Contorno esterno assistita segmentazione e quantificazione delle ossa Trabecular da un Plugin di Imagej

Riepilogo

Vi presentiamo un flusso di lavoro per segmentare e quantificare le ossa trabecular per immagini 2D e 3D basate sul contorno esterno di osso utilizzando un plugin di ImageJ. Questo approccio è più efficiente e preciso rispetto l'attuale approccio manuale mano-contornatura e fornisce a strati quantificazioni, che non sono disponibili nel software commerciale corrente.

Abstract

Micro-tomografia (micro-CT) è usata ordinariamente per valutare la quantità di osso e trabecular proprietà microstrutturali nei piccoli animali in condizioni di perdita di osso diverso. Tuttavia, l'approccio standard per trabecular analisi delle immagini di micro-CT è da affettare a mano semi-automatico-contornatura, che è ad alta intensità di manodopera e soggetto a errori. Qui descritto è un metodo efficiente per la segmentazione automatica delle ossa trabecular secondo limiti esterni di osso, dove trabecular ossa possono essere identificate e segmentate automaticamente con precisione con meno pregiudizi operatore quando appropriato parametri di segmentazione sono impostati. Per profilare i parametri di segmentazione soddisfacente, viene visualizzata una serie di immagini di risultati di segmentazione, dove tutte le possibili combinazioni dei parametri di segmentazione sono cambiato uno per uno in sequenza, e risultati di segmentazione con parametri associati possono facilmente essere controllato visivamente. Come una funzionalità di controllo di qualità del plugin, simulati oggetti standard sono quantificati dove le grandezze misurate possono essere confrontati con i valori teorici. Quantificazione di strato dopo strato di proprietà trabecular e trabecular spessori sono segnalati da un plugin, e le distribuzioni di tali proprietà all'interno di regioni selezionate possono essere profilate facilmente. Anche se la quantificazione strato dopo strato mantiene le informazioni ulteriori sulle ossa trabecular e facilita ulteriormente l'analisi statistica dei cambiamenti strutturali, tali misure non sono disponibili dall'output del software commerciali attuale, dove una sola quantificati valore per ciascun parametro viene segnalato per ogni campione. Di conseguenza, i flussi di lavoro descritti sono gli approcci migliori per analizzare le ossa trabecular con precisione ed efficienza.

Introduzione

Analisi di micro-CT delle ossa trabecular sono l'approccio standard per tenere traccia delle modifiche morfologiche delle ossa in piccoli animali sotto differenti dell'osso perdita condizioni^1,2,3, dove diverse variabili relative alla strutture delle ossa sono segnalati⁴. Tuttavia, tali parametri non sono distribuiti uniformemente nella metafisi delle ossa lunghe⁵, e solo un valore di riepilogo o una media viene segnalato per ogni variabile strutturale di ogni campione di corrente commerciale macchine micro-CT^6,7 , anche se un singolo valore non può rappresentare appieno le caratteristiche del parametro misurato nella regione analyzing. Strati-quantificazione delle ossa trabecular non solo mantiene ulteriori informazioni per ogni variabile, ma consente anche la profilatura delle distribuzioni di tali variabili nella regione analyzing, facilitando la successiva analisi statistica dei fondi strutturali modifiche sotto diverse condizioni⁵. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è quantificare trabecular ossa di micro-TAC ad ogni livello della fetta, che non è attualmente disponibile in qualsiasi pacchetto di analisi micro-CT commercialmente disponibile.

Per in modo efficiente segmento trabecular ossa-di-affettare, metodi di segmentazione automatica sono desiderabili. Tuttavia, l'attuale tecnica standard per l'analisi di micro-CT è basata su manuale interattivo contornatura seguita da interpolazione semiautomatica per separare le ossa trabecular dai comparti corticale, che è lavoro intensivo, errori, e associato con operatore sostanziale bias^8,9,10. Segmentazione automatica metodi^11,12 sono stati segnalati, ma tali metodi sono ottimali solo in regioni con buona separazione tra ossa trabecular e corticale delle ossa, ma non nelle regioni senza separazioni chiare. Inoltre, segmentazione diversi parametri sono necessari per diversi campioni¹², ed è noioso selezionare manualmente i parametri di segmentazione soddisfacente applicabili ai gruppi di campioni di osso provando varie combinazioni a parametro¹², anche se il processo di segmentazione è automatico quando vengono impostati tutti i parametri correlati. Come il limite esterno dell'osso è il più grande contrasto con lo sfondo di scansione e i gusci corticali metafisarie delle ossa lunghe mostrano alcuni cambiamenti nella scelta analizzando regione, metodi di segmentazione in base alla distribuzione di contorno esterno delle ossa lunghe può in modo affidabile e preciso separare trabecular ossa da gusci di corticale. Il vantaggio di un tal metodo di segmentazione è che la segmentazione si basa sulla differenza tra lo sfondo e contorno esterno dell'osso, ma non sulle differenze tra ossa trabecular e corticale^{6,12, 13}, pertanto è generalmente facile da trovare una combinazione di parametri di segmentazione che è soddisfacente per un gruppo di campioni di ossa, facilitando l'analisi più affidabile trabecular variazioni tra i diversi gruppi.

