Limite externo assistido segmentação e quantificação dos ossos Trabecular por um Plugin do Imagej

Resumo

Apresentamos um fluxo de trabalho para segmentar e quantificação dos ossos trabecular para imagens 2D e 3D, com base no limite externo do osso, usando um plugin do ImageJ. Esta abordagem é mais eficiente e precisa do que a atual abordagem manual mão-contorno e fornece quantificações de camada por camada, que não estão disponíveis no software comercial atual.

Resumo

Microtomografia computadorizada (micro-CT) é usada rotineiramente para avaliar a quantidade óssea e trabecular Propriedades microestrutural em pequenos animais sob condições de perda óssea diferentes. No entanto, a abordagem padrão trabecular análise de imagens de micro-CT pedaço por pedaço semi-automática mão-contorno, que é mão de obra intensiva e sujeito a erros. Descrito aqui é um método eficiente para segmentação automática de ossos trabecular de acordo com os limites exteriores do osso, onde os ossos trabecular podem ser identificados e segmentados, automaticamente, com precisão, com menos preconceito do operador quando apropriado parâmetros de segmentação são definidos. Para o perfil de parâmetros de segmentação satisfatória, é exibida uma pilha de imagem dos resultados de segmentação, onde todas as combinações possíveis dos parâmetros de segmentação são alterados um por um, em sequência, e resultados de segmentação com parâmetros associados pode facilmente ser visualmente verificada. Como um recurso de controle de qualidade do plugin, objetos padrão simulados são quantificados onde as quantidades medidas podem ser comparadas com valores teóricos. Quantificação de camada por camada de propriedades trabecular e espessuras trabecular são relatados por este plugin, e as distribuições de tais propriedades dentro as regiões selecionadas podem ser perfiladas facilmente. Embora a quantificação de camada por camada retém mais informações sobre ossos trabecular e facilita ainda mais a análise estatística das mudanças estruturais, essas medidas são indisponíveis desde a saída do atual software comercial, onde apenas um único quantificado o valor para cada parâmetro é relatado para cada amostra. Portanto, os fluxos de trabalho descritos são melhores abordagens para a análise de ossos trabecular com precisão e eficiência.

Introdução

Análise de micro-CT dos ossos trabecular é a abordagem padrão para acompanhamento de alterações morfológicas dos ossos em pequenos animais sob diferentes osso perda condições^1,2,3, onde diversas variáveis relacionadas com o estruturas dos ossos são relatados⁴. No entanto, esses parâmetros não estão distribuídos uniformemente na metáfise de ossos longos⁵, e somente um valor resumido ou média é relatado para cada variável estrutural de cada amostra pelo atual comercial máquinas de micro-CT^6,7 , embora um único valor totalmente não pode representar as características do parâmetro medido na região analisando. Quantificação de camada por camada de ossos trabecular não só retém mais informações para cada variável, mas também permite a criação de perfil das distribuições das variáveis na região analisa, facilitando a posterior análise estatística da estrutural alterações sob diferentes condições de⁵. Portanto, o objetivo desse método é quantificar ossos trabecular de microtomografia computadorizada em cada nível de fatia, o que não está disponível em qualquer pacote de análise de micro-CT comercialmente disponíveis atualmente.

De forma eficiente segmento ossos trabecular fatia-por-fatia, métodos de segmentação automática são desejáveis. No entanto, a técnica padrão atual para a análise de micro-CT baseia-se no contorno interativo manual seguido por interpolação semi-automática para separar os ossos trabecular dos compartimentos corticais, que é trabalhoso, sujeito a erros, e associado com operador substancial viés^8,9,10. Métodos de segmentação automática^11,12 foram relatados, mas tais métodos são apenas ideais em regiões com boa separação entre os ossos trabecular e corticais ossos, mas não em regiões sem separações de cores claras. Além disso, são necessários para diferentes amostras de¹²parâmetros de segmentação diferente, e é tedioso selecionar manualmente os parâmetros de segmentação satisfatória aplicáveis aos grupos de amostras de osso tentando várias combinações parâmetro¹², mesmo que o processo de segmentação é automático quando situam-se todos os parâmetros relacionados. Como o limite externo do osso tem o maior contraste com o fundo de digitalização e as conchas cortical metafisária de ossos longos mostram poucas mudanças no escolhido analisando a região, métodos de segmentação de acordo com o contorno limite externo de ossos longos pode confiável e com precisão separe os ossos trabecular conchas corticais. A vantagem de um tal método de segmentação é que a segmentação é baseada na diferença entre o fundo e o limite externo do osso, mas não sobre as diferenças entre os ossos trabecular e cortical^{6,12, 13}, portanto, é geralmente fácil de encontrar uma combinação de parâmetros de segmentação que é satisfatória para um grupo de amostras de osso, facilitando a análise mais confiável de trabecular mudanças entre os diferentes grupos.

