, se utilizaron cálculos masa monoisotopic y pico recogiendo métodos. Para muestras de polímeros con masas por encima de 4.000, modo lineal se utilizó con cálculos de masa media y enarbolar los métodos de recolección. Para mejorar la resolución de la señal, se deben ajustar los voltajes de la fuente de iones poco a poco con la tendencia general de mayor masa polímeros teniendo un mayor voltaje diferencial (IS1 versus IS2).

Tiempo optimizado muestra preparación y adquisición de parámetros pueden ofrecer precisión, precisión de masa sólo puede lograrse a través de la calibración efectiva. El tiempo de vuelo para una masa dada puede variar sutilmente con respecto a los parámetros de adquisición variable y posiciones de la placa incluso, por lo tanto una calibración debe realizarse para cada conjunto de parámetros de adquisición optimizados para rendimiento de masa exacta determinaciones de5,30. Una vez que se han optimizado los parámetros de adquisición y preparación de la muestra, los espectros deben calibrarse utilizando estas mismas condiciones exactas.

Debido a la excepcional resolución y exactitud total observado en la espectrometría de masas MALDI-TOF optimizada de polímeros, esta técnica se ha convertido en una valiosa herramienta de conexión para la determinación de datos de distribución en masa de polímero. Sin embargo, su capacidad de resolver individuales unidades repetidas dentro de la distribución de masa de polímero proporciona una ventaja particular para el análisis final del grupo en comparación con otros polímeros técnicas de caracterización como cromatografía de gel permeación (GPC) y nuclear resonancia magnética (RMN). Esto es particularmente valioso para determinar la fidelidad de las reacciones de funcionalización de grupo final y la naturaleza cuantitativa de reacciones de conjugaciones de grupo final. Este manuscrito ha demostrado la capacidad para resolver la masa de unidades repetidas de polímero individuales con un máximo de dos puntos decimales de precisión total, lo que permite la confirmación de modificaciones de grupo final con un alto nivel de confianza. Con los avances sustanciales que se han hecho recientemente en el campo de la síntesis del polímero precisión, MALDI-TOF MS se está convirtiendo en una herramienta cada vez más importante para determinar la estructura macromolecular y funcionalidad.

Divulgaciones

Los autores tienen intereses financieros relacionados con los calibradores esférico utilizado en este estudio.

Agradecimientos

Los autores reconocen que el consorcio Smart diseño de materiales, análisis y procesamiento (SMATDAP) financiado por la National Science Foundation bajo acuerdo cooperativo IIA-1430280 y la LA Junta de regentes de una beca de postgrado (MEP). Las muestras de polímero para estos experimentos fueron proporcionadas por MilliporeSigma (Sigma-Aldrich).  Publicación de acceso abierto de este artículo es patrocinado por MilliporeSigma.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000)MilliporeSigma (Aldrich)689696http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en&region=US
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000)MilliporeSigma (Aldrich)757918http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en&region=US
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500)MilliporeSigma (Aldrich)747386http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide lowMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS20http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide mediumMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS21http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide highMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS22http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en&region=US
2,4 dinitrofluorobenzeneTCIA5512
maleimideMilliporeSigma (Aldrich)129585http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en&region=US
1-ethynylfluorobenzene Fisher Scientific766-98-3
triethylamineMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)471283http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en&region=US
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamineMilliporeSigma (Aldrich)369497http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en&region=US
Copper(I)BromideMilliporeSigma (Aldrich)254185http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en&region=US
glacial acetic acidFisher ScientificA38212
sodium metabisulfiteMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)13459http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en&region=US
potassium trifluoroacetateMilliporeSigma (Aldrich)281883http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en&region=US
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrileMilliporeSigma (Aldrich)727881http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en&region=US
a-cyano-4-hydroxycinnamic acidMilliporeSigma (Sigma)C8982http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en&region=US
tetrahydrofuranFisher ScientificT425-1
dichloromethaneVWR AnalyticalBDH1113-4LG

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