Video-EEG-ECG simultánea de monitoreo para identificar la disfunción neurocardiaco en modelos de ratón de la epilepsia

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para registrar el cerebro y corazón bio señales en ratones usando video simultáneo, electroencefalografía (EEG) y electrocardiografía (ECG). También se describen métodos para analizar las grabaciones de EEG ECG resultantes para convulsiones, energía espectral del EEG, la función cardiaca y variabilidad del ritmo cardíaco.

Resumen

En la epilepsia, las convulsiones pueden evocar alteraciones del ritmo cardíaco tales como cambios de la frecuencia cardíaca, bloqueos de la conducción, Asistolias y arritmias, que pueden potencialmente aumentar el riesgo de muerte súbita inesperada en epilepsia (SUDEP). Electroencefalografía (EEG) y la electrocardiografía (ECG) son herramientas de diagnóstico clínicas ampliamente utilizados para monitorizar anormal del cerebro y ritmos cardiacos en los pacientes. Aquí, se describe una técnica para grabar simultáneamente video, EEG y ECG en ratones para medir comportamiento, el cerebro y las actividades cardiacas, respectivamente. La técnica descrita en este documento utiliza un tethered (es decir, atado con alambre) configuración de grabación en la que el electrodo implantado en la cabeza del ratón es hard-wired en el equipo de grabación. En comparación con telemetría inalámbrica, sistemas de grabación, el arreglo tethered posee varias ventajas técnicas tales como un mayor número posible de canales para el registro de EEG u otros biopotentials; costos de electrodo; y mayor frecuencia ancho de banda (es decir, frecuencia de muestreo) de grabaciones. Los fundamentos de esta técnica pueden modificarse fácilmente para dar cabida a grabar otras Bioseñales, tales como la electromiografía (EMG) o pletismografía para evaluación de muscular y actividad respiratoria, respectivamente. Además de describir cómo realizar las grabaciones de EEG ECG, también se detallan métodos para cuantificar los datos resultantes de las convulsiones EEG potencia espectral, función cardiaca y variabilidad del ritmo cardíaco, que demostró en un experimento de ejemplo utiliza un ratón con epilepsia debido a la canceladura del gene Kcna1 . Video-EEG-ECG monitorización en modelos de ratón de epilepsia u otra enfermedad neurológica proporciona una poderosa herramienta para identificar la disfunción a nivel del cerebro, corazón o interacciones cerebro-corazón.

Introducción

Electroencefalografía (EEG) y la electrocardiografía (ECG) son técnicas de gran alcance y ampliamente utilizados para la evaluación en vivo de cerebro y función cardiaca, respectivamente. EEG es el registro de la actividad eléctrica cerebral colocando electrodos en el cuero cabelludo¹. La señal grabada con el EEG no invasivo representa fluctuaciones de tensión derivados sumaron inhibitorios y excitatorios potenciales postsinápticos generados principalmente por las neuronas piramidales corticales^1,2. EEG es la prueba más común de neurodiagnostic para evaluar y manejar a pacientes con epilepsia^3,4. Es especialmente útil cuando las crisis epilépticas se presentan sin manifestaciones de comportamiento convulsivas evidente, como las crisis de ausencia o estatus no convulsivo epiléptico^5,6. Por el contrario, epilepsia no relacionada con las condiciones que conducen a episodios convulsivos o pérdida de la conciencia se pueden diagnosticar como crisis epilépticas sin monitorización vídeo-EEG⁷. Además de su utilidad en el campo de la epilepsia, EEG es también ampliamente utilizado para detectar actividad anormal del cerebro asociada con trastornos del sueño, encefalopatías y trastornos de la memoria, así como para complementar la anestesia general durante cirugía^{2 , 8 , 9}.

En contraste con EEG, ECG (o EKG ya que a veces es abreviado) es el registro de la actividad eléctrica del corazón¹⁰. ECG se realiza colocando electrodos en las extremidades extremidades y pared torácica, que permite la detección de los cambios de voltaje generados por el miocardio durante cada ciclo cardiaco de contracción y relajación^10,11. Los componentes primarios de la forma de onda del ECG de un ciclo cardiaco normal incluyen la onda P, complejo QRS y la onda T, que corresponden a la despolarización auricular, ventricular despolarización y repolarización ventricular, respectivamente^{10, 11}. supervisión de ECG se utiliza rutinariamente para identificar arritmias cardiacas y defectos de la conducción cardiaca sistema¹². Entre los pacientes con epilepsia, se amplifica la importancia de la utilización de ECG para identificar arritmias potencialmente peligrosas para la vida puesto que están en riesgo significativamente mayor de paro cardíaco repentino, así como muerte súbita inesperada en epilepsia^{13, 14,15}.

