Evaluación de la coagulación con Plasma en tejido del hígado en un modelo Animal grande en Vivo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para evaluar experimentalmente la coagulación con plasma en el tejido hepático en vivo. En un modelo porcino, microcirculación es examinada por láser Doppler, profundidad de coagulación se mide histológicamente, temperatura en el sitio de coagulación por termómetro infrarrojo, cámara termográfica y conducto efecto del lacre está documentada por la presión de explosión experimentos.

Resumen

Coagulación del plasma como una forma de electrocauterización se utiliza en Cirugía hepática durante décadas para sellar la superficie de corte de hígado grande después de hepatectomy importante para prevenir las hemorragias en una etapa posterior. Mal sólo se examinan los efectos exactos de la coagulación con plasma en tejido del hígado. En el modelo porcino, los efectos de la coagulación pueden ser examinados cerca de la aplicación clínica. Una combinado Láser Doppler flowmeter y espectrofotómetro documentos la microcirculación cambia durante la coagulación en 8 mm de profundidad de tejido no invasor, proporcionando información cuantificable sobre hemostasia más allá de la impresión clínica subjetiva. La temperatura en el sitio de la coagulación se evalúa con una coagulación previa y post de termómetro infrarrojo y una cámara termográfica durante la coagulación, una medición de la temperatura del gas de la viga no es posible debido al umbral superior de los dispositivos. La profundidad de la coagulación se mide microscópicamente con hematoxilina/eosina, tinción de secciones después de la calibración con un micrómetro de objeto y le da una información exacta sobre la coagulación ajuste profundidad-relación de poder. El efecto del lacre se examina en los conductos biliares ya que no es posible para un coagulador de plasma sellar vasos sanguíneos más grandes. Realizan experimentos de presión de explosión hacia fuera en órganos explanted para descartar hipertensión relacionadas con efectos.

Introducción

Coagulación con argón plasma (APC) es un instrumento ampliamente utilizado en cirugía abdominal por más de tres décadas^1,2. Es una técnica estándar para el logro de la hemostasia secundaria después comandante hepatectomy sellando el hígado de superficie para evitar hemorragias posteriores³. Coagulación del plasma es una forma especializada de electrocauterio de radiofrecuencia, que entrega la energía eléctrica a través de un arco de gas ionizado. Proporcionar hemostasia monopolar de electrotérmico, esta técnica sin contacto tiene la ventaja de evitar que el electrodo se adhiera a los tejidos⁴. El gas ionizado se dirige automáticamente al área de la más baja resistencia eléctrica y esté ausente cuando la resistencia aumenta debido a la desecación a otras áreas no desecados. Esto produce una profundidad limitada uniforme de coagulación^5,6. Factores que influyen en el efecto de la coagulación son la activación del tiempo, la configuración del dispositivo de la coagulación y la distancia entre la sonda y el tejido. El helio es otro gas portador, que puede ser utilizado para plasma coagulación⁷. Clínicos recientes estudios concentrados en los resultados clínicos en lugar de hallazgos histológicos y funcionales^3,8,9, mientras que estudios experimentales enfocados en vitro investigaciones¹⁰ o experimentos en órganos perfundidos aislados¹¹.

El protocolo subyacente permite el estudio de los efectos de coagulación del plasma en un modelo animal grande cerca de la aplicación clínica utilizando equipamiento humano en cerdos: microcirculación es evaluada de forma no invasiva por un flujómetro Doppler láser y Espectrofotómetro, que es una herramienta clínica para esta indicación^12,13. Cambios de temperatura durante la coagulación son monitoreados con un termómetro de infrarrojos y una cámara termográfica. La profundidad de la coagulación se mide en histológica hematoxilina/eosina secciones manchada después de la recolección de muestras de tejido. Para la comparación con otros medios de hemostasia secundaria, se realizan experimentos de presión de explosión. En contraste con técnicas previamente descritas¹⁴, estos se llevan a cabo órganos explanted para excluir la presión arterial relacionados con efectos. Además de las investigaciones descritas en los efectos locales de coagulación del plasma, pruebas de sangre estándar puede realizarse también en el modelo porcino.

Protocolo

Se siguieron las normas regidas por la legislación alemana para los estudios en animales así como principios de laboratorio Animal Care (institutos nacionales de salud publicación ed. 8, 2011). Se concede permiso oficial de la oficina gubernamental de cuidado de animales (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Alemania).