Presso ogni fetta livello, area, perimetro e bidimensionali (2D) spessore sono segnalati per analisi 2D, mentre volume, superficie e spessore di tridimensionale (3D) sono segnalati in 3D quantificazioni. Tali informazioni non viene generalmente segnalate da strumenti di analisi di immagine corrente, che indica che le procedure riportate possono essere applicate alle immagini generale dove tali informazioni sono desiderate.

Protocollo

Procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (pubblicazione NIH, 8a edizione, 2011) e sono state esaminate e approvate dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Wuhan Università.

1. installazione del software

1. Installare il software ImageJ. Scarica la versione per Windows del software ImageJ (versione p 1,51) in bundle con Java a 64 bit da https://imagej.nih.gov/ij/. Estrarre il software scaricato in una cartella, che sarà successivamente di cui a come "ImageJ Directory".
   Nota: Analisi Trabecular plugin richiedono java a 64 bit eseguita tempo (versione 1.8) e un sistema operativo windows a 64 bit, preferibilmente un sistema operativo di Windows 7 64-bit.
2. Installare i plugin di analisi trabecular. Richiesta analisi trabecular plugin da http://www.bomomics.com e decomprimere il contenuto nella directory dei plugin di ImageJ, che è "ImageJ Directory/plugins".
   Nota: Il plugin può essere ottenuto come una versione gratuita, dove le misurazioni per 5 specificato fette adiacenti sono segnalati, o come una versione commerciale, dove una gamma di fette può essere specificata e misurata.

2. preparare il set di dati 3D per l'analisi Trabecular

1. Scansione dei femori di ratto con un seguito di micro-CT macchina il protocollo n.⁵ di controllo standard e quindi salvare i dati in un formato che può essere importato in ImageJ, ad esempio, il formato tiff. Se campioni multipli dell'osso sono stati scansionati simultaneamente in una singola provetta, prima di importare i dati in ImageJ e quindi separare ogni singolo osso ritagliando fuori altri esempi che utilizzano strumenti di elaborazione delle immagini di ImageJ. Successivamente, è possibile salvare l'immagine risultante in un formato che può essere importato in ImageJ più tardi.
   Nota: È incluso un file di immagine campione rappresentativo utilizzato nell'analisi (complementare File 1).
2. Simulare oggetti 2D e 3D standard.
   1. Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante cerchio e immettere 200 come il diametro nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il cerchio simulato con un diametro di 200 pixel (Figura 3B). Salvare il cerchio generato in formato tiff.
   2. Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante quadrato e immettere 200 come la lunghezza laterale nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare la piazza simulata con una lunghezza laterale di 200 pixel (Figura 3B). Salvare la piazza generata in formato tiff.
   3. Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante rettangolo e immettere 200 come la larghezza e 100 come l'altezza nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il rettangolo simulato con una larghezza di 200 pixel e un'altezza di 100 pixel (Figura 3 B). Salvare il rettangolo generato in formato tiff.
      Nota: Un cerchio (diametro: 200 pixel), una piazza (lunghezza laterale: 200 pixel) e un rettangolo (larghezza: 200 pixel; Altezza: 100 pixel) vengono salvate per le successive analisi.
   4. Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante del cubo e immettere 30 come la lunghezza laterale nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il cubo simulato. Infine, fare clic plugin | 3D | Visualizzatore di volume per visualizzare il cubo generato e salvarlo in formato tiff (Figura 3C).
   5. Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante Cuboid e immettere 80 come la lunghezza, 40 come larghezza e 30 come l'altezza nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il cuboid simulato. Infine, fare clic plugin | 3D | Visualizzatore di volume per visualizzare il cuboid generato e salvarlo in formato tiff (Figura 3C).
   6. Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante di sfera e immettere 30 come il diametro nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare la sfera simulata. Infine, fare clic plugin | 3D | Visualizzatore di volume per visualizzare la sfera generata e salvarlo in formato tiff (Figura 3C).
   7. Aprire il software ImageJ. Sotto i plugin di | BoMomics | Simulare oggetti menu, fare clic sul pulsante del cilindro e immettete 30 come il diametro e 100 come l'altezza nella finestra popup, quindi fare clic su OK per generare il cilindro simulato. Infine, fare clic plugin | 3D | Visualizzatore di volume per visualizzare il cilindro generato e salvarlo in formato tiff (Figura 3C).
      Nota: Una sfera (diametro: 30 pixel), un cubo (lunghezza laterale: 30 pixel), un parallelepipedo (lunghezza: 80 pixel; width: 40 pixel; Altezza: 30 pixel) e un cilindro (diametro: 30 pixel; Altezza: 100 pixel) vengono salvate per le successive analisi.

3. profilatura parametri di analisi

1. ImageJ software Open e aprire o importare un'immagine acquisita.
2. Far scorrere la barra di scorrimento inferiore per scegliere una fetta, quindi fare clic sull'immagine di | Regolare | Soglia pulsante. Nella finestra popup soglia, regolare i valori di soglia minima e massima di ispezione manuale per garantire che le ossa sono ben separate dallo sfondo e registrare il valore di soglia minima come il valore di soglia di osso corticale.
   Nota: Come diversi micro-CT produttori utilizzano diversi fattori di scala per la memorizzazione di coefficienti di attenuazione di raggi x nelle immagini, il valore di soglia effettiva dovrebbe essere determinato empiricamente mediante ispezione manuale o seguendo le specifiche del produttore consigli. Nella nostra pratica, impostando la soglia minima per i file ISQ prodotte da macchine micro-CT a 6.000-7.000 affidabile può separare le ossa dallo sfondo scansione.
3. Scegliere il plugin | BoMomics | Profilatura di Trab Param pulsante. Nella finestra popup, impostare Indice fetta alla posizione della fetta rappresentativa e impostare l'osso corticale ("osso Cort"), range ("Range") e valori di passaggio ("passaggio") per il calcolo di un insieme di soglie corticale per profilatura parametri di segmentazione, dove il valore di soglia di osso corticale viene acquisito dal passo 3.2 (Figura 1). Valori di gamma e passaggio di predefiniti di lavoro 2.000 e 400 per la maggior parte delle immagini di micro-CT. Impostare l' Indice fetta a 5 per il set di dati di esempio e mantenere i valori predefiniti per le altre impostazioni.
   Nota: "Cort osso" è la soglia per ossa corticali e il valore di soglia utilizzato per profilatura modifiche dei parametri dal valore di soglia più basso al più alto valore di soglia con l'incremento del valore di passo, dove il valore di soglia più basso è il valore di Cort Osso - gamma e il più alto valore di soglia è osseo Cort + gamma. Se i valori impostati per Cort osso, fascia e passo sono 6.000, 1.000 e 500, rispettivamente, allora il valore di soglia più basso per ossa corticali è 6.000-1, 000 = 5, 000, il più alto valore di soglia è di 6, 000 + 1, 000 = 7, 000 e le soglie utilizzate analisi sono 5.000, 5.500, 6.000, 6.500 e 7.000.
4. Impostare rumore diametro "(diametro di rumore del), passo ("passo") e gamma di valori ("gamma") per specificare un set di valori di rumorosità in analisi e il diametro del foro"(diametro del foro del), passaggio ("passaggio") e valori di intervallo ("gamma") per il calcolo di un insieme di valori di foro. In generale, l'impostazione predefinita funziona per la maggior parte dei campioni di ossa di micro-CT, dove rumore, passo e gamma sono 5, 5, 2, rispettivamente, e gamma, passo e diametro del foro sono 15, 5, 2, rispettivamente. Mantenere le impostazioni predefinite per i set di dati di esempio.
   Nota: "Dia. rumore" è il diametro del filtro di soppressione del rumore, e il "foro diametro." è il diametro dei fori all'interno delle ossa corticali. I valori di rumore e foro usati per la profilazione di parametro possono essere calcolati allo stesso modo come valori di soglia corticale descritti sopra, utilizzando lo specificato rumore/foro, gamma e valori di passaggio. A causa delle variazioni nei parametri di scansione quando l'acquisizione di immagini, parametri di rumore e foro dovrebbero essere determinati empiricamente secondo la qualità dell'immagine, come non intervalli generali dei parametri rumore e foro sono buoni per tutte le scansioni. Il valore più basso per la soglia, rumore o fori deve essere maggiore o uguale a 0, e se il valore calcolato più basso è negativo utilizzando i parametri forniti, il valore più basso specifico è impostato su 0.
5. Fare clic su OK per eseguire la profilatura di parametro. Visivamente verificare i risultati di segmentazione nella finestra Dei risultati di profilatura di parametro e selezionare un livello di sezione, in modo che il limite esterno dell'osso è descritto molto accuratamente (Figura 1B). Successivamente, è possibile recuperare i parametri di profilatura dalla voce nella tabella dei Risultati di profilatura del parametro corrispondente al livello scelto sezione (tabella 1).

4. trabecular analisi

1. Segmentazione delle ossa trabecolare
   1. Aprire il software ImageJ, quindi aprire o importare un'immagine acquisita.
   2. Scegliere il plugin | BoMomics | Trab segmentazione pulsante e inserire i parametri di analisi appropriato. Impostare la "Start", "Profilo di confine", "Trab. Ossa","Diametro di riduzione di rumore","Foro di riempimento ø"e"Diametro spessore corticale"5, 7.200, 7.000, 6, 12 e 25, rispettivamente.
      Nota: "Start" e "Fine" specifica l'intervallo di sezione selezionata per la segmentazione delle ossa trabecular, "Contorni contorno" è corrispondente al parametro "Cort osso" profilato, "Rumore riduzione diametro" a "Rumore dia." Parametro e "Diametro del foro di riempimento." al "Foro dia." parametro. "Spessore corticale diametro" è lo spessore specificato per escludere le ossa corticali esterne. "Trab. Ossa "sono la soglia per l'estrazione di trabecular ossa (Figura 2), dove le impostazioni vengono determinate mediante profilatura comando parametri di analisi, come descritto in passaggio 3.5.
   3. Fare clic su OK per eseguire la segmentazione trabecular. Controllare visivamente i risultati di segmentazione nella finestra Risultati di segmentazione di Trab (Figura 2B). Salvare le ossa trabecular estratte mostrate nella finestra di Ossa Trabecular segmentato in formato tiff (Figura 2B), che può essere ulteriormente analizzata da altri software.
2. Analisi delle ossa trabecular.
   1. Aprire il software ImageJ, quindi aprire o importare un'immagine acquisita.
   2. Scegliere il plugin | BoMomics | Analisi di Trab pulsante e riempire in parametri di analisi appropriato, ad esempio "Avvio", "Contorni contorno", "Trab. Bones","Diametro di riduzione del rumore", diametro del" foro di riempimento."e"Diametro spessore corticale"come descritto sopra (Figura 3A), dove sono determinate le impostazioni utilizzando il comando di parametri di analisi profilatura come descritto nel passo 3.5. Impostare la "Start", "Profilo di confine", "Trab. Ossa","Diametro di riduzione di rumore","Foro di riempimento ø"e"Diametro spessore corticale"5, 7.200, 7.000, 6, 12 e 25, rispettivamente.
      Nota: Nella versione gratuita del plugin, cinque fette adiacenti a partire dall'indice specificato di fetta di "Start" sono selezionati per la misura, mentre nella versione commerciale, un numero arbitrario di fette può essere specificato dall'utente.
   3. Selezionare una o più scelte nella sezione Risultati Reporting per i parametri da misurare, dove il volume trabecular dell'osso (BV), il volume totale (TV) della regione selezionata e spessori di misura è bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) sono disponibili per la selezione attraverso tre caselle di controllo, vale a dire BV TV"solo", "2D", "3D". Selezionare le caselle di controllo "2D" e "3D", quindi fare clic su "OK" per eseguire l'analisi trabecular (Figura 3A, tabella 2).
      Nota: Quando "BV TV solo" è selezionata, indipendentemente dagli Stati di selezione di "2D" e "3D", crudi misure di BV, TV e l'intensità sono segnalati, e le ossa trabecular segmentate sono estratte e visualizzate in una nuova finestra, che può essere salvata e ulteriormente analizzata da altri software. Quando "2D" è selezionata, vengono segnalati crudi misure di BV, TV, intensità e spessori misurati è bidimensionale ad ogni livello di fetta utilizzando il modello di piastra. Se è selezionata la "3D", spessore tridimensionale per ogni voxel viene calcolato direttamente senza alcuna assunzione di modello, quindi crudi misure di BV, TV, intensità e spessori tridimensionale campionate a ogni livello di sezione sono segnalati. Tuttavia, se nessuna casella di controllo è selezionata, trabecular ossa sono segmentate utilizzando il precedente set di parametri, ma nessuna misura è segnalata.

5. quantificare oggetti simulati

1. Aprire il software ImageJ, quindi aprire un immagine simulata. Qui, aprire la sfera simulata con un diametro di 30 pixel ad esempio.
2. Selezionare il plug-in | BoMomics | Analisi di Trab pulsante e inserire i parametri di analisi appropriato come descritto in precedenza. Mantenere i valori predefiniti per "Start", "Fine", "Profilo di confine", "Trab. Bones"e impostare"Diametro di riduzione di rumore","Diametro di riduzione di rumore", diametro del" foro di riempimento."e"Diametro spessore corticale"a 0 (Figura 3).
   Nota: Per oggetti simulati, non c'è nessun rumore di segnale non intenzionale, e non ci può essere nessuna conchiglie corticale corrispondente. Pertanto, i parametri per tali valori devono essere impostati in modo appropriato (impostazioni predefinite sono a zero). Per 3D quantificazioni, 30 fette prima e dopo la fetta di "Start" specificata vengono elaborati utilizzando la versione gratuita del plugin, mentre soli fette nell'intervallo specificato da fette di "Inizio" e "Fine" vengono analizzati dalla versione commerciale del plugin.
3. Nella sezione Risultati Reporting , selezionare "2D" e "3D" per i parametri da misurare e fare clic su OK per eseguire l'analisi trabecular per l'oggetto simulato (tabella 3).

6. calibrazione delle misure Trabecular e presentazione dei dati: profilo le distribuzioni di Trabecular misure della regione selezionati analizzando

1. Ottenere le informazioni di calibrazione del set di dati scansionati, secondo le istruzioni del fornitore di micro-CT.
   Nota: Solo crude misure di BV, TV, intensità e spessori sono segnalate dal plugin. Per ottenere misure comparabili ai report generati da altri software, calibrazione di risultato è desiderato.
2. Aprire Microsoft Excel e aprire la tabella di risultati riferiti. Calcolare calibrato volume osseo (BV), totale volume (TV), contenuto minerale osseo (BMC), frazione di volume osseo (BV/TV) e densità minerale ossea (BMD) in nuove colonne utilizzando i valori segnalati crudi BV, TV e intensità secondo le seguenti espressioni di excel.
3. Nota: Scansione ad alta risoluzione (risoluzione, µm), grigio ridimensionamento (scalatura), unità di densità (mg HA/cm³), pendenza di densità (pendenza) e intercetta densità (intercetta) possono essere estratti dai micro-CT immagine o meta file digitalizzati, ad esempio il file Scanco ISQ. Di conseguenza, le misure calibrate sono calcolate come segue:
   Supponiamo che BV, TV e l'intensità sono misure crudi, BV_c e TV_c sono valori calibrati, risoluzione, ridimensionamento, pendenza, intercetta sono da file di calibrazione di micro - CT immagini.
   BV_c = BV × risoluzione³ [μm³]
   TV_c = TV × risoluzione³ [μm³]
   BV / TV = BV ÷ TV
   BMC = (intensità ÷ ridimensionamento × pendenza - intercetta × BV) risoluzione ׳ × 10^-12 [mg HA]
   BMD - BMC ÷ TV_c × 10¹² [mg ettari / cm³]
4. Creare un diagramma di dispersione (XY) per misure calibrate (Y) contro fetta strati (X) utilizzando Microsoft Excel software (Figura 4).

Risultati

Il plugin di analisi trabecular è progettato per segmentare e quantificare le ossa trabecular con precisione automaticamente. Inizialmente, osso contorno esterno viene rilevato e delineato seguita da un'operazione di riempimento foro dove qualsiasi fori all'interno delle conchiglie corticale esterna dell'osso sono riempiti. Quindi viene eseguita un'operazione di erosione per escludere le ossa corticali esterne e ricevere le ossa trabecular segmentate. Infine, misure delle ossa trabecular...

Discussione

Questo studio descrive un plugin di ImageJ per analizzare le ossa trabecular, che è automatico, efficiente, e facile da usare. Il plugin è utilizzabile anche per quantificare qualsiasi oggetto 2D o 3D per strato dopo strato misure di aree, volumi e spessori. Attualmente, solo un singolo valore misurato per ogni parametro trabecular è segnalato per ciascun campione di analisi micro-CT standard, che non può rappresentare appieno le caratteristiche dell'entità misurata nella regione analisi selezionata. Il plugin descr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ	NIH	imagej	Any version with a java 1.8 run time
trabecular analysis plugin	Bomomics	bomomics	free or commercial version
Micro CT scanner	Scanco	μ-50	micro CT from any vendor
Computer System	Lenovo		any brand
Windows Operating System	Microsoft	Windows 7 x64	any 64-bit Windows operating system
Office Software	Microsoft	Office 2010	any speadsheet software that has xy chart function