JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול עבור לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS) אפיון של פולימרים סינתטיים מתואר כולל אופטימיזציה של הכנת הדוגמא, רכישת ספקטרלי וניתוח נתונים.

Abstract

קיימות שיטות רבות, זה יכול להיות מועסק באפיון homopolymers סינתטי, אך מעטים לספק שימושי של מידע לצורך סיום הקבוצה ניתוח לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS). ערכת לימוד זו מדגימה שיטות אופטימיזציה של הכנת המדגם, רכישת ספקטרלי, ניתוח נתונים של פולימרים סינתטיים באמצעות פרמטרים גב' MALDI-TOF קריטית במהלך הכנת הדוגמא כוללים את הבחירה של המטריצה, זיהוי של מלח cationization המתאים ולאחר כוונון של כמויות יחסיות של מטריקס, הקטיון, analyte. הפרמטרים רכישה, כגון מצב (ליניארי או צלחת לוויין), קיטוב (חיובי או שלילי), האצת מתח, זמן ההשהיה, חשובים גם. בהתחשב קצת ידע של הכימיה מעורב לסנתז הפולימר ומיטוב הפרמטרים רכישת הנתונים והן את התנאים הכנת המדגם, ספקטרה צריכה להתקבל עם רזולוציה מספיק ודיוק המונית כדי לאפשר את ברורה וחד משמעית הנחישות של קבוצות הקצה של רוב homopolymers (גושים מתחת 10,000) בנוסף אני חוזר ליחידה מסה וחלוקת משקל מולקולרי הכללית. למרות הפגינו על קבוצה מוגבלת של פולימרים, שיטות כלליות אלה ניתנים ליישום טווח רחב של פולימרים סינתטיים לקביעת הפצות המוני, למרות סיום קבוצה נחישות אפשרי רק עבור homopolymers עם dispersity הצר.

Introduction

עם שיפורים חי הפילמור טכניקות, דיוק פולימרים עם קבוצות הקצה באופן כמותי functionalized הם יותר ויותר זמין1. פיתוח מקביל של אזיד-אלקין, thiolene לחץ על בדיקות, הביוכימיה אפשרה את צימוד כמעט כמותית של מקרומולקולות כדי moieties אחרים, מתן גישה למגוון של היברידית חומרים2,3,4 . עם זאת, שיטות אנליטיות מדויק נדרשים לאפיין המוצא חומרים והן מוצרים של תגובות אלו ההטיה פולימר. לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS) היא טכניקה אנליטי יינון רך בעל ערך עבור אפיון פולימרים כי זה יכול ליצור פולימר יונים במצב תשלום יחיד עם מינימלי פיצול5,6. MALDI-תוף MS יש יתרונות חשובים כל השיטות המקובלת של פולימר אפיון כי זה יכול לספק ספקטרה המוני עם רזולוציה של n-שהרובוט בודדים בתוך התפלגות מסה של פולימר. כתוצאה מכך, ספקטרה המוני כזה יכול לספק מידע מדויק על משקל מולקולרי הממוצע, לחזור ליחידת מסה, משקל מולקולרי dispersity7, אשר בתורו יכול להבהיר את מנגנוני הפילמור מתחרות כגון שרשרת העברת8 . עם זאת, MALDI-TOF MS הוא עוצמה לספק מידע אודות פולימר סוף קבוצות9,10, אשר יכול לשמש כדי לאשר סוף קבוצה שינויים10,11 במיוחד, אחרים המרות12 כמו פולימר cyclizations11,13. לא פחות חשוב, כמות קטנה יחסית של analyte (sub-מיקרוגרם) הדרושים עבור המוני spectrometric ניתוח גורם טכניקה זו שימושית עבור אפיון כאשר רק כמויות עקבות של חומר זמינים.

ניתוח MALDI-TOF MS של פולימרים יכול להיות מחולק לארבעה שלבים נפרדים: לטעום הכנה, כיול מכשיר, רכישת ספקטרלי וניתוח נתונים. הכנת הדוגמא היא צעד חיוני ביותר ליצירת ממוטב MALDI-TOF ספקטרה המוני מתרחש לפני המדגם מוחדרים לכלי ה-14,15. הבחירה של מטריקס המתאים עם פרמטרים דומים מסיסות פולימר analyte הוא קריטי כדי להשיג באיכות גבוהה MALDI-TOF המוני ספקטרה, קווים מנחים לבחירת מטריקס היה דיווח במקום14,15, 16,17. מסד נתונים של פולימר MALDI "מתכונים" הכנת הדוגמא היה גם שפורסם באינטרנט18. עבור הרומן פולימרים, ניתן לצפות מטריקס הבחירה הראשונה להבנת המסיסות של הפולימר, בחירת מטריצה עם דומה מסיסות פרמטרים14,19. פולימרים עם זיקה גבוהה פרוטון יכול להיות protonated על ידי רוב מטריצות14 (אשר לעתים קרובות מכילים חומצה קרבוקסילית קבוצות), אבל עבור פולימרים אחרים, סוכן cationization הוא נדרש14. אלקלי יונים adduct טוב עם המכיל חמצן מינים (למשל. פוליאסטר ו- polyethers), ואילו פחמימנים רוויים (למשל-פוליסטירן) adduct עם המעבר מתכות כמו נחושת וכסף יונים14, 19. כי הדגימות פולימר בניסוי זה הכיל אטומי חמצן עמוד השדרה, trifluoroacetate נתרן או אשלגן (TFA) שימשו את סוכן cationization. ברגע מטריקס ו- cationization הסוכנים נבחרו, כמויות יחסיות של analyte, הסוכן הקטיון מטריקס חייב להיות בקפידה ממוטב כדי להבטיח גבוהה אות רעש. בהליך זה, הפרמטרים עבור הכנת הדוגמא שכבר מוטבו, אולם הליך אופטימיזציה מדגם אמפיריים (שלב 1.4.1., איור 1) זה משתנה באופן שיטתי את ריכוזי שלושת המרכיבים (analyte, מטריקס והקטיון) יעיל לקביעת יחסי אופטימלית שלהם במהירות.

חדרי קירור והקפאה דורש גם אופטימיזציה של מספר פרמטרים. הפרמטרים החשובים ביותר כוללים את מצב יון חיובי או שלילי של ספקטרומטר, את מצב הפעולה המכשיר (לינארית לעומת רפלקטור), המתח האצת את זמן ההשהיה החילוץ. דרך נוספת כי ניתן להגדיל רזולוציה היא דרך הניצול של "reflectron" מצב20,21,22,23. Reflectron מצב למעשה מכפיל את נתיב הטיסה של היונים את הגלאי על ידי המשקף היונים בסוף הצינור טיסה בחזרה לעבר גלאי ליד המקור תוך refocusing יונים עם momentums שונים, ולכן להגדיל את הרזולוציה למרות הפחתת עוצמת האות. בנוסף, ספקטרה ברזולוציה גבוהה ניתן להשיג על ידי הפחתת את עוצמת הלייזר אשר ממזער את יחס אות לרעש מאת להקטין את מספר ואת האנרגיה של התנגשויות, ולכן הפחתת פיצול של inhomogeneities קינטי24. על-ידי כוונון כל הפרמטרים הללו, ניתן למקד את היונים כדי לצמצם את ההשפעה של כל inhomogeneity ראשונית או מהירות המתרחשת במהלך תהליך desorption לייזר. כאשר הפרמטרים רכישה מיטביות, רזולוציה איזוטרופי לעתים קרובות ניתן להשיג עבור יונים עם גושים מעל 10,000 דא, למרות שזה גם תלוי אורך הצינור טיסה, עיצוב כלי נגינה. תרכובות אורגניות ביותר המכילות heteroatom אחת לפחות נוטים complexing עם אלקליות קטיונים כגון ליתיום, נתרן, אשלגן. רבים מתכות אלקליות הם monoisotopes או של איזוטופים מוגבלת, ולכן לא להרחיב את ההתפלגות.