1. los animales

1. Uso de cerdos hembra landrace alemán (25-30 kg de peso) alojados en jaulas abiertas.
2. Uso de 5 animales por grupo (argón y helio).
3. Permitir a los animales para aclimatarse a los alrededores de por lo menos una semana antes de los experimentos. Animales rápidos 24 h antes de la cirugía con acceso libre al agua.

2. anestesia

1. Premedicate los animales con una inyección intramuscular de ketamina (15 mg/kg de peso corporal [BW]), xilacina (10 mg/kg P.C.) y atropina (0.1 mg/kg P.C.) 10 minutos antes de la inducción de la anestesia.
2. Acceso venoso periférico se establece por la colocación de una cánula de calibre 22 en una vena de la oreja.
3. Inducir la anestesia general por inyección i.v. de propofol 2 mg/kg de peso corporal.
4. Coloque el animal en posición decúbito supina y realizar una incisión longitudinal de la piel en el surco yugular sobre una longitud de 2 cm. localizar la vena a través de la contundente preparación del tejido subcutáneo. Inserte la cánula, luego alambre de Seldinger.
5. Cánula de retracción e insertar 14 Fr. catéter sobre el alambre guía. Retraiga el alambre de guía. Conectar el catéter a la extensión y fijar el catéter mediante una correa o una sutura.
6. Saque la lengua e insertar laringoscopio recta. Utilice la punta del laringoscopio para tirar abajo la epiglotis. Inserte el tubo por las cuerdas vocales. Coloque el brazalete en la glotis e inflar.
7. Ventilar con oxígeno al 40% en 20-26 respiraciones/min y un volumen tidal de 10 ml/kg para mantener la tensión de dióxido de carbono parcial fin-de marea entre 36 y 42 mm Hg.
8. Mantener la anestesia con isoflurano con una concentración de 1-1.5% y fentanilo a una concentración de 3-4 μg/kg/h.
9. Suministro de solución de lactato de Ringer a una tasa inicial de 4 mL/kg/h y aumentar después de laparotomía a una tasa de infusión constante de 8 mL/kg/h.

3. cirugía y coagulación del Plasma

1. Coloque el animal en una posición supina sobre una mesa quirúrgica estándar.
2. Desinfectar la piel mediante la aplicación de un desinfectante quirúrgico estándar (2-Propanol 45 g/100 g, 1-Propanol 10 g / 100g, bifenil-2-ol 0,2 g/100 g) con una esponja quirúrgica por 3 veces.
3. Realizar una laparotomía media amplia del proceso xifoides hasta el pubis con un bisturí e instalar retractores quirúrgicos.
4. Encienda el aparato de coagulación del plasma, abrir la botella de gas argón o helio, según el gas portador utilizado. Ajustar el flujo del gas a 3 L/min coagulación seleccione dispositivo potencia de salida deseada.
   Nota: Ambos gases nobles, argón o helio, puede utilizarse para la coagulación del plasma. Efectos de coagulación son comparables. Ver referencia⁷ para más detalles.
5. Realizar coagulación del plasma en el lóbulo izquierdo del hígado como se describió anteriormente⁷. Usar un molde de titanio (abertura cuadrada 1 x 1 cm²) para estandarizar la zona de coagulación. Coagular durante 5 s a una distancia de la punta de prueba de 1 cm. Coagulaciones con diferentes de potencia pueden realizarse con una distancia corta entre las coagulaciones de 5 mm (figura 1).
6. Para la cosecha del hígado, dividir todas las conexiones ligamentosas al hígado. Aislar y dividir el pedículo hepático por encima de la flexión duodenal superior dejando largas porciones de la vena porta y conducto biliar común. Dividir la vena cava por encima y por debajo del hígado y recupera el órgano.
7. Después de la cosecha el hígado, los cerdos fueron sacrificados por administración i.v. de 0.16 g/kg BW pentobarbital.
8. Para los experimentos de la presión de explosión, resecar la mitad del lóbulo hepático izquierdo medial con unas tijeras afiladas. Plasma-coagular el corte superficial (100W de potencia de salida) o sellar la superficie del corte con sellante de fibrina (figura 2).

4. microcirculación medición

Nota: Espectroscopia del Laser Doppler puede determinar el flujo sanguíneo en el tejido a través de la medición de la cambio de Doppler causada por el movimiento de los eritrocitos. La señal del Laser se correlaciona con el número de eritrocitos móviles. Espectroscopía Doppler láser está en uso clínico (por ejemplo medicina del trasplante) y ha sido validado varias veces¹⁵.

1. Encienda el medidor Doppler laser y espectrofotómetro. Utilizar una sonda plana.
2. Tomar mediciones de línea base de flujo y velocidad. Guarde o tenga en cuenta los valores.
3. Realizar la coagulación como se describe en 3.5.
4. Coloque la sonda plana en sitios de coagulación y medir caudal y velocidad. Una vez más, salvar o valores en cuenta.
5. Repita para todos los ajustes de energía del dispositivo coagulador.

5. medición de la temperatura

1. Cambiar el sistema (cámara termográfica portátil y termómetro de infrarrojos) y déjela funcionar durante al menos 1 h antes de realizar las mediciones.
2. Ajustar el foco y ve el marco de la cámara termográfica en el sitio de la coagulación. Secuencias de infrarrojos pueden detectarse con la resolución espacial de 1024 x 768 píxeles con una resolución de temperatura mayor de 20 mK. Tener en cuenta, que la región de la coagulación y el tejido circundante — afectados por la transferencia de calor, se encuentra en medio de la vista.
   Nota: Debe incluir tantos pixeles del marco como sea posible para una óptima resolución espacial.
3. Registrar el proceso de coagulación con el coagulador de plasma en la superficie del hígado con la cámara termográfica durante un período de 2 min.
4. Analizar secuencias de imágenes con el software de análisis de termografía: definir regiones de interés.
   Nota: El Software calcula el curso de la temperatura media correspondiente con el tiempo.

6. coagulación profundidad medida

1. Cosecha el lóbulo izquierdo de hígado medial con unas tijeras afiladas.
2. Suprimir los sitios de coagulación con grosor de 1 cm. Cortar en segmentos longitudinales gruesos de 3 mm para su posterior procesamiento.
3. Muestras de tejido de reparación a 4 ° C durante la noche con neutro 10% tamponada con formalina. Calor 2 ° C sobre el punto de fusión de la parafina y embed rebanadas. Proceso durante la noche.
4. Realizar coloración de hematoxilina/eosina.
   1. Desparafinizar e hidratar los tejidos sumergiendo posteriormente en 2 x xileno, 100% de etanol (EtOH), 95% EtOH, 70% EtOH, desionizada de H₂O 2 minutos.
   2. Mancha de la muestra de tejido con solución de hematoxilina de Meyer durante 3 minutos.
   3. Ahora enjuague en agua corriente durante 5 minutos.
   4. Teñir el tejido con solución de eosina durante 3 minutos.
   5. Enjuague 2 x EtOH 95% y luego xileno durante 3 minutos. Monte con el medio de montaje estándar.
5. Encender el sistema (conectado microscopio cámara, software de imágenes). Ver todas las secciones con 40 aumentos.
6. Tomar una imagen de un micrómetro de objeto en un aumento de 40 X. Pulse recalibrar el botón en la ventana de objetivos. Seleccione calibración manual. Trace una línea en la imagen del micrómetro de 100 μm. Enter 0,1 mm en el cuadro de diálogo y pulse OK.
7. Seleccionar la longitud de la vista > Análisis de controles > anotaciones y medidas de la ventana. Medida de la superficie del hígado al margen de la coagulación con el ratón. Exportación o nota el resultado. Repita la medición en otra ubicación en la diapositiva misma.
   Nota: Profundidad de coagulación puede diferenciarse fácilmente del tejido normal del hígado por el margen agudo entre los cordones de hepatocitos normales y la zona de necrosis con citoplasma contraído, núcleos picnóticos y zonas de hemorragia.
8. Calcular el promedio de dos mediciones.

7. medición de la presión de explosión

1. Encender el sistema (bombas automáticas, medidor de presión). Preparar las muestras del hígado según el paso 3.7.
   Nota: Use dos bombas paralelo conectadas a través de una llave de 3 vías. La presión máxima de 1.500 mm Hg no puede obtenerse con una sola bomba.
2. Aislamiento de la vena porta, arteria hepática común y conducto biliar con tijeras en el pedículo háptico. Sujetar la vena porta con un fórceps de overholt y ligan con una sutura de monofilamento 4-0. Abrazadera de la arteria hepática común un fórceps de overholt y ligan con una sutura de monofilamento 4-0.
3. Insertar catéter Ch-16 en el conducto biliar común y ligan con una sutura de seda 2-0. Conectar el catéter a las bombas automáticas, instalar llave de 3 vías con medidor de presión (figura 3).
4. Llene la jeringa de perfusión con solución salina.
5. Inicio bombas automáticas con una tasa de entrega de 99 mL/h.
6. Vigilar el hígado cortado metros superficie y presión de salida y registro de presión de estallido.
   Nota: Para fácil reconocimiento de fugas, azul patente puede añadirse a solución salina (azul patente 2 mL + solución salina 18 mL). Es más fácil observar la presión de explosión por notar el tiempo de pérdida de presión en el medidor de presión.

Resultados

Microcirculación: Utilizando el dispositivo de diagnóstico para la hemostasia después de coagulación del plasma se puede demostrar por los cambios de la microcirculación. Sangre capilar flujo (muestra como unidades arbitrarias (UA)) disminuye desde un valor basal de 142.7 ± 76.08 AU ± 57.78 49.57 AU en 25 W dispositivo de potencia de salida, a 48,5 ± 7,26 AU en 50 W y a 5,04 ± 1.31 AU 100 W (figura 4).

Discusión

Modelos de roedores para la cirugía hepática se establecen para un tiempo de¹⁶. Sin embargo, los modelos animales grandes ofrecen ciertas ventajas: ningún equipo de microcirugía se necesita como equipo operativo estándar para los seres humanos puede ser aplicado, las técnicas quirúrgicas son comparables al uso clínico y métodos de evaluación clínica estándar puede transferido a los experimentos. Por ejemplo, se puede realizar exámenes clínicos estándar sin la necesidad de métodos d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine 20 mg/mL	Vetoquinol GmbH	Xylapan
Ketamine 100 mg/mL	Ceva GmbH	Ceva Ketamine Injection
Atropine 100 mg / 10 mL	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH	Atropinsulfat Köhler 100mg Amp.
Propofol	Fresenius Kabi GmbH	Propofol 1% MCT Fresenius
Fentanyl	KG Rotexmedica GmbH	Fentanyl 0,5mg Rotexmedica
Isoflurane	Abbot GmbH	Forene 100% (V/V) 250 mL
Ringer's lactate solution	Baxter Deutschland GmbH		sodium 131mmol/l, potassium 5 mmol/l, calcium 2 mmol/l, cloride 111 mmol/l, lactate 29 mmol/l
Surgical disinfactant	Schülke & Mayr GmbH	Kodan Tinktur forte gefärbt 1l 104804
Motorized microscope	Nikon Instruments Europe	Eclipse TE2000-E
Microscope camera	Nikon Instruments Europe	Digitalsight DS-Qi1Mc
Imaging software	Nikon Instruments Europe	NIS elements Vers. 4.40
Plasma coagulator	Söring GmbH	CPC-1000
Argon gas	Linde AG	Argon 4.8
Helium gas	Linde AG	Helium 4.8
O2C	LEA Medizintechnik GmbH	O2C Version 1212	with LF-2 or LF-3 probe
Infrared thermometer	Voltcraft	VOLTCRAFT IR 260-8S
Thermographic camera	InfraTec GmbH	VarioCAM HD head 820
Thermographic analysis sofrtware	InfraTec GmbH	IRBIS 3
Mayer's Hematoxylin solution		Merck 1.09249
Eosin solution	VWR International GmbH	Merck 1.09844
Rollerpump Masterflex L/S easy Load	Cole-Parmer Instrument Company	model 7518-10
Perfusorpump	B. Braun Melsungen AG	Perfusor secura FT
Digital pressure meter	Greisinger electronic	GMH 3161
Perfusorsyringe, 50 mL	B. Braun Melsungen AG	REF 8728810 F
Perfusor line, Type IV Standard, PVC Luer lock	B. Braun Melsungen AG	REF 8722960
3-Way stopcock, Dicofix C35C	B. Braun Melsungen AG	REF 16494 C
Silk 2-0. 3 metric	Resorba	REF H5F
Vicryl 4-0 Sutupak	Ethicon	V1224H
NaCl 0.9 %	B. Braun Melsungen AG