Em cada fatia de nível, área, perímetro e bidimensional (2D) de espessura são relatados para análise 2D, enquanto o volume, superfície e espessura de tridimensional (3D) são relatados em 3D quantificações. Tais informações geralmente não são relatadas por ferramentas de análise de imagem atual, indicando que os procedimentos relatados podem ser aplicados a imagens gerais onde tal informação for desejada.

Protocolo

Procedimentos envolvendo assuntos animais foram conduzidos de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (publicação de NIH, 8ª edição, 2011) e já foi revisados e aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Wuhan Universidade.

1. software instalação

1. Instale o software ImageJ. Baixe a versão Windows do software ImageJ (versão 1,51 p) junto com o Java 64-bit de https://imagej.nih.gov/ij/. Extraia o software baixado em uma pasta, que será posteriormente referida como o "diretório ImageJ".
   Nota: Plugins Trabecular análise requerem tempo de 64-bit java executar (versão 1.8) e um sistema operacional de 64 bits do windows, de preferência um 64-bit sistema operacional Windows 7.
2. Instale plugins análise trabecular. Solicitar análise trabecular plugins do http://www.bomomics.com e descompacte o conteúdo para o diretório de plugins do ImageJ, que é "ImageJ diretório/plugins".
   Nota: O plugin pode ser obtido como uma versão gratuita, onde as medições para 5 especificado fatias adjacentes são relatadas, ou como uma versão comercial, onde uma série de fatias pode ser especificada e medida.

2. preparar o conjunto de dados 3D para análise Trabecular

1. Varredura de fêmures de ratos com um seguinte máquina micro-CT o padrão de varredura protocolo⁵ e então salvar os dados em um formato que pode ser importado no ImageJ, por exemplo, o formato tiff. Se várias amostras de osso foram escaneadas simultaneamente em um tubo de amostra única, primeiro importar os dados para o ImageJ e em seguida, separe cada osso individual por cortando fora outras amostras usando ferramentas de processamento de imagem do ImageJ. Posteriormente, salve a imagem resultante em um formato que pode ser importado para ImageJ mais tarde.
   Nota: Um arquivo de imagem de amostra representativa usado na análise está incluído (arquivo complementar 1).
2. Simule o padrão objetos 2D e 3D.
   1. Abra o software ImageJ. Sob os Plugins | BoMomics | Simular objetos menu, clique com o botão círculo e digite 200 como o diâmetro na janela pop-up, clique Okey para gerar simulado círculo com um diâmetro de 200 pixels (Figura 3B). Salve o círculo gerado no formato tiff.
   2. Abra o software ImageJ. Sob os Plugins | BoMomics | Simular objetos menu, clique no botão quadrado e digite 200 como o comprimento do lado na janela pop-up, clique Okey para gerar a Praça simulada com um comprimento lateral de 200 pixels (Figura 3B). Salve a Praça gerada no formato tiff.
   3. Abra o software ImageJ. Sob os Plugins | BoMomics | Simular objetos menu, clique no botão retângulo e digite 200 como a largura e 100 como a altura em janela pop-up, clique Okey para gerar o retângulo simulado com uma largura de 200 pixels e uma altura de 100 pixels (Figura 3 B). Salve o retângulo gerado no formato tiff.
      Nota: Um círculo (diâmetro: 200 pixels), um quadrado (comprimento lateral: 200 pixels de) e um retângulo (largura: 200 pixels; Altura: 100 pixels) são salvos para as análises subsequentes.
   4. Abra o software ImageJ. Sob os Plugins | BoMomics | Simular objetos menu, clique no botão do cubo e digite 30 como o comprimento do lado na janela pop-up, clique Okey para gerar o cubo simulado. Finalmente, clique no Plugins | 3D | Visualizador de volume para exibir o cubo gerado e salve-o no formato tiff (Figura 3C).
   5. Abra o software ImageJ. Sob os Plugins | BoMomics | Simular objetos menu, clique no botão cuboides e digite 80 comprimento 40 como a largura e 30, como a altura em janela pop-up, clique Okey para gerar o cuboide simulado. Finalmente, clique no Plugins | 3D | Visualizador de volume para exibir o cuboide gerado e salve-o no formato tiff (Figura 3C).
   6. Abra o software ImageJ. Sob os Plugins | BoMomics | Simular objetos menu, clique no botão de esfera e digite 30 como o diâmetro na janela pop-up, clique Okey para gerar a esfera simulada. Finalmente, clique no Plugins | 3D | Visualizador de volume ver a esfera gerada e salve-o no formato tiff (Figura 3C).
   7. Abra o software ImageJ. Sob os Plugins | BoMomics | Simular objetos menu, clique no botão do cilindro e digite 30 como o diâmetro e 100 como a altura em janela pop-up, clique Okey para gerar o cilindro simulado. Finalmente, clique no Plugins | 3D | Visualizador de volume para ver o cilindro gerado e salve-o no formato tiff (Figura 3C).
      Nota: Uma esfera (diâmetro: 30 pixels), um cubo (comprimento lateral: 30 pixels), um cuboide (comprimento: 80 pixels; largura: 40 pixels; Altura: 30 pixels) e um cilindro (diâmetro: 30 pixels; Altura: 100 pixels) são salvos para as análises subsequentes.