אמנם ניתן לכוונן את הפרמטרים כלי כדי למטב את דיוק הנתונים, דיוק המידע מושגת רק עם כיול המתאים11. חלבונים ופפטידים שימשו במקור calibrants עקב monodispersity והזמינות שלהם, אבל סובלים השכיחות של זיהומים25והיציבות משתנה. חלופות חסכונית ויציב יותר כללו אשכולות אורגניים, polydisperse פולימרים26,27,28,29. למרבה הצער, אלה תכונה חלופות לפזר את ההמונים, אשר לסבך הקצאות המונית, כמו גם גושים קטנים יותר באופן כללי, שהופך אותם שימושיים רק עבור ולידציות מתחת 10,000 Da. כדי להתמודד עם בעיות אלה, גרייסון ואח. 25 פיתח מבוססי דנדרימר פוליאסטר MS כיול מערכת, monodisperse, ויש מתגאה מטריקס רחבה, תאימות הממס, יציבות חיי מדף (> 8 שנים) וגם עלות הייצור נמוכה יותר. זה מבוסס על החוזק של מערכת זו, נבחר את calibrant עבור ניסויים אלה.

ישנם שני סוגים עיקריים של כיול: פנימי וחיצוני30. כאשר מכייל מבחוץ, תקן עם ההמונים, כי סוגר של analyte ממוקמים על הצלחת היעד MALDI בעמדה דגימה שונים מאשר analyte כדי ליצור קשת המונית נפרד שממנו ניתן להפיק קובץ כיול. מצד שני, לעיתים קרובות ניתן להשיג דיוק רב יותר עם כיול פנימי, אשר כוללת ערבוב של calibrant עם analyte כדי להשיג מנסרה היברידית עם אותות הן calibrant והן analyte. בהליך המתואר להלן, יושם על כיול חיצוניים. לאחר כיול נאותה של הסולם המוני, ניתן לרכוש analyte מדויק מסה נתונים. כדי להבטיח את הכיול המדויקות ביותר, חשוב כי רכישת נתונים מתרחשת זמן קצר לאחר הכיול.

בסופו של דבר, ברגע מכויל ממוטבת, ערכות נתונים נרכשו, הנתונים נותחו לספק מידע מבניים על הדגימות פולימר. המרווח בין n-שהרובוט בתוך ההתפלגות פולימר יכול לספק מדידה מדויקת של היחידה החוזרת המוני. מספר ממוצע משקל מולקולרי (Mn) ועוד המוני חישובי התפלגות (למשל, Mw (משקל משקל מולקולרי הממוצע) Đ (dispersity)) יכול להיקבע גם התפלגות אות ב (ספקטרה המונית שלב 4.2 עבור חישובים). אולי באופן ייחודי ביותר, במקרה של homopolymers, הסכום של ההמונים קבוצה סוף יכול להיות מאושרות על ידי קביעת ההיסט של ההתפלגות פולימר ביחס המסה של יחידות חוזרות לבד. מידע עשיר MALDI-TOF המוני ספקטרום לספק נתונים יקרי ערך אפיון אינם משלימים מסורתיים יותר טכניקות אפיון פולימרי כגון גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, פורייה-ספקטרוסקופיית, ו תהודה מגנטית גרעינית.

Protocol

שים לב: כל התגובות היו להפעיל ברדס fume. אנא קרא כל חומר בטיחות נתונים גיליונות (MSDS) עבור כל חומר כימי המשמש, זהירות הולמים.

1. הכנת הדוגמא

  1. אופן ההכנה של פתרונות מניות של מטריקס
    1. לפזר 20 מ ג של חומצה α-cyano-4-hydroxycinnamic (HCCA) ב 1 מ"ל של tetrahydrofuran-unstabilized (THF), ואת מערבולת עד התפרקה.
    2. לפזר 20 מ ג של 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB) ב 1 מ"ל THF, מערבולת עד התפרקה.
  2. הכנה של הפתרון מניות הקטיון אלקלי
    1. לפזר 2 מ"ג נתרן trifluoroacetate (NaTFA) ב 1 מ"ל THF, מערבולת עד התפרקה.
    2. לפזר 2 מ"ג אשלגן trifluoroacetate (KTFA) ב 1 מ"ל THF, מערבולת עד התפרקה.
  3. אופן ההכנה של פתרונות מניות analyte
    1. דוגמה 1: לפזר 2 מ ג של חומצה אצטית פוליפוני (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר (Mn = 5000) ב- 0.5 מ"ל THF, מערבולת עד התפרקה.
    2. דוגמה 2: לפזר 2 מ ג של polyoxyethylene bis(azide) (Mn = 2000) ב- 0.5 מ"ל THF, מערבולת עד התפרקה.
    3. דוגמה 3: לפזר 2 מ ג של poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) ב- 0.5 מ"ל THF, מערבולת עד התפרקה.
  4. הכנת תערובות דגימה לניתוח
    1. להכין סדרה של פתרונות על ידי ערבוב מטריקס, analyte, הקטיון פתרון בזמן משתנה את כמויות יחסיות של הרכיבים כך עשויים תערובות 9 דוגמאות ייחודיות. לדוגמה, שמירה על כמות נוספת מטריקס פתרון מלאי קבוע (למשל., 10 µL), בהתאם את כמות analyte פתרון פי 3 (למשל., 45, 15 ו- 5 µL), בזמן משתנה גם כמות הקטיון פתרון לפי פקטור של שלושה (למשל ., 9, 3 ו- 1 µL). הדוגמיות הללו ביעילות תשואות רשת 3 x 3 דוגמאות עם שני המשתנים ריכוז שונים על x ו- y של צירים (איור 1).
    2. בדוגמה זו נציג, לשלב 15 µL של הפתרון poly(L-lactide), עם µL 15 של הפתרון DHB, µL 1 של הפתרון NaTFA.
    3. פיפטה 1 μL של כל התערובת פתרון על דוגמה אישית גם על לוח מטרה MALDI (איור 2). הוסף את הדגימות מצטבר במנות קטנות כדי למנוע את הדגימה זורמים מהבאר לדוגמה, המאפשר לכל aliquot מתמוססות ליובש לפני הוספת דגימה נוספת.
      הערה: עבור ממיסים נקודת רתיחה גבוהה יותר, רובה אוויר ייתכן שיהיה צורך לזרז אידוי הממס, למרות התראה אמור לשמש כדי למנוע את הצלחת לדוגמה, אשר עלול לגרום לצלחת לעיקום חימום.
  5. הכנת דוגמאות רגיל לצורך כיול
    1. הכינו את הסטנדרטים כיול באמצעות פרוטוקול הצעת הספק.
      הערה: calibrants דנדרימר נבחרו במחקר זה זמינים כמו dendrimers טהור או premixed עם מטריקס, calibrant, הקטיון-יחס מיטבי.

