Límite exterior asistida por segmentación y cuantificación de huesos Trabecular por un Imagej Plugin

Resumen

Presentamos un flujo de trabajo para segmentar y cuantificar los huesos trabeculares para imágenes 2D y 3D basados en el límite exterior del hueso utilizando un plugin de ImageJ. Este enfoque es más eficiente y preciso que el actual enfoque de contorno de mano manual y proporciona cuantificaciones capa por capa, que no están disponibles en software comercial actual.

Resumen

Tomografía computada de micro (micro-CT) se utiliza rutinariamente para evaluar la cantidad de hueso y trabeculares propiedades microestructurales en pequeños animales en condiciones de pérdida de hueso diferentes. Sin embargo, el enfoque estándar para análisis trabecular de imágenes micro-CT es rebanada por rebanada semiautomática mano contorno, uso intensivo de mano de obra y propenso a errores. Se describe aquí es un método eficaz para la segmentación automática de huesos trabeculares según límites exterior del hueso, donde huesos trabeculares pueden ser identificados y segmentados automáticamente con precisión con menos sesgo del operador cuando sea apropiado se establecen parámetros de segmentación. Para Perfil de parámetros de segmentación satisfactoria, se muestra una pila de imágenes de los resultados de la segmentación, donde todas las combinaciones posibles de los parámetros de segmentación son cambiados uno por uno en secuencia, y resultados de segmentación con parámetros asociados pueden fácilmente se comprueba visualmente. Como medida de control de calidad del plugin, se cuantifican objetos estándar simulados donde pueden comparar las cantidades medidas con valores teóricos. Capa por capa la cuantificación de propiedades trabeculares y el grosor trabecular están reportados por tal un plugin, y la distribución de tales propiedades dentro de las regiones seleccionadas puede ser perfilada fácilmente. Aunque la cuantificación capa por capa retiene más información sobre huesos trabeculares y facilita aún más el análisis estadístico de los cambios estructurales, tales medidas son de carácter de la salida de software comercial actual, donde solamente una sola valor cuantificado para cada parámetro se divulga para cada muestra. Por lo tanto, los flujos de trabajo descritas son mejores enfoques para el análisis de los huesos trabeculares con precisión y eficiencia.

Introducción

Micro-CT en el análisis de huesos trabeculares es el acercamiento estándar para el seguimiento de los cambios morfológicos de los huesos en animales pequeños bajo diferentes hueso pérdida condiciones^1,2,3, donde diversas variables relacionadas con la estructuras de los huesos son reportados⁴. Sin embargo, estos parámetros no se distribuyen uniformemente en la metafísis de huesos largos⁵, y sólo un valor resumido o promedio es para cada variable estructural de cada muestra por comercial máquinas de micro-CT actual^6,7 , aunque un solo valor no puede representar completamente las características del parámetro medido en la región de análisis. Cuantificación de capa por capa de huesos trabeculares no sólo retiene más información para cada variable, sino que también permite el perfilado de las distribuciones de variables en la región de análisis, facilitar el posterior análisis estadístico de estructural cambios bajo diferentes condiciones de⁵. Por lo tanto, el objetivo de este método es cuantificar los huesos trabeculares de micro-CT explora en cada nivel de sector, que no está disponible en cualquier paquete de análisis micro-CT comercialmente disponibles actualmente.

Eficientemente segmento huesos trabecular rebanada-de-rebanar, métodos de segmentación automática son deseables. Sin embargo, la técnica estándar actual para el análisis micro-CT se basa en contorno interactivo manual seguido por interpolación semiautomático para separar los huesos trabeculares de los compartimientos corticales, que es mano de obra, errores, y asociada a importante operador diagonal^8,9,10. Se informaron los métodos de segmentación automática^11,12 , pero estos métodos sólo son óptimos en regiones con buena separación entre huesos trabeculares y corticales huesos, pero no en las regiones sin separaciones claras. Por otra parte, se requieren para diferentes muestras¹²parámetros de segmentación diferente, y es tedioso seleccionar manualmente los parámetros de segmentación satisfactorio aplicables a grupos de muestras de huesos por probar distintos de combinaciones de parámetros¹², a pesar de que el proceso de segmentación es automático cuando se establecen todos los parámetros relacionados. Como el límite exterior del hueso tiene el mayor contraste con el fondo de exploración y las cáscaras cortical metafisaria de los huesos largos muestran pocos cambios en el elegido analizar la región métodos de segmentación según el contorno del límite exterior de los huesos largos pueden forma fiable y precisa separar huesos trabeculares conchas corticales. La ventaja de este método de segmentación es que la segmentación se basa en la diferencia entre el fondo y el límite exterior del hueso, pero no en las diferencias entre los huesos trabeculares y corticales^{6,12, 13}, por lo tanto es generalmente fácil de encontrar una combinación de parámetros de segmentación que es satisfactoria para un grupo de muestras de huesos, facilitando el análisis más fiable de trabeculares cambios entre diferentes grupos.