3. parâmetros de análise de perfil

1. Abra o software ImageJ e abrir ou importar uma imagem digitalizada.
2. Deslize a barra de rolagem inferior para escolher uma fatia e, em seguida, clique o imagem | Ajustar | Limite botão. Na janela pop-up de limiar, ajustar os valores de limiar mínimo e máximo por inspeção manual para garantir que os ossos são bem separados do fundo e registre o valor de limiar mínimo como o valor de limite do osso cortical.
   Nota: Como fabricantes de micro-CT diferentes usam diferentes fatores de escala para armazenar as imagens os coeficientes de atenuação de raios-x, o valor real limite deve ser determinado empiricamente por inspeção manual ou do fabricante específico a seguir recomendações. Em nossa prática, definir o limite mínimo para arquivos do CEI produzida por máquinas de micro-CT para 6.000-7.000 pode confiantemente separar ossos do fundo varredura.
3. Clique Plugins | BoMomics | Trab Param de perfil botão. Na janela pop-up, definir Índice de fatia para a posição da fatia representativa e definir o osso cortical ("osso de Cort"), gama ("gama") e valores ("passo") para o cálculo de um conjunto de limites corticais para perfil de parâmetros de segmentação, onde o valor de limiar de osso cortical é adquirido pelo passo 3.2 (Figura 1). Gama e passo valores padrão de trabalho 2.000 e 400 para a maioria das imagens de micro-CT. Definir o Índice de fatia de 5 para o conjunto de dados de exemplo e mantenha os valores padrão para outras configurações.
   Nota: "Osso de Cort" é o limite para ossos corticais e o valor do limite utilizado para alterações de perfil parâmetro do valor limiar mais baixo para o valor de limiar mais alto com o incremento do valor do passo, onde o valor de limiar mais baixo é o valor de Cort Osso - gama e o maior valor de limiar é osso Cort + intervalo. Se os valores definidos para osso Cort, gama e passo são 6.000, 1.000 e 500, respectivamente, em seguida, o menor valor de limiar para ossos corticais é 6.000-1, 000 = 5, 000, valor limite máximo é de 6, 000 + 1, 000 = 7, 000 e os limiares utilizados em análises são 5.000, 5.500, 6.000, 6.500 e 7.000.
4. Defina o diâmetro de ruído ("diâmetro de ruído"), passo ("") e faixa de valores ("Range") para especificar um conjunto de valores de ruído nas análises e o diâmetro do furo ("diâmetro de furo") ("passo") e valores de gama ("gama") para o cálculo de um conjunto de valores de buraco. Em geral, a configuração padrão funciona para a maioria das amostras de osso de micro-CT, onde ruído, passo e gama são 5, 5, 2, respectivamente, e gama, passo e diâmetro do furo são 15, 5, 2, respectivamente. Mantenha as configurações padrão para o conjunto de dados de exemplo.
   Nota: "Diâmetro de ruído" é o diâmetro do filtro de supressão de ruído, e o diâmetro de"buraco" é o diâmetro para buracos dentro dos ossos corticais. Os valores de ruído e o buraco usados para perfilação de parâmetro podem ser calculados da mesma forma como valores de limiar cortical descritos acima, usando o especificado ruído/buraco, gama e passo valores. Devido as variações nos parâmetros de digitalização aquando da aquisição de imagens, parâmetros de ruído e o buraco devem ser determinados empiricamente de acordo com a qualidade de imagem, como sem intervalos gerais dos parâmetros de ruído e buraco são bons para todos os exames. O menor valor de limiar, ruído ou furos deve ser maior ou igual a 0, e se o menor valor calculado é negativo usando os parâmetros fornecidos, o menor valor específico é definido como 0.
5. Clique em Okey para executar o parâmetro de criação de perfil. Visualmente a verificar os resultados da segmentação na janela de Resultados de criação de perfil de parâmetro e selecione uma camada de fatia, para que o limite externo do osso é delineado com bastante precisão (Figura 1B). Posteriormente, recupere os parâmetros de perfil a partir da entrada na tabela de Resultados de criação de perfil de parâmetro correspondente à camada de fatia escolhido (tabela 1).