2. הנתונים רכישת אופטימיזציה

  1. ייזום קירור והקפאה
    1. רכישת תוכנה נתונים פתוח "FlexControl".
    2. הוצא את הפלטפורמה כדי לאפשר את טעינת של המטרה צלחת על-ידי הקשת "figure-protocol-2686" כפתור.
    3. הנח בעדינות לצלחת היעד עם הדגימות calibrant ו- analyte טעון על הרציף ב הכיוון המתאים.
    4. להשתמש בתוכנה רכישה כדי להזריק את הצלחת היעד על הרציף על ידי לחיצה "figure-protocol-2938" כפתור שוב.
    5. בחר שיטת רכישת הנתונים המתאים (שיטת הרכישה מצב חיובי) על-ידי הקשה על קובץ | בחר שיטת.
      הערה: עבור רוב דגימות פולימר, כולל analytes הנציגה שלנו, יינון צפוי ויה complexation עם הקטיון, לכן, שיטת הרכישה מצב חיובי הוא המתאים ביותר. בהתאם לכלי-עבור טווחים מסה נמוכה יותר (500-10,000 Da) או מתי רצוי ברזולוציה גבוהה יותר, בחר קובץ שיטת מצב רפלקטור. עבור משקל מולקולרי גבוה יותר דוגמאות או כאשר האות רגישות גבוהה יותר היא ברזולוציה הדרושים, והתחתון הוא מקובל, בחר קובץ שיטת מצב לינארי.
    6. לפני רכישת נתונים, ודא טווח המונים המתאימים לאיסוף נתונים במיקום אידיאלי נבחר-הטווח ההמוני יכלול כמחצית המסה הנמוכה ההתפלגות הצפויה, כמו גם כפול המסה הגבוהה ביותר ב ההתפלגות הצפויה. . תראה את זה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ' גילוי ' והצגת מגוון מסה
      הערה: פעולה זו מסייעת להבטיח את האות מתוך שברי השפלה משקל מולקולרי נמוך יותר או גבוה יותר אגרגטים משקל מולקולרי (דימר) שעשויות להיות לדוגמה כלולים בערכת הנתונים. כמו כן, שים לב כי מטריקס oligomers הם לעתים קרובות תשומת לב עם עוצמות האות גבוה ברוב MALDI-TOF המוני ספקטרה, מתן רעש בעוצמה גבוהה עם גושים גבוה כמו 1,000 דא, ניתוח לסבך מתחת מיסה זו. למרות הכיול יידרש לצורך קבלת ערכת נתונים הסופי, קובץ כיול מדויק ניתן רק לרכוש אם רכישת זהות פרמטרים משמשים כמו אלה ממוטבת עבורו analyte מסוים. לכן, אופטימיזציה ראשוני של הספקטרום המוני analyte נדרשת לפני הכיול, ואחריו את מחודש מהוואי קשת המוני analyte מכויל.
  2. רכישת המידע הראשוני
    1. רכישת התוכנה, בחר את המיקום על הצלחת היעד המתאים analyte הרצוי.
    2. ליזום איסוף נתונים בעת הזזת המטרה לייזר סביב הדגימה כדי למקסם את האות. ליזום איסוף הנתונים, הקש הפעל.
      הערה: הלייזר יכול למצות מטריקס במיקום מסוים לאחר דגימה חוזרות ונשנות.
    3. שימוש במחוון בצד שמאל של החלון מצלמה, להתאים את עוצמת הלייזר כזה כי הכוח המינימלי הדרוש להשיג רזולוציה איזוטרופי מושגת.
      הערה: בעת ניתוח דגימות מרובים כדי לאשר את היחס האופטימלי בין analyte, הקטיון מטריצה, השתמש אותו הכוח לייזר בכל הדגימות analyte כדי לקבוע איזו דגימה תערוכות את יחס אות/רעש הטוב באותם פרמטרים רכישה. המשך רכישה עתידית אופטימיזציה עם הדוגמה המופיעה להפגין את האות הטוב ביותר ליחס רעש.
  3. אופטימיזציה רכישת נתונים
    1. התקרבות שיא בודדים באמצע הטווח ההמוני של עניין, למטב את הרזולוציה על-ידי התאמת את ההבדל בין המתחים האצה (עבור הכלים במחקר זה, זה כרוך התאמת הערך "IS2"), אשר נמצא ספקטרומטר טאב.
      הערה: זה ביותר במהירות ממוטבת על ידי שינוי הערך IS2 צעדים גדולים, לוקח הערה אשר יוצר ערך את הפתרון הטוב ביותר (כלומר., הכי קטן מלא רוחב שיא בעוצמה מקסימלית אות חצי), ולאחר מכן נוספים מיטוב בצעדים קטנים יותר של הערך IS2. בדרך כלל, ערך IS2 האופטימלי הוא גבוה יותר (קרוב IS1) עבור פולימרים מסה נמוכה, והתחתון של פולימרים מסה גבוהה.
    2. אם רצונך בכך, להגדיל את הרזולוציה באמצעות מצב reflectron.
      הערה: מצב Reflectron מאפשר הפיצוי של סתירות מהירות התחלתית של יונים של אותו מ/z מאת שכפית היונים מהירות גבוהה יותר של הערך מ/z באותו נתיב ארוך יותר כדי הגלאי. עלייה זו בנתיב הגלאי מאפשר יונים איטית יותר של אותו ערך מ/z כדי להגיע הגלאי בו זמנית, ביעילות תוך התמקדות היונים עבור רזולוציה מוגברת. למרות מצב reflectron בדרך כלל משפרת את הרזולוציה אות, עבור דגימות עם עוצמת האות חלש, מצב לינארי יידרש על מנת להמחיש את הנתונים.
    3. לבסוף, למטב את עוצמת הלייזר על-ידי הפחתת את עוצמת הלייזר נמוך ככל האפשר תוך יצירת עדיין אות לרעש יחס סביר (למשל., אות לרעש יחס של 10).
      הערה: בגלל הכוחות לייזר בדרך כלל להפחית את הרזולוציה ולא יכול לגרום לפיצול, ספקטרום המוניים עם האיכות הטובה ביותר נרכשים באמצעות לייזר מופחת כוח אבל מספר גבוה יותר של סריקות.
    4. לאחר הפרמטרים רכישה מיטביות, לשמור ספקטרום המונית לא מכויל על ידי בחירת הקובץ ולאחר מכן לשמור לטווח כדי תייק בתור. לכיול חיצוני, רכש חדש של calibrant תחת פרמטרים אלה זהה, אופטימיזציה צריך להתבצע לפני רכישה חדשה מתחילה לייצר את הספקטרום המוני מכוילת של analyte.