Además de sus aplicaciones clínicas, grabaciones de EEG y de ECG se han convertido en una herramienta indispensable para la identificación de la disfunción cerebral y corazón en modelos de ratón de la enfermedad. Aunque tradicionalmente estas grabaciones se han realizado por separado, aquí describimos una técnica para grabar video, EEG y ECG simultáneamente en ratones. El método simultáneo de vídeo-EEG-ECG detallado aquí utiliza una configuración de grabación anclado en la cual el electrodo implantado en la cabeza del ratón es hard-wired en el equipo de grabación. Históricamente, esta atado, o cableado, configuración ha sido la norma y más utilizado método para las grabaciones de EEG en ratones; sin embargo, sistemas inalámbricos de telemetría EEG también se han desarrollado recientemente y están ganando en popularidad¹⁶.

En comparación con sistemas inalámbricos de EEG, el arreglo tethered posee varias ventajas técnicas que hagan preferible según la aplicación deseada. Estas ventajas incluyen un mayor número de canales para el registro de EEG u otros biopotentials; costos de electrodo; disponibilidad de electrodo; menos susceptibilidad a la señal de la pérdida; y mayor ancho de banda de frecuencia (es decir., frecuencia de muestreo) de grabaciones¹⁷. Esto se hace correctamente, el método de grabación anclado aquí descrito es capaz de proporcionar alta calidad, libre de artefactos EEG y ECG datos simultáneamente, junto con el video correspondiente para el monitoreo conductual. Estos datos de EEG y de ECG entonces pueden ser minados para identificar neuronal, cardiaca, o neurocardiaco anormalidades tales como convulsiones, cambios en el EEG de potencia espectro, bloqueos de la conducción cardiaca (es decir., saltarse latidos del corazón) y los cambios en variabilidad del ritmo cardíaco. Para demostrar la aplicación de estos métodos cuantitativos del EEG ECG, presentamos un experimento de ejemplo usando un nocaut Kcna1 (- / -) ratón. Kcna1 ratones ^{- / -} falta voltaje Kv1.1 α-subunidades y como consecuencia presentan convulsiones espontáneas, disfunción cardiaca y muerte prematura, haciendo que un modelo ideal para la evaluación de EEG ECG simultánea de deletéreos asociados a epilepsia disfunción neurocardiaco.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales deben realizarse con arreglo a las pautas de los institutos nacionales de salud (NIH), aprobado por su institución institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC). Los principales instrumentos quirúrgicos necesarios para este protocolo se muestran en la figura 1.

1. preparación de electrodos para la implantación

1. Coloque el nanoconnector femenino 10-zócalo (es decir, el electrodo; Figura 2A) en un tornillo de mesa con los 10 alambres hacia arriba y el cable negro en la parte delantera. Con unas pinzas finas, doble hacia abajo el primer cable (negro) a la derecha y el segundo cable (tan) a la izquierda. Luego doble hacia abajo el rojo, naranja, azul y morado los cables alternando derecha e izquierda (figura 2B). Corte los cables amarillos, verdes, blanco y gris en la base de su adhesión.
2. Para preparar los cables de ECG, utilice un marcador permanente para hacer marcas en el cable morado en ~3.2 y ~3.5 cm desde la base del electrodo y el cable azul en ~2.2 y ~2.5 cm (figura 2). Quitar el electrodo de la prensa y exponer los filamentos de plata entre las áreas marcadas por pelar el aislamiento en un lado del alambre con una hoja de bisturí (Figura 2D).
   Nota: Raspado de los cables debe realizarse bajo el microscopio. Debe tener precaución para asegurar que los filamentos de plata no estén dañados, el aislamiento se raspa lejos.
3. Vuelva a colocar el electrodo en la prensa. Pegue un pedazo de cinta de montaje doble cara, precortado a lo largo y ancho del electrodo, a la parte superior de los cables con una capa fina de pegamento.
   Nota: Antes de adherir la cinta, ser seguro que los cables están acostado, que se pega directamente a los lados y no torcidos sobre uno otro.
4. Corte los cables a utilizar para EEG en un ángulo ligeramente en forma de V con una longitud de aproximadamente 7-9 mm, con los cables tan y negro cortados el más corto. No corte los cables para ECG (Figura 2E).
5. Envasar y esterilizar el electrodo para su uso posterior.