En cada rebanada de nivel, área, perímetro y espesor (2D) bidimensional se divulgan para análisis 2D, mientras que el volumen, superficie y grosor de (3D) tridimensional se divulgan en cuantificaciones 3D. Dicha información no se divulga generalmente por las actuales herramientas de análisis de imagen, lo que indica que los procedimientos reportados pueden aplicarse a imágenes general donde se desea dicha información.

Protocolo

Procedimientos con sujetos animales fueron conducidos de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (publicación de NIH, 8ª edición, 2011) y han sido revisados y aprobada por el cuidado de Animal institucional y Comité uso de Wuhan Universidad.

1. instalación del software

1. Instalar el software ImageJ. Descargar la versión para Windows del software ImageJ (versión p 1,51) liado con Java de 64 bits de https://imagej.nih.gov/ij/. Extraiga el software descargado en una carpeta, que se hará referencia posteriormente a como el "directorio de ImageJ".
   Nota: Plugins Trabecular análisis requieren java 64 bits ejecutar tiempo (versión 1.8) y un sistema operativo de 64 bits de windows, preferiblemente un 64-bit sistema operativo Windows 7.
2. Instalar plugins de análisis trabecular. Solicitar análisis trabecular plugins de http://www.bomomics.com y descomprimir el contenido en el directorio de plugins de ImageJ, que es "ImageJ directorio/plugins".
   Nota: El plugin puede obtenerse una versión libre, donde las mediciones de 5 especifican sectores adyacentes se divulgan, o como una versión comercial, donde se puede especifica y mide una gama de sectores.

2. prepare el conjunto de datos 3D para análisis Trabecular

1. Exploración fémur de rata con un siguiente máquina micro-CT en el estándar de análisis de protocolo⁵ y luego guardar los datos en un formato que puede importarse en ImageJ, e.g., formato tiff. Si múltiples muestras de hueso fueron analizadas simultáneamente en un tubo de muestra, primero importar los datos en ImageJ y luego separar cada hueso individual por cultivo de otras muestras usando herramientas de procesamiento de imágenes de ImageJ. Posteriormente, guardar la imagen resultante en un formato que puede importarse en ImageJ más adelante.
   Nota: Un archivo de imagen de muestra representativa en el análisis se incluye (1 archivo suplementario).
2. Simulación de objetos 2D y 3D estándar.
   1. Abra el software ImageJ. Bajo los Plugins de | BoMomics | Simular objetos menú, haga clic en el botón círculo , escriba 200 el diámetro en la ventana emergente y haga clic en OK para generar el círculo simulado con un diámetro de 200 píxeles (figura 3B). Guardar el círculo generado en formato tiff.
   2. Abra el software ImageJ. Bajo los Plugins de | BoMomics | Simular objetos menú, haga clic en el botón cuadrado , introduzca 200 como la longitud del lado de la ventana emergente y haga clic en OK para generar el cuadrado simulado con una longitud lateral de 200 píxeles (figura 3B). Guardar la plaza generada en formato tiff.
   3. Abra el software ImageJ. Bajo los Plugins de | BoMomics | Simular objetos menú, haga clic en el botón de rectángulo , introduzca 200 como la anchura y 100 como la altura de la ventana emergente y haga clic en OK para generar el rectángulo simulado con un ancho de 200 píxeles y una altura de 100 píxeles (figura 3 B). Guardar el rectángulo generado en formato tiff.
      Nota: Un círculo (diámetro: 200 píxeles), un cuadrado (longitud del lado: 200 píxeles) y un rectángulo (ancho: 200 píxeles, altura: 100 píxeles) se guardan para los análisis posteriores.
   4. Abra el software ImageJ. Bajo los Plugins de | BoMomics | Simular objetos menú, haga clic en el botón del cubo , introducir 30 como la longitud del lado de la ventana emergente y haga clic en OK para generar el cubo simulado. Por último, haga clic en el Plugins | 3D | Visor de volumen a ver el cubo generado y guardar en formato tiff (figura 3C).
   5. Abra el software ImageJ. Bajo los Plugins de | BoMomics | Simular objetos menú, haga clic en el botón de rectángulo , introduzca 80 longitud 40 como el ancho y 30 como la altura de la ventana emergente, y haga clic en OK para generar el cubo simulado. Por último, haga clic en el Plugins | 3D | Visor de volumen a ver el cubo generado y guardar en formato tiff (figura 3C).
   6. Abra el software ImageJ. Bajo los Plugins de | BoMomics | Simular objetos menú, haga clic en el botón esfera , introducir 30 como el diámetro en la ventana emergente y haga clic en OK para generar el ámbito simulado. Por último, haga clic en el Plugins | 3D | Visor de volumen a ver el ámbito generado y guardar en formato tiff (figura 3C).
   7. Abra el software ImageJ. Bajo los Plugins de | BoMomics | Simular objetos menú, haga clic en el botón cilindro , introducir 30 como el diámetro y 100 como la altura de la ventana emergente y haga clic en OK para generar el cilindro simulado. Por último, haga clic en el Plugins | 3D | Visor de volumen a ver el cilindro generado y guardar en formato tiff (figura 3C).
      Nota: Una esfera (diámetro: 30 píxeles), un cubo (longitud lateral: 30 píxeles), un ortoedro (longitud: 80 píxeles, ancho: 40 píxeles; Altura: 30 píxeles) y un cilindro (diámetro: 30 pixeles, altura: 100 píxeles) se guardan para los análisis posteriores.