3. MALDI כיול

  1. רכישת כיול הקשת המונית
    1. באמצעות הפרמטרים רכישה הממוטבות כבר analyte, רוכשים של ספקטרום המוני אופטימיזציה של המדגם של סטנדרטים המוני.
      הערה: באופן אידיאלי, ערכת כיול לכלול תקן אחת מעל הטווח של הריבית, אחת מתחת ואחד לפחות בטווח של ריבית. הדיוק של הכיול הוא הטוב ביותר. אם כל הפרמטרים רכישה זהים עבור שתי דגימות.
  2. צור קובץ כיול
    1. ודא כי כל כיול הקיים מבוטל או במצב בו יוכלו להיות מוחלפים על-ידי הקשה על כיול לפסול תחת ספקטרומטר טאב.
    2. באמצעות רכישת אותם פרמטרים (למשל., לייזר הספק, מתח חשמלי IS2), לעבור את הלייזר הבאר מדגם המכיל את calibrant (למשל., פפטיד סטנדרטי, דנדרימר) על-ידי בחירה המתאים אז עם הסמן ולרכוש ספקטרום על ידי לחיצה על התחל.
  3. ברגע אות מספיק הושגה הקש התחל לסים רכישת נתונים.
  4. לאחר קשת המונית של calibrant הושג, לבחור את התפריט הנפתח של רשימת בקרת מסה בכרטיסיה כיול שמתאים לסטנדרטים כיול הזה. רשימת בקרת המוני המתאימה תהיה ההמונים calibrant שנבחרו באמצעות הקטיון המתאים ההפניה.
    הערה: אלה צריך להיות זמין מ הספק calibrant, הקפד להשתמש בערכים המוני monoisotopic כאשר רזולוציית איזוטרופי מושגת (למשל., רפלקטור מצב מתחת מ/z = 5000), והמסה הממוצעת הערכים כאשר רזולוציית איזוטרופי לא ניתן להשיג (לדוגמא, מצב לינארית מעל מ/z = 5000),
  5. לפני התאמת הפסגה ההתייחסות המתאימה לפסגת כל שנבחרו calibrant ', ודא כי שיא המתאים בחירת פרוטוקול נמצא בשימוש על-ידי בחירה בכרטיסיה עיבוד .
    הערה: שיא האיסוף פרוטוקולים יכולים להשתנות לפי הרזולוציה ספקטרלי. עבור המוני מחישוב ממוצע, התוכנה צריך לקחת הממוצע המונית על פני סדרה שלמה של פסגות איזוטרופי. עבור חישוב מסת monoisotopic, להגדיר את התוכנה כדי לחשב את המסה המדויקת של השיא איזוטרופי הראשון בלבד.
  6. להחיל המסה הפניה מרשימת הבקרה המונית על האות המתאימה עבור הקשת המוני calibrant על-ידי בחירת האזור משמאל הפסגה של עניין ולחיצה על המסה המתאים ברשימת בקרת כדי להחיל. המשך תהליך הפסגות calibrant הנותרים.
    הערה: עבור הכיול ומדויקים מדויק ביותר, הנח הדגימות analyte ו- calibrant קרובים ככל האפשר על הצלחת היעד מאחר סטיות דקות המטרה צלחת גובה יכולים להשפיע על הדיוק של הכיול.
  7. רכוש מחדש את הספקטרום analyte ברגע בסולם המוני עבור הפרמטרים רכישה ממוטבת היה מכויל.

4. נתוני ניתוח ופרשנות

  1. שיא האיסוף
    1. פתח את הספקטרום analyte בתוכנה ניתוח נתונים (FlexAnalysis).
    2. תקריב על שיא לזהות אם הרזולוציה איזוטרופי הושגה על ידי בחירת לחצן זום בטווח - X .
    3. לחץ לרשימת המונים | למצוא את כדי לבחור פסגות. אם הפסגה monoisotopic היא נפתרה, בחר זה השיא הראשון בהפצה איזוטרופי לקביעת המסה באמצעות פרוטוקול חיטוט שיא monoisotopic. אם הפסגה monoisotopic לא נפתרה, השתמש שיא מסת הממוצע של בחירת פרוטוקול ולאחר לקבוע את המסה הממוצעת של ההתפלגות איזוטרופי כולו.
    4. המשך זה שיא איסוף תהליך עבור כל n-מר בהפצה פולימר.
  2. פולימר אפיון ובסוף הקבוצה ניתוח חישובים
    הערה: כאשר משתמשים בו נכון, MALDI-TOF MS יכול לספק נתונים יקרי ערך, מדויקת לחישובי הפצה המונית של פולימרים. יצוין הפצה שנתוני רק מדויק כאשר dispersity של המדגם פולימר היא נמוכה יחסית (למשל., כ Đ= 1.3 או להלן).
    1. לחשב את מספר ממוצע המשקל המולקולרי, המונית הממוצע לגבי המספר של שומות של כל מסת החלקיק, תוך שימוש בנוסחה:
      figure-protocol-10315
      איפה Nאני = מספר מולקולות של משקל מולקולרי מסוים ו Mאני = משקל מולקולרי מסוים של מולקולות אלה.
    2. לחשב את משקל ממוצע המשקל המולקולרי, הממוצע המוני ביחס המשקל של כל מסת החלקיק, תוך שימוש בנוסחה:
      figure-protocol-10649
      איפה N אני = מספר מולקולות של משקל מולקולרי מסוים ו M אני = משקל מולקולרי מסוים של מולקולות אלה.
    3. ברגע Mw והן Mn חושבו, לכמת את רוחב היריעה של ההתפלגות משקל מולקולרי באמצעות את יחס Mw/Mn אשר נקרא dispersity, Đ.
    4. התכונה הכי ייחודי ורב עוצמה של ניתוח נתונים MS MALDI-TOF היא היכולת לקבוע או לאשר את קבוצות הקצה של homopolymers. לקבוע את קבוצת הקצה על-ידי סידור מחדש של הנוסחה הבאה של המונים התצפיות n-מר בספקטרום המוני (Mn-mer):
      Mn-mer = n (MRU ) + MEG1 + MEG2 + Mיון
      איפה n = מידת פלמור,
      MEG1 = מסה של קבוצת α-קצה,
      MEG2 = מסה של קבוצת ω-קצה,
      זRU = המסה של היחידה אני חוזר של הפולימר
      ו זיון = מסה של יונים את מתחמי עם הפולימר.

תוצאות

דוגמה 1: מדגם של פולי (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר חומצה אצטית (Mn = 5000) (איור 3) נותחו באמצעות אשלגן trifluoroacetate כסוכן cationization עם HCCA כמו המטריקס. הספקטרום הציג את הצפוי K+ adducts כמו גם את אלה נצפו מ נה שיורית+.

MALDI-תוף MS מאשרת את התפלגות צר (איור 3) של חומצה אצטית פוליפוני (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר (Mn = 5000). כי הפסגה monoisotopic (הכוללת אך ורק הנפוץ ביותר אלמנטלים האיזוטופים, כלומר 12C, 1H 16O, ו 14N) היא לא נפתרה מספיק לאפשר זיהוי שלו, פרוטוקול לשחקנים לבחור משמש את זה קובע את המסה הממוצעת על פני ההתפלגות איזוטרופי כולו עבור כל שיא n-מר. באופן דומה, כל החישובים התיאורטיים נקבעים באמצעות ממוצע, ולא monoisotopic, ההמונים עבור כל רכיב. באמצעות המשוואות משלב 4, ניתוח תוכנה שימש כדי לחשב את המאפיינים הבאים של התפלגות מסה הפולימר: Mn: מ' 4700,w: 4710, Đ: 1.00.

על מנת לאשר את הזהות של הקבוצות סיום, הפרט n-mer (104) נבחר לצורך ניתוח נוסף (איור 4). כמו עם החישובים הפצה המונית, מכיוון שלא היתה אפשרות לזהות את הפסגה monoisotopic, ממוצע של ערכים המוני שימשו עבור חישובים עוקבות. הערך מסה תיאורטי של 104-והימי של חומצה אצטית פוליפוני (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר מורכבת המסה של יחידות אני חוזר (44.0530 × 104) ובנוסף המסה של הקבוצה בסוף α-אמין (+ 16.02300) ואת המסה של ω-סוף הקרבוקסיל (+ 59.0440) בתוספת המוני אשלגן הקטיון (+ 39.09775) אשר מניב סה כ 104-מר מסה של 4695.67675. הערך מסה שנצפו עבור 104-מר + K+ הוא 4695.5 אשר תואם את שווי תיאורטי, נתנו את מידת הדיוק של חישובים המונית הממוצע. הסדרה של פסגות קטנים, היסט בספקטרום המתאים הפולימר מייננת עם נתרן איפה הערך מסה תיאורטי של 104-והימי מורכבת המסה של יחידות אני חוזר (44.0530 × 104) ובנוסף המסה של קבוצת הקצה α-אמין (+ 16.02300) בתוספת מסה של ω-סוף הקרבוקסיל (+ 59.0440) בתוספת המסה של הקטיון של נתרן (+ 22.98922) נותן מסה סה כ 104-מר של 4679.56822. הערך מסה שנצפו עבור 104-מר + Na+ הוא 4679.4 הנמצא במרחק שונה מהערך תיאורטית 0.2 Da. האישושים מדויקת יותר של קצה לקבץ מסה יכול להיקבע על ידי מדידת הממוצע על פני מספר פסגות, ומאז נדון במקום אחר11.