4. trabecular análise

1. Segmentação dos ossos trabecular
   1. Abra o software ImageJ, em seguida, abrir ou importar uma imagem digitalizada.
   2. Clique Plugins | BoMomics | Segmentação de trab botão e preencher os parâmetros de análise adequada. Definir o "Iniciar", "Limite de contorno", "Trab. Ossos","Diâmetro de redução de ruído","Buraco de enchimento diâmetro"e"Diâmetro de espessura Cortical"para 5, 7.200, 7.000, 6, 12 e 25, respectivamente.
      Nota: "Start" e "End" especifica o intervalo de fatia selecionada para segmentação dos ossos trabecular, "Limite de estrutura de tópicos" é correspondente ao parâmetro perfilado de "Cort-osso", "Diâmetro de redução de ruído" para "Diâmetro de ruído" Parâmetro e "Buraco preenchendo dia." para o parâmetro "Diâmetro de furo". "Espessura cortical diâmetro" é a espessura especificada para excluindo os ossos corticais externas. "Trab. Ossos "são o limite para a extração de ossos trabecular (Figura 2), onde as configurações são determinadas usando o comando de parâmetros de análise de perfil, conforme descrito na etapa 3.5.
   3. Clique em Okey para realizar a segmentação trabecular. Verificar visualmente os resultados de segmentação na janela de Resultados de segmentação de Trab (Figura 2B). Salve os ossos trabecular extraídos mostrados na janela de Ossos Trabecular segmentado em formato tiff (Figura 2B), que pode ser mais analisada por outro software.
2. Análise dos ossos trabecular.
   1. Abra o software ImageJ, em seguida, abrir ou importar uma imagem digitalizada.
   2. Clique Plugins | BoMomics | Análise de trab botão e preencher os parâmetros de análise adequadas, tais como "Start", "Limite de contorno", "Trab. Ossos","Diâmetro de redução de ruído","Diâmetro de furo de enchimento"e"Diâmetro de espessura Cortical"como descreveram acima (Figura 3A), onde as configurações são determinadas usando o comando de parâmetros de análise de perfil, como descrito no passo 3.5. Definir o "Iniciar", "Limite de contorno", "Trab. Ossos","Diâmetro de redução de ruído","Buraco de enchimento diâmetro"e"Diâmetro de espessura Cortical"para 5, 7.200, 7.000, 6, 12 e 25, respectivamente.
      Nota: Na versão gratuita do plugin, cinco fatias adjacentes, começando o índice especificado do fatia "Start" são selecionadas para medição, enquanto a versão comercial, um número arbitrário de fatias pode ser especificado pelo usuário.
   3. Selecione uma ou mais opções na seção de Relatórios de resultados para os parâmetros a medir, onde o volume ósseo trabecular (BV), o volume total (TV) da região selecionada e espessuras medido qualquer forma bidimensional (2D) ou tridimensional (3D) estão disponíveis para seleção através de três caixas de seleção, ou seja "BV TV só", "2D" e "3D". Selecione as caixas de seleção "2D" e "3D", clique em "Okey" para executar a análise trabecular (Figura 3, tabela 2).
      Nota: Quando "TV BV só" estiver marcada, independentemente do status de seleção de "2D" e "3D", crus medidas de BV, TV e intensidade são relatadas, e os ossos trabecular segmentados são extraídos e exibidos em uma nova janela, que pode ser salvos e mais analisada por outro software. Quando "2D" estiver marcada, crus medidas de BV, TV, intensidade e espessuras medidas de forma bidimensional em cada fatia de nível usando o modelo de placa são relatadas. Se "3D" estiver marcada, espessura tridimensional para cada voxel é calculada diretamente, sem qualquer hipótese de modelo, então crus medidas de BV, TV, intensidade e espessuras tridimensionais amostradas em cada nível da fatia são relatadas. No entanto, caso não esteja selecionada, ossos trabecular são segmentados usando o conjunto acima dos parâmetros, mas nenhuma medição é relatada.