3. parámetros de análisis de perfiles

1. Abra el software ImageJ y abrir o importar una imagen escaneada.
2. Deslice la barra de desplazamiento inferior para elegir una rebanada, luego haga clic en imagen | Ajustar | Umbral botón. En la ventana de umbral, ajustar los valores de umbral mínimo y máximo por inspección manual para asegurarse de que los huesos están bien separados del fondo y registre el valor de umbral mínimo como el valor de umbral de hueso cortical.
   Nota: Como fabricantes de micro-CT en diferentes utilizan diferentes factores de escala para almacenar los coeficientes de atenuación de rayos x en las imágenes, el valor real debe determinarse empíricamente o por inspección manual o seguir el fabricante específico recomendaciones. En nuestra práctica, ajuste el umbral mínimo de ISQ archivos producidos por las máquinas de micro-CT a 6.000-7.000 puede confiablemente separar huesos desde el fondo de la exploración.
3. Haga clic en los Plugins de | BoMomics | Perfiles de trab Param botón. En la ventana emergente, establecer Índice de Slice a la posición del segmento representativo y la cortical ósea ("hueso de la Cort") ("gama") y valores ("paso") para el cálculo de un conjunto de umbrales corticales para Perfil de parámetros de segmentación, donde el valor de umbral de hueso cortical se adquiere al paso 3.2 (figura 1). Los valores por defecto gama y paso de 2.000 y 400 para la mayoría de las imágenes micro-CT. Establecer el Índice de corte a 5 para el conjunto de datos de ejemplo y mantener los valores por defecto para otros ajustes.
   Nota: "Cort Bone" es el umbral para los huesos corticales y el umbral utilizado para cambios perfilado parámetro desde el valor umbral más bajo para el valor de umbral más alto con el incremento del valor del paso, donde el valor de umbral más bajo es el valor de Cort Hueso - gama y el mayor valor de umbral es Cort hueso + gama. Si los valores de set para hueso de Cort, gama y paso son 6.000, 1.000 y 500, respectivamente, entonces el valor de umbral más bajo para los huesos corticales es 6.000-1, 000 = 5, 000, el valor de umbral más alto es 6, 000 + 1, 000 = 7, 000 y los umbrales utilizan en los análisis son 5.000, 5.500 6.000, 6.500 y 7.000.
4. Ajustar diámetro de ruido ("diámetro del ruido"), paso ("paso") y rango de valores ("gama") para especificar un conjunto de valores de ruido en los análisis y el diámetro del agujero "(diámetro del agujero del) (" paso ") y valores (" gama ") para el cálculo de un conjunto de valores de agujero. En general, la configuración por defecto funciona para la mayoría de las muestras de hueso de micro-CT, donde, paso, el ruido y gama son 5, 5, 2, respectivamente, y gama, de paso y diámetro de agujero son 15, 5, 2, respectivamente. Mantenga la configuración predeterminada para el conjunto de datos de ejemplo.
   Nota: "Diámetro de ruido" es el diámetro del filtro de supresión de ruido, y el "diámetro de agujero" es el diámetro de agujeros en la corteza de huesos. Los valores de ruido y agujero utilizados para perfiles de parámetro pueden ser calculados semejantemente como valores umbral cortical descritos anteriormente, utilizando el orificio de ruido especificado, gama y los valores de paso. Debido a las variaciones en el análisis parámetros al adquirir las imágenes, parámetros de ruido y el agujero deben ser determinados empíricamente según la calidad de imagen, como no general rangos de parámetros de ruido y el agujero están buenos para todos los escaneos. El valor más bajo umbral, ruido o agujeros debe ser mayor o igual a 0, y si el valor mínimo calculado es negativo mediante los parámetros proporcionados, el menor valor específico se establece en 0.
5. Haga clic en OK para realizar perfiles de parámetro. Visualmente Compruebe los resultados de la segmentación en la ventana de Resultados de perfiles de parámetro y seleccione una capa de la rebanada para que el límite exterior del hueso se describe con bastante precisión (figura 1B). Posteriormente, recuperar los parámetros de generación de perfiles a partir de la entrada en la tabla de Resultados de perfiles del parámetro correspondiente a la capa del segmento elegido (tabla 1).