חומצה אצטית פוליפוני (אתילן גליקול) אתר 2-aminoethyl (Mn = 5000) מדגם מתוחזק תפוצתו צר כאשר סלקטיבי functionalized התגובה (איור 5) עם 2, 4-dinitrofluorobenzene (DNFB) (איור 6). נתרן ספקטרום הציג adducts, משמש HCCA המטריקס.

MALDI-תוף MS מאשרת את התפלגות צר (איור 6) של חומצה אצטית פוליפוני (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר (Mn = 5000) בעת שינוי עם DNFB. באמצעות המשוואות משלב 4, ניתוח תוכנה שימש כדי לחשב את המאפיינים הבאים של התפלגות מסה הפולימר: Mn: מ' 4940,w: 4950 Đ: 1.00.

על מנת לקבוע אם מלאה functionalization של חומצה אצטית אתר פולי (אתילן גליקול) 2-aminoethyl (Mn = 5000) אירע עם DNFB, n בודדים-מר של ההתפלגות נבחר לניתוח (איור 7). המסה תיאורטי של 104-מר functionalized של חומצה אצטית פוליפוני (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר הגיבו 2, 4-dinitrofluorobenzene מורכבת 44.0530 × 104 (המסה של יחידות אני חוזר) + 182.115 (מסה של קבוצת α-אמין הגיב עם 2, 4 - dinitrofluorobenzene) + 59.044 (מסה של הקרבוקסיל) + 22.98922 (מסה של הקטיון נתרן) = 4845.66022. ערך המוני התצפיות עבור n = 104 הוא 4845.8 אשר הוא -0.1 Da שונה מהערך תיאורטית. הסכם זה קרוב בין הערכים תיאורטיים ונצפתה מעידה על שינוי מוחלט של חומר המוצא למוצר, אבל יותר באופן משמעותי, העדר סימנים הקשורים עם חומר המוצא, 4811.72722 ו- 4855.78022 בשביל זה טווח המונית, או כל תוצרי לוואי נוספות מאשרת את functionalization סלקטיבית כמותית של אמין. השנייה לשיא נצפית ב- 4823.8 אשר תואם את 103-מר של הפולימר functionalized, אבל עם ההפסד של הפרוטונים על חומצה קרבוקסילית בסוף לקבץ את מתחמי עם יון נתרן אחר עם מסה תיאורטי של 4823.58899 שבו יש הבדל של-0.2 Da.

דוגמה 2: מדגם של polyoxyethylene bis(azide) (Mn = 2000) (איור 8) נותחו באמצעות סודיום trifluoroacetate בתור סוכן cationization ו HCCA כמו המטריקס, רק הציג את הצפוי Na+ adducts.

בגלל הרזולוציה בפועל בטווח התחתון זה המוני, הפסגות monoisotopic עבור כל אחד n-שהרובוט יכול להיפתר בקלות, אז לשיא monoisotopic בחירת פרוטוקול נבחר (בממוצע רק את האות המונית של השיא הראשון בהפצה איזוטרופי ) כל החישובים המתאימים מנוצל ההמונים monoisotopic של כל רכיב. MALDI-תוף MS מאשר את התפלגות צר (איור 8) polyoxyethylene bis(azide) (Mn = 2000). באמצעות המשוואות משלב 4, ניתוח תוכנה שימש כדי לחשב את המאפיינים הבאים של התפלגות מסה הפולימר: Mn: 1940, Mw: 1950, Đ: 1.01.

על מנת לאשר סוף קבוצה functionalization, נבחר של הפרט n-mer (42) (איור 9). כמו עם ההפצות המוני נקבע לעיל, גושים monoisotopic שימשו כי הפסגות monoisotopic נפתרו היטב בחלוקת איזוטרופי כל-n-מר. הערך מסה תיאורטי של 42-והימי של polyoxyethylene bis(azide) מקביל 44.02621 × 42 (המסה של יחידות אני חוזר) + 42.00922 (מסה של קבוצת הקצה azido) + 70.04052 (מסה של קבוצת הקצה azidoethyl) + 22.98922 (מסה של הקטיון נתרן) = 1984.13978. ערך המוני התצפיות עבור n = 42 הוא 1983.95 אשר הוא שונה מהערך תיאורטית 0.19 Da. יצוין כי בעיקר על הכוחות הגבוהים לייזר, יציג הפונקציונליות אזיד שברי והשלמת; עם זאת, זה לא נצפתה במקרה הספציפי הזה31.

Bis(azide) polyoxyethylene (Mn = 2000) מדגם מתוחזק תפוצתו צר כאשר functionalized באופן סלקטיבי על ידי תגובת cycloaddition נחושת מזורז אזיד-אלקין (איור 10) עם 1-ethynyl-4-fluorobenzene(EFB) (איור 11) להניב קבוצה 4-fluorophenyltriazolyl (FPT). הספקטרום הציג את הצפוי Na+ adducts משימוש נתרן trifluoroacetate בתור סוכן cationization ו HCCA כמו המטריקס.

MALDI-תוף MS מאשרת את ההתפלגות צרים (איור 11) של polyoxyethylene bis(azide) (Mn = 2000) לאחר functionalization עם EFB. באמצעות המשוואות משלב 4, ניתוח תוכנה שימש כדי לחשב את המאפיינים הבאים של הפולימר: Mn: 2240, Mw: 2250, Đ: 1.00.

כדי לוודא functionalization מלאה של המדגם, גושים monoisotopic שימשו כדי לנתח שנבחר בודדים n-mer (42) (איור 12). הערך מסה תיאורטי של 42-והימי של polyoxyethylene bis(azide) הגיבו 1-ethynyl-4-fluorobenzene מקביל 44.02621 × 42 (המסה של יחידות אני חוזר) + 162.04675 (מסה של קבוצת הקצה FPT) + 190.07805 (מסה של FPT אתיל סוף קבוצה עם 1-ethynyl-4-fluorobenzene) + 22.98922 (מסה של הקטיון נתרן) = 2224.21484. ערך המוני התצפיות עבור n = 42 הוא 2224.16 אשר הוא שונה מהערך תיאורטית 0.05 Da.

דוגמה 3: מדגם של poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) (איור 13) נותחו באמצעות סודיום trifluoroacetate כסוכן cationization ולא רק הציג את הצפוי Na+ adducts ו DHB כמו המטריקס.

MALDI-תוף MS מאשרת את ההפצה הצר של poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) (איור 13). ניתוח התוכנית באמצעות המשוואות משלב 4, השתמשו כדי לחשב את המאפיינים הבאים של פולימר: Mn: 2310, Mw: 2360, Đ: 1.02.