5. quantificação dos objetos simulados

1. Abra o software ImageJ e, em seguida, abrir uma imagem simulada. Aqui, abra a simulado esfera com um diâmetro de 30 pixels como exemplo.
2. Selecione os Plugins | BoMomics | Análise de trab botão e preencher os parâmetros de análise apropriado conforme descrito anteriormente. Mantenha os valores padrão para "Iniciar", "Fim", "Limite de contorno", "Trab. Ossos"e definir"Diâmetro de redução de ruído","Diâmetro de redução de ruído","Buraco de enchimento diâmetro"e"Diâmetro de espessura Cortical"para 0 (Figura 3).
   Nota: Para objetos simulados, não há nenhum ruído de sinal não intencionais, e pode haver sem conchas corticais correspondentes. Portanto, parâmetros para tais valores devem ser definidos apropriadamente (configurações padrão são a zero). Para 3D quantificações, 30 fatias de antes e depois a fatia de "Start" especificada são processadas usando a versão gratuita do plugin, enquanto apenas fatias no intervalo especificado pelo "Start" e "Fim" fatias são analisadas pela versão comercial do plugin.
3. Na seção de Relatórios de resultados , selecione "2D" e "3D" para os parâmetros a medir e clicar Okey para executar análise trabecular para o objeto simulado (tabela 3).

6. calibração de medidas Trabecular e apresentação de dados: perfil as distribuições das medidas Trabecular na região selecionada analisando

1. Obter as informações de calibração do conjunto de dados digitalizado, de acordo com instruções do fornecedor micro-CT.
   Nota: Apenas crus medidas de BV, TV, intensidade e espessuras são relatadas pelo plugin. Para obter medidas comparáveis aos relatórios gerados por outros softwares, calibração de resultado é desejada.
2. Abra o Microsoft Excel e abra a tabela de resultados relatados. Calcular calibrado volume ósseo (BV), total volume (TV), conteúdo mineral ósseo (BMC), fração de volume de osso (BV/TV) e densidade mineral óssea (DMO) no novo excel colunas usando os valores brutos relatados BV, TV e intensidade de acordo com as seguintes expressões.
3. Nota: Digitalização resolução (resolução, µm), escala de cinza (escala), unidades de densidade (mg HA/cm³), inclinação de densidade (inclinação) e interceptação de densidade (intercepção) podem ser extraídos com os micro-CT imagem ou meta arquivos digitalizados, tais como o arquivo Scanco ISQ. Portanto, as medidas calibradas são calculadas como segue:
   Suponha que BV, TV e intensidade são medidas crus, BV_c e TV_c são valores calibrados, resolução, escala, inclinação, intercepção são arquivos de calibração de micro - CT imagens.
   BV_c = BV × resolução³ [μm³]
   TV_c = resolução de TV ׳ [μm³]
   BV / TV = BV ÷ TV
   BMC = (intensidade ÷ dimensionamento × inclinação - interceptação de × BV) resolução ׳ × 10^-12 [mg HA]
   BMD - BMC ÷ TV_c × 10¹² [mg HA / cm³]
4. Crie uma trama de dispersão (XY) para medidas calibradas (Y) contra camadas de fatia (X) utilizando o software Microsoft Excel (Figura 4).

Resultados

O plugin de análise trabecular é projetado para automaticamente segmentar e ossos trabecular de quantificar com precisão. Inicialmente, osso limite externo é detectado e delineado seguido por uma operação de preenchimento de buracos onde qualquer buracos dentro de conchas cortical externa do osso são preenchidos. Então, uma operação de erosão é realizada para excluir os ossos corticais externas e pegar os ossos trabecular segmentados. Finalmente, as medidas dos ossos trabecula...

Discussão

Este estudo descreve um ImageJ plugin para análise de ossos trabecular, que é automático, eficiente, e amigável. O plugin também pode ser usado para quantificar qualquer objecto 2D ou 3D para medidas de camada por camada de áreas, volumes e espessuras. Atualmente, apenas um único valor medido para cada parâmetro trabecular é relatado para cada amostra por análise de micro-CT padrão, que não representa totalmente as características da entidade medida na região selecionada analisa. O plugin descrito relata qu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ	NIH	imagej	Any version with a java 1.8 run time
trabecular analysis plugin	Bomomics	bomomics	free or commercial version
Micro CT scanner	Scanco	μ-50	micro CT from any vendor
Computer System	Lenovo		any brand
Windows Operating System	Microsoft	Windows 7 x64	any 64-bit Windows operating system
Office Software	Microsoft	Office 2010	any speadsheet software that has xy chart function