4. trabecular análisis

1. Segmentación de los huesos trabeculares
   1. Abra el software ImageJ, luego abrir o importar una imagen escaneada.
   2. Haga clic en los Plugins de | BoMomics | Segmentación de trab botón y rellene los parámetros de análisis apropiado. Sistema de "Inicio", "Límite de contorno", "Trab. Huesos","Diámetro de reducción de ruido","Agujero de llenado de diámetro"y"Diámetro de espesor Cortical"5, 7.200, 7.000, 6, 12 y 25, respectivamente.
      Nota: "Inicio" y "Fin" especifica el rango de división seleccionada para la segmentación de los huesos trabeculares, "Esquema límite" es correspondiente al perfilada parámetro "Cort Bone", "Ruido reducción diámetro" a "Diámetro ruido." Parámetro y "Agujero de llenado diámetro" parámetro "Diámetro de agujero". "Diámetro de grosor cortical" es el espesor especificado para excluir los huesos corticales externos. «Trab. Los huesos "es el umbral para la extracción de los huesos trabeculares (figura 2), donde los valores se determinan usando perfiles comando parámetros de análisis como se describe en el paso 3.5.
   3. Haga clic en Aceptar para realizar la segmentación trabecular. Revise los resultados de la segmentación en la ventana de Resultados de segmentación de Trab (figura 2B). Guardar los huesos trabeculares extraídos que se muestra en la ventana de Huesos Trabecular segmentado en formato tiff (figura 2B), que puede ser más analizada por otro software.
2. Análisis de los huesos trabeculares.
   1. Abra el software ImageJ, luego abrir o importar una imagen escaneada.
   2. Haga clic en los Plugins de | BoMomics | Análisis de trab botón y rellene parámetros de análisis apropiado, como "Inicio", "Límite de contorno", "Trab. Los huesos","Diámetro de reducción de ruido","Agujero de llenado de diámetro"y"Diámetro de espesor Cortical"como describen anteriormente (figura 3A), donde se determinan los parámetros el comando perfiles análisis parámetros como se describe en paso 3.5. Sistema de "Inicio", "Límite de contorno", "Trab. Huesos","Diámetro de reducción de ruido","Agujero de llenado de diámetro"y"Diámetro de espesor Cortical"5, 7.200, 7.000, 6, 12 y 25, respectivamente.
      Nota: En la versión gratuita del plugin, se seleccionan cinco rebanadas adyacentes desde el índice especificado del sector de "Inicio" para la medición, mientras que en la versión comercial, un número arbitrario de segmentos puede ser especificado por el usuario.
   3. Seleccione una o más opciones en la sección de Informes de resultados para los parámetros a medir, donde el volumen de hueso trabecular (BV), volumen total (TV) de la región seleccionada y espesores medidos ya sea representan (2D) o tridimensional (3D) están disponibles para la selección a través de tres casillas de verificación, es decir, "BV sólo TV", "2D" y "3D". Seleccione las casillas de "2D" y "3D", haga clic en "Aceptar" para realizar análisis trabecular (figura 3, tabla 2).
      Nota: Cuando "BV TV sólo", sin importar el estado de selección de "2D" y "3D", se reportan medidas crudas de BV, TV y la intensidad, y los huesos trabeculares segmentados son extraídos y aparecerá en una nueva ventana, que puede guardar y más analizada por otras software. Cuando está seleccionada "2D", se divulgan medidas crudas de BV, TV, intensidad y espesores medidos representan en cada nivel de segmento utilizando el modelo de placa. Si está marcado "3D", espesor tridimensional para cada voxel se calcula directamente sin cualquier asunción del modelo, luego crudas medidas de BV, TV, intensidad y espesor tridimensional muestreados en cada nivel de la rodaja se divulga. Si ninguna opción es seleccionada, huesos trabeculares están segmentados mediante el anterior conjunto de parámetros, pero no se informó de ninguna medición.

5. cuantificar objetos simulados

1. Software ImageJ, y abra una imagen simulada. Aquí, abrir la esfera simulada con un diámetro de 30 píxeles por ejemplo.
2. Seleccionar los Plugins de | BoMomics | Análisis de trab botón y rellene los parámetros adecuados de análisis como se describe anteriormente. Mantenga los valores predeterminados de "Inicio", "Fin", "Límite de contorno", "Trab. Huesos"y"Diámetro de reducción de ruido","Diámetro de reducción de ruido","Agujero de llenado de diámetro"y"Diámetro de espesor Cortical"a 0 (figura 3).
   Nota: Para objetos simulados, no ruido de señal no deseados, y no pueden existir cáscaras corticales correspondientes. Por lo tanto, se deben establecer parámetros para tales valores apropiadamente (por defecto está a cero). Para cuantificaciones 3D, 30 rebanadas antes y después el segmento especificado "Start" se procesan utilizando la versión gratuita del plugin, mientras que sólo rebanadas en el rango especificado por rebanadas de "Inicio" y "Fin" son analizadas por la versión comercial del plugin.
3. En la sección de Informes de resultados , seleccione "2D" y "3D" para los parámetros a medir y haga clic en OK para realizar análisis de trabecular para el objeto simulado (tabla 3).

6. calibración de medidas Trabecular y presentación de datos: Perfil de la distribución de medidas Trabecular en la región analizando las

1. Obtener la información de calibración del conjunto de datos escaneado, según las instrucciones del proveedor de micro-CT.
   Nota: Solamente crudas medidas de BV, TV, intensidad y grosores son registradas por el plugin. Para obtener medidas comparables a los informes generados por otros programas, calibración del resultado es el deseado.
2. Abra Microsoft Excel y abra la tabla de resultados informados. Calcular calibrado hueso volumen (BV), total volumen (TV), contenido mineral óseo (BMC), fracción de volumen de hueso (BV/TV) y densidad mineral ósea (DMO) en nuevo excel columnas utilizando los valores reportados de BV, TV y la intensidad crudos según las siguientes expresiones.
3. Nota: Escaneo resolución (resolución, μm), escala de grises (escala), unidades de densidad (mg HA/cm³), pendiente (slope) de la densidad y intercept (interceptar) de la densidad pueden ser extraídos de las micro-CT en imagen o meta archivos escaneados, como el archivo Scanco ISQ. Por lo tanto, las medidas calibradas se calculan como sigue:
   Suponga BV, la TV y la intensidad son medidas crudas, BV_c y TV_c son valores calibrados, resolución, escala, pendiente, intercepto son de archivos de calibración de micro - CT imágenes.
   BV_c = resolución de × BV³ [μm³]
   TV_c = resolución de TV ׳ [μm³]
   BV / TV = BV ÷ TV
   BMC = (intensidad ÷ escala × pendiente - intercepción de × BV) resolución ׳ × 10^-12 [mg HA]
   DMO - BMC ÷ TV_c × 10¹² [mg HA / cm³]
4. Crear un diagrama XY (dispersión) medidas calibrado (Y) contra capas de corte (X) utilizando el software de Microsoft Excel (figura 4).

Resultados

El plugin de análisis trabecular está diseñado para segmentar y cuantificar huesos trabeculares con exactitud automáticamente. Inicialmente, ósea límite externo es detectado y delineado seguida de una operación de relleno de agujero donde se llenan los orificios dentro de cáscaras cortical externa del hueso. Luego se realiza una operación de erosión para excluir los huesos corticales externos y los huesos trabeculares segmentados. Finalmente, se cuantifican las medidas de huesos...

Discusión

Este estudio describe un plugin de ImageJ para el análisis de los huesos trabeculares, que es automático, eficiente, y fácil de usar. El plugin también puede utilizarse para cuantificar objetos 2D o 3D, capa por capa medidas de áreas, volúmenes y espesores. Actualmente, sólo un único valor medido para cada parámetro trabecular se divulga para cada muestra por análisis estándar de micro-CT, que no pueden representar completamente las características de la entidad medida en la región de análisis seleccionada....

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ	NIH	imagej	Any version with a java 1.8 run time
trabecular analysis plugin	Bomomics	bomomics	free or commercial version
Micro CT scanner	Scanco	μ-50	micro CT from any vendor
Computer System	Lenovo		any brand
Windows Operating System	Microsoft	Windows 7 x64	any 64-bit Windows operating system
Office Software	Microsoft	Office 2010	any speadsheet software that has xy chart function