כדי לוודא functionalization מלאה של המדגם, גושים monoisotopic שימשו כדי לנתח שנבחר בודדים n-mer (26) (איור 14). הערך מסה תיאורטי של 26-והימי של poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) מקביל 72.02113 × 26 (המסה של יחידות אני חוזר) + 17.00274 (מסה של קבוצת הידרוקסיל) + 61.0112 (מסה של קבוצת הקצה ω-תיול) + 22.98922 (מסה של הנתרן הקטיון) = 1973.55254. ערך המוני התצפיות עבור n = 26 היא 1973.62 אשר-0.07 דא שונה מהערך תיאורטית. אות קטן יותר הוא ציין ב 2045.74 המתאים 72.02113 × 27 (המסה של יחידות אני חוזר) + 17.00274 (מסה של קבוצת הקצה הידרוקסיל) + 61.0112 (מסה של קבוצת הקצה ω-תיול) + 22.98922 (מסה של הקטיון נתרן). המסה התיאורטי הוא 2045.57367 אשר הבדל 0.17 מן המסה שנצפו. זה עוצמת קטן, אי-זוגי חזור על יחידה היא מעידה על transesterification במהלך הטבעת פתיחת פלמור של חומצה לקטית. שלישית, שיא מאוד קטין הוא ציין ב 2057.73. . זה-0.14 Da שונה מאשר המסה תיאורטי של poly(L-lactide) עם קבוצת הקצה חומצה קרבוקסילית (במקום קבוצת הקצה תיול) עם מסה תיאורטי של 72.02113 × 27 (המסה של יחידות אני חוזר) + 17.00274 (מסה של קבוצת הקצה הידרוקסיל) + 73.02895 (מסה של חומצה קרבוקסילית) + 22.98922 (מסה של הקטיון נתרן) = 2057.59142. זו הטומאה קטין נוסף הוא כנראה התוצאה של חניכה מן המים במהלך פתיחת פלמור של מונומר lactide הטבעת.

Poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) מדגם מתוחזק תפוצתו צר כאשר functionalized באופן סלקטיבי על ידי תגובת תיול-ene (איור 15) עם maleimide (איור 16). הספקטרום הציג את הצפוי Na+ adducts משימוש נתרן trifluoroacetate בתור סוכן cationization ו DHB כמו המטריקס.

MALDI-תוף MS מאשר חלוקת הצר poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) לאחר תגובת תיול-ene עם maleimide (איור 16). באמצעות המשוואות משלב 4, ניתוח תוכנה שימש כדי לחשב את המאפיינים הבאים של הפולימר: Mn: 2310, Mw: 2340, Đ: 1.01. יצוין, כי הירידה של Mn ו- Mw לעומת חומר המוצא היא עקב הטיית יינון (אחד החסרונות של MS MALDI-TOF). כאשר השינוי כדי חומר המוצא הוא יחסית קטן (Da ~ 97 ב שינוי מסוים זה), dispersity את הקטנת שלאחר השינוי, MALDI-TOF MS חישובים של משקל מולקולרי ממוצע יכול להיות פחות מדויק.

כדי לוודא functionalization מלאה של poly(L-lactide), הסתיים תיול (Mn = 2500) עם maleimide באמצעות תגובה תיול-ene, גושים monoisotopic שימשו כדי לנתח שנבחר בודדים n-mer (26) (איור 17). הערך מסה תיאורטי של 26-והימי של תיול poly(L-lactide) הסתיים מקביל 72.02113 × 26 (המסה של יחידות אני חוזר) + 17.00274 (מסה של קבוצת הקצה הידרוקסיל) + 158.02757 (מסה של ω-תיול סוף קבוצה קשורה maleimide) + 22.98922 (מסה של הקטיון נתרן) = 2070.56891. ערך המוני התצפיות עבור n = 26 היא 2070.54 אשר הוא שונה מהערך תיאורטית 0.03 נקודות Da. מאותו המין מייננת עם אשלגן הוא ציין גם ב 2086.49, המתאים בטופס משנה Da 0.05 המסה תיאורטי. לשיא קטן מאוד הוא ציין את 2167.58 המתאים 72.02113 × 28 (המסה של יחידות אני חוזר) + 17.00274 (מסה של קבוצת הקצה הידרוקסיל) + 72.02168 (מסה של אניון carboxylate) + 22.98922 (מסה של הקטיון נתרן) + 38.96371 (מסה של אשלגן הקטיון). המסה התיאורטי הוא 2167.56844 אשר-0.01 ההבדל בין המוני שנצפו, מעידה על הטומאה מעקב אותו מן המים חניכה זה נצפתה ב חומר המוצא. הפולימר הזה תערוכות יינון עם אחד שווה ערך של נתרן, פעם אחת של אשלגן, אובדן של פרוטון. ההפסד של חומצה קרבוקסילית פרוטון, complexation עם שני קטיונים הוא מצב שכיח של יינון של פולימרים functionalized חומצה monocarboxylic. חשוב לציין כי בשינוי בתוך המסה הוא ציין עבור המוצרים התגובה תיול-ene אינו מתרחש עבור תרכובת זו המסתיימת חומצה קרבוקסילית אשר בהמשך מציין שזה חסר קבוצת הקצה תיול לעבור את התגובה functionalization.

figure-results-11941
איור 1:3 x 3 רשת לקביעת יחס הדגימה. באמצעות רשת 3 x 3 דגימות, הריכוזים היחסיים של cationization הסוכן analyte-מטריצה יכולים להיות באופן שיטתי מגוונים לקביעת מדעית של הכנת הדוגמא ממוטבת. בדרך כלל פעולה זו מתבצעת על-ידי החזקת אחד הקבוע משלושת המשתנים (15 µL של פתרון analyte) תוך הגדלת הכמות של השניים האחרים (סוכן cationization (ציר y) ומטריקס (ציר x)) רכיבים על ידי ערכה כפולה (3-fold בדוגמה מתואר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-12630
איור 2: MS MALDI-TOF המטרה צלחת- הצלחת המטרה MALDI-TOF MS הוא לוחית מתכת המחזיקה את הדגימות MALD-תוף MS בבארות בודדים לניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-13045
איור 3: MALDI-TOF ספקטרום מסה של 1 מדגם. ספקטרום מלא זה מציג את ההתפלגות הכללית של חומצה אצטית פוליפוני (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר (Mn= 5000) מיונן Na+ וגם K+. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-13532
איור 4: MALDI-TOF ספקטרום המונית של יחידת חוזרים בודדים של מדגם 1. ספקטרום נרחב זה מראה יחידת חוזרים בודדים של פולי (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר חומצה אצטית (Mn = 5000) עבור ניתוח הקבוצה בסוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-14028
איור 5: התגובה ערכת ולשנותן לדוגמה 1- כדי לאשר את קבוצות הקצה של חומר המוצא, poly(ethylene glycol) 2-aminoethyl אתר חומצה אצטית היה הגיבה עם 2, 4-dinitrofluorobenzene (הידוע גם בשם ריאגנט סנגר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-14512
איור 6: MALDI-TOF הספקטרום מסה של 1 מדגם השינוי. ספקטרום מלא זה מציג את ההתפלגות הכללית של חומצה אצטית פוליפוני (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר (Mn = 5000) functionalized עם 2, 4-dinitrofluorobenzene. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-15013
איור 7: MALDI-TOF ספקטרום המונית של יחידת חוזרים בודדים של מדגם 1modification. כדי לאשר סוף קבוצה functionalization, ספקטרום נרחב זה מציג יחידת חוזרים בודדים של פולי (אתילן גליקול) 2-aminoethyl אתר חומצה אצטית (Mn = 5000) לאחר התגובה עם 2, 4-dinitrofluorobenzene. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-15577
איור 8: MALDI-TOF ספקטרום המונית של מדגם 2. ספקטרום מלא זה מציג את ההתפלגות הכללית של polyoxyethylene bis(azide) (Mn = 2000) מיונן עם Na+ adducts. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-16035
איור 9: MALDI-TOF ספקטרום המונית של יחידת חוזרים בודדים של מדגם 2. ספקטרום נרחב זה מראה יחידה חוזרת של polyoxyethylene bis-אזיד (Mn = 2000) על מנת לאשר קבוצות הקצה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-16499
איור 10: התגובה ערכת ולשנותן מדגם 2. כדי לאשר את קבוצות הקצה ההתחלה גשמי, polyoxyethylene bis-אזיד (Mn = 2000) היה הגיבו 1-ethynyl-4-fluorobenzene ויה cycloaddition מזורז נחושת אזיד-אלקין (CuAAC). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-16999
איור 11: MALDI-TOF הספקטרום המונית של השינוי מדגם 2. ספקטרום מלא זה מציג את ההתפלגות הכללית של polyoxyethylene bis(azide) (Mn = 2000) functionalized עם 1-ethynyl-4-fluorobenzene. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-17481
איור 12: MALDI-TOF ספקטרום המונית של יחידת חוזרים בודדים של השינוי מדגם 2. קשת זו מציגה יחידת חוזרים בודדים של polyoxyethylene bis(azide) (Mn = 2000) הגיבו 1-ethynyl-4-fluorobenzene ויה cycloaddition נחושת מזורז אזיד-אלקין כדי לאשר סוף קבוצה functionalization. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-18045
איור 13: MALDI-TOF ספקטרום המונית של מדגם 3. ספקטרום מלא זה מציג את ההתפלגות הכללית של poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-18477
איור 14: MALDI-TOF ספקטרום המונית של יחידת חוזרים בודדים של מדגם 3. הספקטרום מציגה יחידת חוזרים בודדים של poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) כדי לאשר קבוצות הקצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-18949
איור 15: סכימת התגובה עבור מדגם 3 שינוי. כדי לאשר את קבוצות הקצה של חומר המוצא, poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) היה הגיבו maleimide באמצעות זוג תיול-ene. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-19415
איור 16: MALDI-TOF הספקטרום המונית של 3 מדגם השינוי. ספקטרום מלא זה מציג את ההתפלגות הכוללת של המוצר התגובה בין poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) ו- maleimide. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-19885
איור 17: MALDI-TOF ספקטרום המונית של יחידת חוזרים בודדים של 3 מדגם השינוי. כדי לאשר סוף קבוצה functionalization, ספקטרום נרחב זה מציג יחידת חוזרים בודדים של poly(L-lactide), תיול הסתיים (Mn = 2500) לאחר התגובה תיול-ene עם maleimide. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