2. preparar el ratón para la cirugía

1. Peso del ratón. Inyectar una dosis de 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea (s.c.). Anestesiar los animales con una inyección intraperitoneal (i.p.) de ratón anestésico cóctel con acepromazina (1 mg/kg), ketamina (80 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
2. Una vez que el ratón se convierte en anestesiados, aplica una línea delgada de ungüento oftálmico veterinario a cada ojo. Utilizando un condensador de ajuste eléctrico, afeitado dos áreas pequeñas (~ 2 cm²) en ambos lados del tronco del ratón, correspondiente a donde los cables de ECG será había implantado (Figura 3A).
   Nota: El área depilado del lado derecho debe colocarse en una posición aproximadamente dorsolateral justo detrás de la derecha "axila" del animal. En el lado izquierdo, la zona depilada debe estar ubicada en una orientación más ventrolateral por el costado del animal, pero cerca de 1 centímetro más posterior que el área depilado del lado derecho (Figura 3A).
3. Eliminar el vello recortado y limpie ambas áreas afeitadas con una solución de clorhexidina.

3. colocar el electrodo en el cráneo

1. Coloque el ratón en la posición prona en el escenario del microscopio de disección y la adecuada profundidad de la anestesia para confirmar la ausencia del reflejo del pellizco del dedo del pie.
   Nota: Pasos 3.2 a 5.6 se deben hacer con la ayuda de un microscopio.
2. Mantiene la cabeza firme entre el pulgar y el índice, parte de la piel hacia abajo en el centro de la cabeza entre las orejas apenas detrás de los ojos con un algodón empapado en alcohol (figura 3B).
   Nota: Aunque esta cirugía debe hacerse con técnica aséptica, no es un procedimiento estéril desde el cuero cabelludo no se afeitó y el ratón debe ser manipulado durante la cirugía.
3. Usando un bisturí, haga una incisión del midline de ~ 1 cm a través del cuero cabelludo entre el pelaje parted de justo delante de las orejas justo entre los ojos (figura 3, D).
   1. Utilizando el lado de la cuchilla o un aplicador con punta de algodón, raspar suavemente la membrana mucosa en la parte superior del cráneo hasta el hueso aparece seco.
   2. Arrancar la piel alrededor del perímetro de la incisión formando una frontera fina de piel calva. Retire con cuidado cualquier piel que pueda haber caído en el campo quirúrgico con un par de pinzas. Seque la superficie del cráneo con un aplicador con punta de algodón estéril, aplicando una presión suave durante unos segundos si es necesario.
4. Hacer cuatro marcas en el cráneo con un marcador permanente esterilizado en los sitios donde los agujeros de las rebabas serán perforados (figura 3E). Lugar dos marcas, una a cada lado de la sutura sagital anterior bregma, anterior aproximadamente 4 mm y 5 mm lateral a bregma (por encima de la corteza frontal), para los cables de referencia y tierra. Coloque otra marcas dos, uno a cada lado de la sutura sagital posterior a bregma, aproximadamente 2 mm posterior y lateral de 7 mm a bregma (sobretodo corteza parietotemporal), para los dos cables de grabación de EEG.
   Nota: Esta no es una cirugía estereotáctica y las distancias dadas son aproximaciones que variarán dependiendo del tamaño del ratón. Asegúrese de que los orificios se colocan lo suficientemente lateralmente para adaptarse fácilmente a la base del implante de electrodo que se colocará en la línea media a lo largo de la sutura sagital (figura 3F).
5. Usando un taladro micro estéril, hacer los agujeros de las rebabas pequeñas en cada marca con una broca de 0.8 mm de diámetro.
   1. Aplique presión suave mientras perforación para crear hendiduras pequeñas en cada marcado spot. Perforar el cráneo por pulsación la broca como el agujero se acerca a la terminación, asegurándose de no aplicar demasiada presión, que podría conducir a penetrar y dañar el tejido cerebral subyacente.
   2. Después se perforan todos los agujeros, limpie el área con un aplicador con punta de algodón.
6. Para adherir el electrodo en la parte superior del cráneo, retire el papel protector de la cinta de montaje doble cara sobre el electrodo. Aplique una capa delgada de pegamento en la cinta. Usando un par de pinzas, quitar el electrodo de la mordaza. Oriente tal que, cuando se coloca a lo largo de la sutura sagital, los cables más cortos de EEG son rostrales y los cables de ECG más caudales.
   1. Adherir los electrodos en el cráneo sobre la sutura sagital entre los orificios (figura 3F).
      Nota: El cráneo debe estar totalmente seco el pegamento sobre el electrodo se adhiera. Asegúrese de no obstruir los agujeros de las rebabas en el cráneo con el electrodo o el pegamento.
   2. Brevemente, sostenga el electrodo para garantizar la adherencia en el cráneo y luego deje que el pegamento se seque durante 5-10 minutos.

4. implantación de los cables para ECG

1. Gire el ratón ligeramente sobre su lado derecho manteniendo la cabeza erguida. Tome el cable de ECG largo en el lado izquierdo y extenderlo por la parte del ratón a la zona de afeitado en el lado izquierdo. Visualizar donde se colocará el alambre expuesto una vez es tunelizado bajo la piel.
   Nota: Para la referencia, una marca pequeña puede hacerse sobre la piel con un marcador permanente.
2. Con un bisturí, haga una incisión de ~ 1 cm en la piel en el lugar donde se colocará el alambre expuesto. Sosteniendo la incisión abierta con pinza Adson, utilice pinzas Dumont para aflojar la piel alrededor de la incisión del tejido conectivo subyacente para formar un bolsillo para el cable. Comenzando en el sitio de la incisión en el costado del animal, túnel subcutáneo con un trozo de tubería de polietileno estéril (que ha sido preparado por corte a ~ 6 cm de largo con el borde biselado) hasta que el borde biselado salga por la incisión hecha en la cabeza (< C0 > Figura 4A, B).
3. Alimente el cable de ECG a través del tubo con unas pinzas Dumont (figura 4). Mientras se retira el tubo, sujete el hilo con pinza Adson cuando sale de la incisión lateral. Tire del cable tenso (figura 4).
4. Fijar el cable de ECG de sutura en el tejido debajo de la piel con Nylon 6-0 (figura 4E). Uso de fórceps y sostenedores de la aguja de Olsen-Hegar, aplicar una sutura sobre los filamentos expuestos y otra sutura antes o después de la parte expuesta.
5. Corte el cable del electrodo alrededor de 2-3 mm más allá de la última sutura y meta final en el bolsillo de piel formado previamente. Junte los dos lados de la incisión y cierre con un clip de la herida aplicado con Portaagujas de Crile-Wood (figura 4F).
6. Gire el ratón de manera que la nariz está apuntando en la dirección opuesta. Con la cabeza en la posición propensa, gire el ratón ligeramente sobre su lado izquierdo.
7. Repita los pasos anteriores para colocar el cable de ECG contralateral.
   Nota: Para aproximar un plomo configuración de grabación de ECG II, el ECG derecho alambre debe colocarse un poco más dorsal y anterior que el izquierdo cable de ECG, que debería ser un poco más ventral y posterior.

5. implantación de los hilos para EEG

1. Implante de los hilos para EEG, coloque el ratón en la posición prona y la incisión de cuero cabelludo con el pulgar y el índice de la mano no dominante.
2. Con pinzas, quite cualquier pelaje que puede han sido tirado debajo de la piel por la tubería. Si es necesario, secar otra vez el cráneo con un aplicador con punta de algodón. Cuidadosamente con unas pinzas Dumont, sacar y quitar cualquier ruina o coágulos de sangre que haya depositado en los agujeros de las rebabas.
3. A partir del más anterior agujero por un lado, doble el cable que está más cercano de ese agujero que es colocado directamente sobre el agujero, pero aún no se ha insertado. Sujete el extremo inferior del alambre y alimentar tan horizontal como sea posible en el agujero hasta ~ 2-3 mm del alambre está bajo el cráneo (figura 5A).
   Nota: Los cables ha de estar horizontalmente entre el cráneo y la superficie del cerebro. Los cables no deben atravesar el cerebro.
4. Con el fin del seguro de alambre en el agujero, doble suavemente hacia abajo la porción restante del alambre para que quede plana contra el cráneo.
5. Continuar de la misma forma con el alambre posterior del mismo lado. Repita para los cables anteriores y posteriores en el otro lado (figura 5B).
   Nota: La configuración de cable se resume en la figura 5.

6. cerrar la incisión de la cabeza con cemento Dental

1. Mezclar dos cucharadas de polvo de policarboxilato con ~ 5 gotas de líquido de policarboxilato. Revolver la mezcla con un palillo para hacer una pasta con la viscosidad deseada.
   Nota: Los pasos posteriores 6.2 a 6.4 deben realizarse rápidamente ya que el cemento dental se seca dentro de 1 minuto después de la mezcla.
2. Recoger una gota de pasta de cemento con el palillo grande y aplíquelo a la base del electrodo comenzando caudalmente (figura 6A). Continúe alrededor del electrodo, permitiendo que el cemento gotee sobre los alambres formando un tapón alrededor del implante (Figura 6B).
3. Con unas pinzas Dumont, tire la piel en los bordes de la incisión hacia arriba sobre la tapa de cemento y pulse a la vez, teniendo cuidado de no perturbar los cables implantados debajo. Presione la piel para arriba en el cemento para ayudar con el cierre.
4. Sellar la incisión entre los ojos por la vinculación de la piel con el cemento dental (figura 6).

7. ayudar a la recuperación post quirúrgica

1. Coloque el ratón en una jaula vacía en una almohadilla de calor circulación. Controlar el ratón hasta que recupera la conciencia y puede mantener recumbency esternal.
2. Y, el ratón en una jaula con pellets de alimento y gel hidratante la casa situada en el piso de la jaula. Tapa la jaula con una tapa micro-aislador.
3. En la cirugía después de 24 h, inyectar (s.c.) el ratón con 5 mg/kg de carprofeno.
4. Permiten ≥ 48 h de recuperación post quirúrgica antes de grabar.

8. grabación ECG EEG señales procedentes de un ratón atado

1. Tras la recuperación, transferir el ratón implantado a una cámara de grabación con paredes transparentes para facilitar el monitorado. Para correa (es decir, "enchufe") el ratón (Figura 7A), suavemente pero firmemente sostenga el ratón en una mano mientras con la otra mano para insertar el conector de 10 pines (macho) nanoconnector con poste guía en las tomas del implante del electrodo del ECG EEG (hembra) en cabeza de ratón.
2. Asegure el cableado por encima de la cámara con una varilla de soporte, asegúrese que haya suficiente holgura en el cable para permitir que el ratón se mueva libremente pero no tanto que el cableado arrastra el suelo de la cámara.
3. Conecte el cableado desde el nanoconnector de 10 pines a una unidad de interfaz de adquisición de señal de ordenador conectado con sincronizado video grabando como se muestra en la figura 7B.
4. Establecer las tasas de muestreo de la grabación ser ≥ 2 KHz para ECG y ≥ 500 Hz para EEG (es decir, al menos dos veces la frecuencia que uno está interesada en el estudio).
5. Para una visualización óptima de los rastros de la señal, se aplican los siguientes filtros como hecho anteriormente¹⁸: un filtro de muesca de 60 Hz para todos los datos, un filtro de paso alto banda 75-bajo - y 0.3-Hz Hz para EEG y un filtro de paso alto de 3-Hz para ECG.
6. Grabar simultáneamente video y EEG-ECG (figura 7) y guardar los datos digitalizados para el análisis fuera de línea con software de procesamiento de señal.
7. Una vez las grabaciones, cuidadosamente desenganche el ratón y volver a su jaula casera.

9. analizar las grabaciones de EEG

1. Realizar análisis de cuantificación de asimiento.
   1. Inspeccione visualmente toda la grabación de EEG para identificar manualmente los episodios de convulsiones, definidos en este modelo como (por lo menos dos veces la línea de base), de gran amplitud rítmicas descargas electrográficas, duración mayor de 5 s (figura 8A). Examinar el video que corresponde a los asimientos electrográficos identificar comportamientos asociados a convulsiones.
   2. Para calcular la frecuencia de las crisis (convulsiones por hora), divida el número de convulsiones por el número total de horas de grabación.
   3. Para calcular la duración de la convulsión, medir el tiempo transcurrido desde el inicio del asimiento electrográfica hasta el cese de spiking (figura 8A).
   4. Para calcular carga de asimiento, definido como el tiempo de agarrar por hora, la duración de la convulsión de la suma y divide por las horas de grabación total.
2. Realizar el análisis de la potencia espectral de pre- y post-ictal EEG.
   1. Seleccione un 30min (o cualquier otra duración deseada) segmento de datos peri-ictal de EEG de centrar el episodio de convulsión para ser examinado. Exportar los datos en bruto (con la configuración del filtro quitado) como un archivo de datos ASCII o algunos otros archivos tipo compatible con el software de espectro de energía.
   2. Convertir el archivo ASCII a un archivo de texto mediante una aplicación de editor de texto simple.
   3. Abra el archivo de texto resultante del segmento de EEG en software de espectro de energía y especifique las siguientes opciones: "ignorar las líneas no numéricos"; "coma como delimitador de datos"; y frecuencia de muestreo de 1000 Hz por defecto.
   4. Una vez que la señal de EEG aparece en el software del espectro de energía en su respectivo canal, haga clic en el menú Canal y seleccione "filtro digital." Aplicar filtros pasabanda digital correspondientes a la gama de frecuencia deseada para ser analizados.
   5. Abra "espectro" desde el panel de menú, seleccionar el canal apropiado de la pantalla de EEG a analizar y haga clic en "configuración". En "configuración", especifique los siguientes parámetros para el espectrograma y haga clic en "Close" para generar el espectrograma (figura 8): tamaño de FFT: 8192, ventana de datos: Welch, superposición de la ventana: 93.75%, modo de visualización: densidad de energía, colores de espectrograma: arco iris, Jajaja de colores: 64, PSD promedio: 1, componente de frecuencia cero de quitar: marcada como "on".
   6. Ajustar la escala colorimétrica para una visualización óptima del espectrograma.
   7. Abra el "Gestor de análisis" desde el panel de menú. Haga clic en "+ nuevo análisis" para crear dos análisis (análisis 1 y 2 de análisis), que se corresponden a los segmentos pre- y post-ictal de EEG para analizar. Especificar los segmentos deseados de pre- y post-ictal en el espectrograma y asociarlas con análisis 1 y 2 de análisis, respectivamente.
      Nota: Se deben considerar sólo los datos de EEG sin ruido y artefactos y períodos de las grabaciones de EEG con artefactos significativos deben eliminarse del análisis.
   8. Una vez creados los segmentos de análisis, abrir «Vista de datos Pad» desde el panel de menú. Haga clic en el canal EEG para abrir el menú de "Configuración de columna de datos Pad" para ese canal.
   9. En "Configuración de columna datos Pad," seleccione la opción de "Espectro" y "Poder Total porcentaje".
   10. En "Datos Pad columna configuración", haga clic en "opciones" y especifique el rango de frecuencias a ser examinado. Haga clic en "OK" en "Opciones de almohadilla para datos de espectro" y en "Datos Pad columna configuración", y el poder de porcentaje (%) de la banda de frecuencia especificada aparecerán en la vista Pad de datos para el segmento de análisis seleccionado (es decir, análisis de 1 o 2 análisis) tal como se especifica en el " Analysis Manager. "
       Nota: El % de potencia, o poder relativo, de cada banda se expresa como el porcentaje de la potencia espectral total dentro de la gama de frecuencia especificada.
   11. Repita el paso anterior para cada banda de frecuencia a analizar.
       Nota: Con frecuencia utilizan gamas para las cinco principales bandas de frecuencia de EEG incluyen¹⁸: banda δ = 0.5-3 Hz, - banda = 3.5-7 Hz, α-banda = 8-12 Hz, banda β = 13-20 Hz y γ-banda = 21-50 Hz.

10. analizar grabaciones de ECG

1. Cuantificar los latidos del corazón se saltan.
   1. Inspeccione visualmente toda la grabación de ECG para identificar manualmente los latidos de corazón saltado, definidos como una prolongación del intervalo RR equivale a intervalo ≥ 1,5 veces la anterior R-R, que a menudo se asocia con un indicativo de onda P no realizado de auriculoventricular bloqueo de la conducción (Figura 9A).
   2. Para calcular la frecuencia de latidos de corazón saltado por hora, divida el número total de latidos omitidos durante la sesión de grabación por la duración total de horas de grabación.
2. Realizar el análisis de ritmo cardíaco (HRV) la variabilidad.
   1. En el software de adquisición de datos, cambie la configuración de registro a 1 época para el canal de ECG. Generar segmentos de analizador para las grabaciones de ECG: segmento de un ECG de 5 minutos cada 3 horas durante el período de la fase de luz de 12 horas, para un total de 4 segmentos.
      Nota: Las grabaciones de ECG seleccionadas para análisis deben ser en tiempos cuando el animal está parado y los datos están libres de artefactos de movimiento.
   2. Generar una hoja de cálculo de los valores de intervalo R-R del ECG analizado las segmentos haciendo clic en "guardar datos derivados analizados." Revisar la hoja de cálculo de datos faltantes o incorrectos y eliminar todos los demás valores numéricos excepto datos por intervalos R-R. Guardar esta hoja de cálculo modificada como un archivo de texto seleccionar la opción para "delimitado."
   3. Abra el archivo de texto como un archivo ASCII personalizado en el programa HRV, especifique el siguiente opciones: número de líneas de encabezado: 0, separador de columna: ficha espacio, tipo de datos: RR, columna de datos: 1, unidades de datos: ms y la columna de índice de tiempo: ninguno.
   4. En la sección de preferencias del menú, configure las opciones que se detallan a continuación.
      1. Establecer las opciones de análisis como se ha mencionado. Intervalo R-R robustos, método robustos: smoothn priores, parámetro de suavizado: 500, HRV frecuencia bandas¹⁹, muy baja frecuencia: 0-0.15 Hz, frecuencia baja: 0,15 a 1,5 Hz y alta frecuencia: 1.5-5 Hz
      2. Establecer opciones avanzadas como se ha mencionado. Opciones de estimación del espectro, interpolación de RR de la serie: 20Hz, puntos en el dominio de la frecuencia: 500 puntos/Hz, espectro FFT Welchs periodograma métodos, anchura de la ventana: 32s y superposición de la ventana: 50%
   5. Ejecutar el análisis de la HRV para generar valores de análisis de dominio de tiempo significa RR, RR STD (es decir, el SDNN), valores de análisis de dominio RMSSD y frecuencia de energía HF, LF potencia y la relación de la energía de LF/HF. Si lo desea, guardar los resultados como un archivo PDF.

Resultados

Para demostrar cómo analizar los datos de las grabaciones de EEG ECG para identificar anormalidades neurocardiaco, se muestran los resultados para una grabación de EEG ECG de 24 h de un Kcna1^–/– ratón (2 meses). Estos animales mutantes, que se dirigen a la falta de voltaje-bloqueado Kv1.1 α-subunidades codificadas por el gen Kcna1 , son un modelo genético frecuente de epilepsia, puesto que exhiben inicio de convulsión tónico-cl...

Discusión

Para obtener grabaciones de EEG ECG de alta calidad que están libres de artefactos, deben ser tomado todas las precauciones para evitar la degradación o aflojamiento de los cables y electrodos implantados. Como un implante cabeza de EEG se hace flojo, los contactos de cable con el cerebro degradan conduce a amplitudes de señal disminuida. Implantes sueltos o contactos de alambre pobre también pueden causar distorsión de las señales eléctricas, introduciendo los artefactos de movimiento y ruido de fondo a las graba...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
VistaVision stereozoom dissecting microscope	VWR
Dolan-Jenner MI-150 microscopy illuminator, with ring light	VWR	MI-150RL
CS Series scale	Ohaus	CS200	for weighing animal
T/Pump professional	Stryker		recirculating water heat pad system
Ideal Micro Drill	Roboz Surgical Instruments	RS-6300
Ideal Micro Drill Burr Set	Cell Point Scientific	60-1000	only need the 0.8-mm size
electric trimmer	Wahl	9962	mini clipper
tabletop vise	Eclipse Tools	PD-372	PD-372 Mini-tabletop suction vise
fine scissors	Fine Science Tools	14058-11	ToughCut, Straight, Sharp/Sharp, 11.5 cm
Crile-Wood needle holder	Fine Science Tools	12003-15	Straight, Serrated, 15 cm, with lock - For applying wound clips
Dumont #7 forceps	Fine Science Tools	11297-00	Standard Tips, Curved, Dumostar, 11.5 cm
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Serrated, Straight, 12 cm
Olsen-Hegar needle holder with suture cutter	Fine Science Tools	12002-12	Straight, Serrated, 12 cm, with lock
scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
surgical blades #15	Havel's	FHS15
6-0 surgical suture	Unify	S-N618R13	non-absorbable, monofilament, black
gauze sponges	Coviden	2346	12 ply, 7.6 cm x 7.6 cm
cotton-tipped swabs	Constix	SC-9	15.2-cm total length
super glue	Loctite	LOC1364076	gel control
Michel wound clips, 7.5mm	Kent Scientific	INS700750
polycarboxylate dental cement kit	Prime-dent	010-036	Type 1 fine grain
tuberculin syringe	BD	309623
polyethylene tubing	Intramedic	427431	PE160, 1.143 mm (ID) x 1.575 mm (OD)
chlorhexidine	Sigma-Aldrich	C9394
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products		opthalamic eye ointment
mouse anesthetic cocktail			Ketamine (80 mg/kg), Xylazine (10 mg/kg), and Acepromazine (1 mg/kg)
carprofen			Rimadyl (trade name)
HydroGel	ClearH20	70-01-5022	hydrating gel; 56-g cups
Ponemah  software	Data Sciences International		data acquisition and analysis software; version 5.2 or greater with Electrocardiogram Module
7700 Digital Signal conditioner	Data Sciences International
12 Channel Isolated Bio-potential Pod	Data Sciences International
fish tank	Topfin		for use as recording chamber; 20.8 gallon aquarium; 40.8 cm (L) X 21.3 cm (W) X 25.5 cm (H)
Digital Communication Module (DCOM)	Data Sciences International	13-7715-70
12 Channel Isolated Bio-potential Pod	Data Sciences International	12-7770-BIO12
serial link cable	Data Sciences International	J03557-20	connects DCOM to bio-potential pod
Acquisition Interface (ACQ-7700USB)	Data Sciences International	PNM-P3P-7002
network video camera	Axis Communications		P1343, day/night capability
8-Port Gigabit Smart Switch	Cisco	SG200-08	8-port gigabit ethernet swith with 4 power over ethernet supported ports (Cisco Small Business 200 Series)
10-pin male nanoconnector with guide post hole	Omnetics	NPS-10-WD-30.0-C-G	electrode for implantation on the mouse head
10-socket female nanoconnector with guide post	Omnetics	NSS-10-WD-2.0-C-G	connector for electrode implant
1.5-mm female touchproof connector cables	PlasticsOne	441	1 signal, gold-plated; for connecting the wiring from the head-mount implant to the bio-potential pod
soldering iron	Weller	WESD51 BUNDLE	digital soldering station
solder	Bernzomatic	327797	lead free, silver bearing, acid flux core solder
heat shrink tubing	URBEST		collection of tubing with 1.5- to 10-mm internal diameters
heat gun	Dewalt	D26960
mounting tape (double-sided)	3M Scotch	MMM114	114/DC Heavy Duty Mounting Tape, 2.54 cm x 1.27 m
desktop computer	Dell		recommended minimum requirements: 3rd Gen Intel Core i7-3770 processor with HD4000 graphics; 4 GB RAM, 1 GB AMD Radeon HD 7570 video card; 1 TB hard drive; Windows 7 OS
permanent marker	Sharpie	37001	black color, ultra fine point
toothpicks			for mixing and applying the polycarboxylate dental cement
LabChart Pro software	ADInstruments		power spectrum software; version 8.1.3 or greater
Kubios HRV software	Univ. of Eastern Finland		HRV analysis software; version 2.2
Notepad	Microsoft		simple text editor software