MALDI-תוף ספקטרומטר מסה הוא כלי אנליטי רב ערך עבור פולימר אפיון בשל יכולתה ליצור פולימר יונים במדינה ביחידים טעון עם פיצול מינימלי. טכניקה זו יינון רך מנצל פעימות לייזר קצר כדי מפסידה solid-state דוגמאות analyte פולימריים מוטבע בתוך מטריצה מורכבת כדי ליצור פולימר יונים בשלב גז. מקרומולקולות הם בדרך כלל מיונן מאת complexation עם קטיונים הנוספים אל המטריקס כדי לאפשר ניתוח שלהם באמצעות ספקטרומטר מסה. יונים macromolecular האלה ואז הם מואצת של מתח החילוץ כדי להביא אותן לתוך האזור ללא שדה של הצינור טיסה המאפשרים שלהם מ/z נקבע בהתבסס על הזמן-של-הטיסה שלהם בין המקור יון גלאי5 , 32.

לעומת טכניקות אפיון אחרות פולימר, איכות ספקטרה MALDI-TOF MS היא תלויות מאוד פרמטרים רכישת נתונים, הכנת הדוגמא. למרות שיש נוסחה קבע עבור הכנת הדוגמא, הבנת את הפונקציה של כל רכיב של הכנת המדגם מאפשר אופטימיזציה אמפירי מהירה יותר. הגורם החשוב ביותר הכנת הדוגמא MALDI הוא הבחירה של המטריקס כי תאימות של המטריצה פולימר analyte הוא קריטי עבור המאפשר מטריקס נרגש לייצר מקרומולקולות יחיד, desorbed המדינה מיונן5, 15,17,19. ברגע המתאים סוכנים מטריקס ו- cationization נבחרו, היחס הנכון בין הסוכן analyte, מטריקס, cationization צריכה להיקבע. אפשר להשיג מדעית על-ידי יצירת רשת דו-ממדית של דגימות (איור 1) על הצלחת המטרה MALDI-TOF MS (איור 2) עם הגדלת ריכוז מטריקס על ציר אחד, הגדלת ריכוז הסוכן cationization אחרים.

בדומה הכנת הדוגמא MALDI, יש נוסחה set לקביעת פרמטרים רכישת נתונים; עם זאת, יש לשקול מגמות מסוימות כדי לזרז אופטימיזציה ספקטרלי. מצב Reflectron, אשר מגביר את הרזולוציה אך מפחית את האות הכללית, נבחר בדרך כלל נמוך טווחי המוני (בדוגמאות אלה, להלן 4,000 Da) היכן ניתן להשיג רזולוציה איזוטרופי. במקרים אלה, שימשו שיא אוסף שיטות וחישובים המונים monoisotopic. לקבלת דוגמאות פולימר עם גושים מעל 4,000 Da, שימש מצב לינארי עם חישובים המונית הממוצע ושיטות האיסוף לשחקנים. כדי לשפר את האות רזולוציה, החשמלי מקור יון צריך להיות מותאם במרווחים קטנים עם המגמה הכללית של פולימרים המונים גדול יותר יש מתח גדול יותר דיפרנציאלית (IS1 לעומת IS2).

זמן מיטבי הכנת הדוגמא ורכישה פרמטרים יכולה לספק דיוק, דיוק מסת תושג רק באמצעות כיול יעיל. הזמן-של-טיסה מסה נתון יכול להשתנות בעדינות הפרמטרים רכישה משתנה, אפילו צלחת עמדות, לכן כיול צריכה להתבצע עבור כל ערכה של רכישת ממוטבת פרמטרים על-מנת לתת מסה מדויק האישושים5,30. לאחר רכישת פרמטרים של הכנת הדוגמא מוטבו, צריך להיות מכויל הספקטרום אלה בדיוק באותם התנאים.

בגלל רזולוציה יוצאת דופן דיוק מסת שנצפתה ספקטרום המוני MALDI-TOF אופטימיזציה של פולימרים, טכניקה זו הפכה כלי חינם חשוב לקביעת פולימריות ההפצה ההמונית נתונים. עם זאת, היכולת שלו לפתור יחידות נפרדות אני חוזר תוך התפלגות מסה של פולימר מספק יתרון מסוים סוף ניתוח הקבוצה ביחס פולימר אחרות אפיון טכניקות כגון ג'ל הסתננות כרומטוגרפיה (GPC) הגרעינית תהודה מגנטית (NMR). . זה יקר במיוחד לקביעת את הנאמנות של סיום קבוצה functionalization תגובות והטבע כמותית של סיום קבוצה ההטיות תגובות. כתב היד הזה הוכיח את היכולת לפתור את המסה של פולימר בודדים יחידות אני חוזר עם נקודות לשתי ספרות עשרוניות של דיוק המוני, הפעלת האישור של סיום קבוצה שינויים עם רמה גבוהה של ביטחון. עם ההתקדמות ניכר שנעשו לאחרונה בתחום של דיוק פולימר סינתזה, MALDI-TOF MS הופך להיות כלי חשוב יותר ויותר בשביל לקבוע מבנה macromolecular ופונקציונליות.

Disclosures

המחברים יש עניין כספי הקשור את כדורי calibrants השתמשו במחקר זה.

Acknowledgements

המחברים להכיר שהאיחוד עיצוב חומרים חכמים, ניתוח ועיבוד (SMATDAP) הממומן על ידי הקרן הלאומית למדע במסגרת הסכם שיתוף פעולה IIA-1430280 וההנהלה LA עבור מלגת תואר שני ושלישי (חבר הפרלמנט האירופי). פולימר דוגמאות לניסויים אלה נמסרו על ידי MilliporeSigma (סיגמה-אולדריץ).  פרסום גישה פתוחה של מאמר זה היא בחסות MilliporeSigma.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
polyoxyethylene bis(azide) (Mn=2000)MilliporeSigma (Aldrich)689696http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en&region=US
poly(ethylene glycol) 2-amino-ethyl ether acetic acid (Mn= 5000)MilliporeSigma (Aldrich)757918http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en&region=US
poly(L-lactide), thiol terminated (Mn=2500)MilliporeSigma (Aldrich)747386http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide lowMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS20http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide mediumMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS21http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en&region=US
SpheriCal®  peptide highMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)PFS22http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en&region=US
2,4 dinitrofluorobenzeneTCIA5512
maleimideMilliporeSigma (Aldrich)129585http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en&region=US
1-ethynylfluorobenzene Fisher Scientific766-98-3
triethylamineMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)471283http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en&region=US
N,N,N',N",N"-pentamethyldiethylenetriamineMilliporeSigma (Aldrich)369497http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en&region=US
Copper(I)BromideMilliporeSigma (Aldrich)254185http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en&region=US
glacial acetic acidFisher ScientificA38212
sodium metabisulfiteMilliporeSigma (Sigma-Aldrich)13459http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en&region=US
potassium trifluoroacetateMilliporeSigma (Aldrich)281883http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en&region=US
trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properylidene]malononitrileMilliporeSigma (Aldrich)727881http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en&region=US
a-cyano-4-hydroxycinnamic acidMilliporeSigma (Sigma)C8982http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en&region=US
tetrahydrofuranFisher ScientificT425-1
dichloromethaneVWR AnalyticalBDH1113-4LG

References

  1. Wu, K. J., Odom, R. W. Peer Reviewed: Characterizing Synthetic Polymers by MALDI MS. Anal. Chem. 70, 456A-461A (1998).
  2. Lowe, A. B. Thiol-ene "click" reactions and recent applications in polymer and materials synthesis: a first update. Polym. Chem. 5, 4820-4870 (2014).
  3. Shi, Y., Cao, X., Gao, H. The use of azide-alkyne click chemistry in recent syntheses and applications of polytriazole-based nanostructured polymers. Nanoscale. 8, 4864-4881 (2016).
  4. Lutz, J. F. 1,3-dipolar cycloadditions of azides and alkynes: a universal ligation tool in polymer and materials science. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 1018-1025 (2007).
  5. Montaudo, G., Samperi, F., Montaudo, M. S. Characterization of synthetic polymers by MALDI-MS. Prog. Polym. Sci. 31, 277-357 (2006).
  6. Weidner, S. M., Trimpin, S. Mass spectrometry of synthetic polymers. Anal. Chem. 80, 4349-4361 (2008).
  7. Zhu, H., Yalcin, T., Li, L. Analysis of the accuracy of determining average molecular weights of narrow polydispersity polymers by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectr. 9, 275-281 (1998).
  8. Cortez, M. A., Grayson, S. M. Application of time-dependent MALDI-TOF mass spectral analysis to elucidate chain transfer mechanism during cationic polymerization of oxazoline monomers containing thioethers. Macromolecules. 43, 10152-10156 (2010).
  9. Liu, J., Loewe, R. S., McCullough, R. D. Employing MALDI-MS on poly(alkylthiophenes): analysis of molecular weights, molecular weight distributions, end-group structures, and end-group modifications. Macromolecules. 32, 5777-5785 (1999).
  10. Zhang, B., et al. Determination of polyethylene glycol end group functionalities by combination of selective reactions and characterization by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chim. Acta. 816, 28-40 (2014).
  11. Li, Y., Hoskins, J. N., Sreerama, S. G., Grayson, M. A., Grayson, S. M. The identification of synthetic homopolymer end groups and verification of their transformations using MALDI-TOF mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 587-611 (2010).
  12. Enjalbal, C., et al. MALDI-TOF MS analysis of soluble PEG based multi-step synthetic reaction mixtures with automated detection of reaction failure. J. Am. Soc. Mass Spectr. 16, 670-678 (2005).
  13. Laurent, B. A., Grayson, S. M. An efficient route to well-defined macrocyclic polymers via "click" cyclization. J. Am. Chem. Soc. 128, 4238-4239 (2006).
  14. Owens, K. G., Hanton, S., Li, L. Conventional MALDI sample preparation. Maldi Mass Spectrometry for Synthetic Polymer Analysis. , 129-158 (2009).
  15. Hanton, S. D. Mass spectrometry of polymers and polymer surfaces. Chem. Rev. 101, 527-570 (2001).
  16. Samperi, F., Montaudo, G., Montaudo, M. S., Montaudo, G., Lattimer, R. P. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of polymers (MALDI-MS). Mass Spectrometry of Polymers. , 419-500 (2001).
  17. Nielen, M. W. F. Maldi time-of-flight mass spectrometry of synthetic polymers. Mass Spectrom. Rev. 18, 309-344 (1999).
  18. Hanton, S. D., Owens, K. G., Barner-Kowollik, C., Gründling, T., Falkenhagen, J., Weidner, S. Polymer MALDI sample preparation. Mass Spectrometry in Polymer Chemisty. , 119-147 (2011).
  19. Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 1044-1050 (1995).
  20. Kaufmann, R., Spengler, B., Lutzenkirchen, F. Mass spectrometric sequencing of linear peptides by product-ion analysis in a reflectron time-of-flight mass spectrometer using matrix-assisted laser desorption ionization. Rapid Commun. Mass Sp. 7, 902-910 (1993).
  21. Mamyrin, B. A., Karataev, V. I., Shmikk, D. V., Zagulin, V. A. The mass-reflectron, a new nonmagnetic time-of-flight mass spectrometer with high resolution. Sov. Phys. JETP. 37, 45 (1973).
  22. Belu, A. M., DeSimone, J. M., Linton, R. W., Lange, G. W., Friedman, R. M. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry for polymer characterization. J. Am. Soc. Mass Spectr. 7, 11-24 (1996).
  23. Kaufmann, R., Chaurand, P., Kirsch, D., Spengler, B. Post-source decay and delayed extraction in matrix-assisted laser desorption/ionization-reflectron time-of-flight mass spectrometry. Are there trade-offs?. Rapid Commun. Mass Sp. 10, 1199-1208 (1996).
  24. Grayson, S. M., Myers, B. K., Bengtsson, J., Malkoch, M. Advantages of monodisperse and chemically robust "SpheriCal" polyester dendrimers as a "universal" MS calibrant. J. Am. Soc. Mass Spectr. 25, 303-309 (2014).
  25. McEwen, C. N., Larsen, R. S. Accurate mass measurement of proteins using electrospray ionization on a magnetic sector instrument. Rapid Commun. Mass Sp. 6, 173-178 (1992).
  26. Anacleto, J. F., Pleasance, S., Boyd, R. K. Calibration of ion spray mass spectra using cluster ions. J. Mass Spectrom. 27, 660-666 (1992).
  27. Fales, H. M. Calibration of mass ranges up to m/z 10,000 in electrospray mass spectrometers. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 273-276 (1999).
  28. Hop, C. E. C. A. Generation of high molecular weight cluster ions by electrospray ionization; implications for mass calibration. J. Mass Spectrom. 31, 1314-1316 (1996).
  29. Xiang, B., Prado, M. An accurate and clean calibration method for MALDI-MS. J. Biomol. Tech. 21, 116-119 (2010).
  30. Li, Y., Hoskins, J. N., Sreerama, S. G., Grayson, S. M. MALDI−TOF mass spectral characterization of polymers containing an azide group: evidence of metastable ions. Macromolecules. 43, 6225-6228 (2010).
  31. Zenobi, R., Li, L. Ionization processes and detection in MALDI-MS of polymers. MALDI Mass Spectrometry for Synthetic Polymer Analysis. , 9-26 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136desorption

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved