הערכה של קרישה בפלסמה על רקמת הכבד במודל חיה גדולה In Vivo

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעריך השפעול קרישה בפלסמה רקמת הכבד ויוו. במודל חזירי, מנתחי מיקרו נבדק ע י לייזר דופלר, קרישה עומק נמדד בהיסטולוגיה, טמפרטורה באתר קרישת הדם על ידי מד חום אינפרא אדום, מצלמה תרמוגרפיים צינור איטום אפקט מתועדת על ידי לחץ פרץ ניסויים.

Abstract

קרישה בפלסמה כסוג של electrocautery משמש בניתוח כבד במשך עשרות שנים כדי לאטום את השטח גדול לחתוך הכבד לאחר hepatectomy העיקרי למניעת שטפי דם בשלב מאוחר יותר. ההשפעות המדויק של קרישה בפלסמה על רקמת הכבד נבדקים רק לקוי. במודל שלנו חזירי, אפשר לבחון את ההשפעות קרישה קרוב היישום הקליני. לייזר משולב דופלר זרימה, ספקטרופוטומטרים מסמכים microcirculation משתנה במהלך קרישה בעומק הרקמה 8 מ"מ noninvasively, מתן מידע הניתנת לכימות על hemostasis מעבר הרושם הקליני סובייקטיבית. הטמפרטורה באתר קרישת דם בבדיקות קרישה פריור, פוסט של מד חום אינפרא אדום, עם מצלמה תרמוגרפיים קרישת הדם, מידת הטמפרטורה קרן גז אינו אפשרי עקב הסף העליון של המכשירים. העומק של קרישת הדם נמדד ברמה המיקרוסקופית ב hematoxylin/אאוזין מוכתמים מקטעים לאחר כיול מיקרומטר אובייקט ונותן מידע מדויק על כוח הגדרה-קרישה העומק-הזיקה. האפקט איטום נבדק על צינורות המרה כמו זה לא אפשרי coagulator פלזמה לחסום כלי דם גדולים יותר. פרץ לחץ ניסויים מתבצעות בחוץ אברים explanted כדי לשלול את לחץ הדם הקשורים אפקטים.

Introduction

ארגון קרישה בפלסמה (APC) הוא כלי נפוץ בניתוח בטן במשך יותר משלושה עשורים^1,2. זה טכניקה סטנדרטית עבור ההישג של hemostasis המשני אחרי hepatectomy מז'ור מאת איטום הכבד לחתוך משטח למניעת שטפי דם מאוחר יותר³. קרישה בפלסמה היא צורה מיוחדת של גלי רדיו electrocautery, אשר מספק את האנרגיה החשמלית באמצעות קשת של גז מיונן. מתן hemostasis אלקטרותרמי monopolar, אסטמה של טכניקה זו יש את היתרון של מניעת האלקטרודה לדבוק רקמות⁴. קרן גז מיונן מכוונת באופן אוטומטי לאזור של ההתנגדות החשמלית הנמוכה, היא מפנה את מבטה כאשר ההתנגדות עולה עקב לייבוש לאזורים אחרים עדיין לא desiccated. זה מייצר לעומק מוגבל אחיד של קרישה^5,6. גורמים המשפיעים על האפקט קרישת הדם הם ההפעלה זמן, את הגדרת צריכת חשמל של המכשיר קרישת הדם ואת המרחק בין החללית אל הרקמה. הליום הוא גז מנשא אחר, אשר יכול לשמש עבור פלזמה קרישה⁷. מחקרים אחרונים שהיו בשימוש קליני מרוכז על התוצאות הקליניות מאשר ממצאים היסטולוגית ופונקציונליים^3,8,9, בעוד מחקרים ניסיוניים התמקדו במבחנה חקירות¹⁰ או ניסויים מבודד איברים perfused¹¹.

פרוטוקול המשמש כבסיס מאפשר חקר ההשפעות של קרישה בפלסמה במודל בעלי חיים גדולים קרוב היישום הקליני באמצעות ציוד סטנדרטי אנושי על חזירים: Microcirculation מוערך noninvasively על ידי זרימה דופלר לייזר ו ספקטרופוטומטרים, אשר הוא כלי קליני סטנדרטי עבור^12,זו אינדיקציה¹³. שינויי טמפרטורה במהלך קרישה מנוטרים של מד חום אינפרא אדום, מצלמה תרמוגרפיים. העומק של קרישת הדם נמדד על היסטולוגית hematoxylin/אאוזין צבעונית מקטעים לאחר קציר של דגימות רקמה. עבור ההשוואה עם אמצעים אחרים עבור hemostasis המשני, מתבצעים ניסויים לחץ פרץ. בניגוד טכניקות שתואר לעיל¹⁴, אלה נערכות על האיברים explanted כדי לא לכלול את לחץ הדם הקשורים אפקטים. בנוסף החקירות שתואר השפעות מקומיות של קרישה בפלסמה, בדיקות דם רגיל גם ניתן לבצעם במודל חזירי.

Protocol

כללים נשלטת על ידי החקיקה הגרמנית מחקרים שנעשו בבעלי חיים, כמו גם עקרונות של מעבדה חיה טיפול (מכוני הבריאות הלאומיים הפרסום עורך 8, 2011) עקבו אחריך ניתנה ההרשאה רשמי ממשרד ממשלתי טיפול בבעלי חיים (Landesamt לדנציג נאטור, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, אסן, גרמניה).

1. בעלי חיים

1. משתמשים בחזירים נשי צמחי תרבות מסורתיים גרמני (במשקל של 25-30 ק"ג) שוכן בתוך כלובים פתוח.
2. השתמש חיות 5 לכל קבוצה (ארגון והליום).
3. לאפשר את החיות להתאקלם בסביבה למשך לפחות שבוע לפני הניסויים. חיות מהירות עבור 24 שעות לפני הניתוח עם גישה חופשית למים.

2. הרדמה

1. Premedicate החיות עם זריקה תוך שרירית של קטאמין (15 מ"ג/ק"ג משקל גוף [BW]), חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg BW) אטרופין (0.1 mg/kg BW) 10 דקות לפני אינדוקציה של הרדמה.
2. גישה ורידית היקפיים היא הוקמה על ידי הצבת בצינורית 22-מד לתוך הווריד האוזן.
3. לגרום הרדמה כללית על ידי הזרקת עירוי propofol 2 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
4. למקם את החיה במצב פרקדן, לבצע חתך אורכי העור ב- groove צוואר מעל באורך של 2 ס מ. וריד אתר דרך ההכנה בוטה של רקמת השומן התת עורית. הכנס בצינורית, ואז Seldinger תיל.
5. . משכי בצינורית והכנס קטטר בצרפתית 14 מעבר לגדר מדריך. תמשוך את החוט. להתחבר קטטר הסיומת, שמלמדות את הצנתר על ידי רצועה או התפר.
6. . תוציא את הלשון והכנס laryngoscope ישר. השתמש את קצה laryngoscope כדי להוריד את הגרון. הכנס את הצינורית בתוך מיתרי. למקם את השרוול תחת glottis ונפח.
7. לאוורר עם 40% חמצן ב 20-26 נשימות לדקה, נפח ענק של 10 מ"ל/ק"ג כדי לשמור על המתח דו תחמוצת פחמן חלקי קצה-גאות בין 36 ל 42 מ מ כספית.
8. לשמור על הרדמה עם איזופלוריין-ריכוז של 1-1.5%, פנטניל-ריכוז של 3-4 µg/ק ג/שעה.
9. לספק תמיסת רינגר לקטט בשיעור התחלתי של 4 מ"ל/ק"ג/h, ולהגדיל לאחר פתיחת בטן כדי שיעור קבוע אינפוזיה של 8 מ"ל/ק"ג/שעה.

3. ניתוח ו קרישה בפלסמה

1. מקם את החיה במצב פרקדן על שולחן כירורגי סטנדרטי.
2. לחטא את העור על-ידי החלת מחטא כירורגי רגיל (2-פרופנול 45 גרם/100 גרם, 1-פרופנול 10 גרם/100 גרם, Biphenyl-2-ol 0.2 גרם/100 גרם) עם מקלון כירורגי עבור 3 פעמים.
3. לבצע פתיחה של קו האמצע רחב הבטן מן הסרעפת כדי לחיקו עם איזמל ולהתקין רטרקטורים כירורגיים.
4. לעבור על המכשיר קרישה פלזמה, לפתוח בקבוק גז ארגון או הליום, בהתאם הגז המוביל בשימוש. להתאים את זרימת הגז לשלטון 3 L לדקה קרישה בחר התקן פלט כרצונכם.
   הערה: שני הגזים האצילים, ארגון או הליום, יכול לשמש עבור קרישה בפלסמה. קרישה תופעות דומות. ראה התייחסות⁷ לקבלת פרטים.
5. מבצע קרישה בפלסמה הכבד האונה השמאלית כפי שתואר לעיל⁷. השתמש תבנית טיטניום (1 x 1 ס מ מרובע צמצם²) כדי לתקנן את אזור קרישת הדם. מצב של קרישת חסר עבור 5 s עם מרחק בדיקה של 1 ס מ. ניתן לבצע את coagulations עם הגדרות צריכת חשמל שונה לצד מרחק קצר בין coagulations של 5 מ מ (איור 1).
6. עבור קציר של הכבד, לחלק כל החיבורים ligamentous אל הכבד. לבודד ולחלק pedicle הכבד מעל flexure תריסריון מעולה להשאיר חלקים ארוכים של וריד שער הכבד, צינור המרה המשותף. לחלק את הווריד בכליות מעל ומתחת הכבד ולאחזר את האיבר.
7. לאחר המסיק הכבד, החזירים היו מורדמים על ידי עירוי מינהל 0.16 g/kg BW פנטוברביטל.
8. על הניסויים לחץ פרץ, נכרות חצי של האונה השמאלית של הכבד המדיאלי עם מספריים חדות. פלזמה-מצב של קרישת חסר החתך על פני השטח (הספק 100W) או לאטום את המשטח לחתוך עם דבק פיברין (איור 2).

4. פיפטות מדידה

הערה: לייזר ספקטרוסקופיה דופלר ניתן לקבוע את זרימת הדם בתוך הרקמה באמצעות מדידה של דופלר הנגרמת על ידי התנועה של אריתרוציטים. האות לייזר עולה בקנה אחד עם המספר של אריתרוציטים נע. ספקטרוסקופית לייזר דופלר נמצא בשימוש קליני (למשל השתלת ברפואה) ומאז לאמת מספר פעמים¹⁵.

1. . הפעילי את לייזר דופלר זרימה ואת ספקטרופוטומטרים השתמש בדיקה שטוח.
2. קח למדידות בסיסית עבור זרימת והמהירות. לשמור או הערה הערכים.
3. לבצע קרישת הדם כמתואר תחת 3.5.
4. במקום המכשיר שטוח על אתרי קרישת הדם, מדד תזרים והמהירות. שוב, לשמור או הערה ערכים.
5. חזור על כל הגדרות צריכת החשמל של ההתקן coagulator.

5. הטמפרטורה מדידה

1. להחליף את המערכת (המצלמה תרמוגרפיים המחברת, מד חום אינפרא אדום) ולתת לו לרוץ במשך לפחות שעה לפני ביצוע מדידות.
2. כוונון פוקוס ולהציג מסגרת על המצלמה תרמוגרפיים באתר קרישת הדם. רצפים אינפרא-אדום יכול להתגלות עם הרזולוציה המרחבית של 1024 x 768 פיקסלים עם טמפרטורה רזולוציה גדולה יותר 20 ח"כ. לקחת בחשבון, זה האזור של קרישת הדם ואת הרקמה הסובבת — מושפעים על-ידי העברת החום – ממוקם באמצע הנוף.
   הערה: זה צריך לכלול פיקסלים רבים של המסגרת ככל האפשר עבור המרחבי של פתרון אופטימלי.
3. תהליך קרישת הדם רשומה עם coagulator פלזמה על פני הכבד עם המצלמה תרמוגרפיים על פני תקופה 2-מין.
4. לנתח את רצפי תמונות עם התוכנה ניתוח הדמאה תרמית: להגדיר אזורים מעניינים.
   הערה: תוכנות מחשב הקורס לטמפרטורה המתאימה רשע לאורך זמן.

6. מדידת העומק קרישה

1. הקציר האונה השמאלית של הכבד המדיאלי עם מספריים חדות.
2. לסלק את האתרים קרישה עם עובי 1 ס מ. חותכים למקטעים האורך בעובי 3 מ מ עיבוד נוסף.
3. תיקון דגימות רקמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם נייטרלי 10% buffered פורמלין. חום שעוות פרפין 2 ° C מעל נקודת ההיתוך ולהטביע פרוסות. תהליך בן לילה.
4. לבצע צביעת Hematoxylin/אאוזין.
   1. Deparaffinize ומעניק הרקמה בטבילת לאחר מכן 2 x קסילן, 100% אתנול (EtOH), 95% EtOH, 70% EtOH, יונים H₂O למשך 2 דקות.
   2. כתם דגימת הרקמות של מאייר פתרון Hematoxylin למשך 3 דקות.
   3. עכשיו לשטוף במי ברז למשך 5 דקות.
   4. כתם הרקמה אאוזין פתרון במשך 3 דקות.
   5. לשטוף ב 2 x EtOH 95% ולאחר מכן קסילן למשך 3 דקות. הר עם המדיום הרכבה סטנדרטי.
5. . הפעילי את המערכת (מיקרוסקופים המחוברים מצלמה, תוכנות ליצירת תמונות) הצג את כל המקטעים עם 40 X הגדלה.
6. קח תמונה של מיקרומטר אובייקט בהגדלה גדולה של 40 X. לחץ לחצן כיול מחדש החלון מטרות. בחר כיול ידני. צייר קו על התמונה מיקרומטר של 100 מיקרומטר. הזן 0, 1 מ מ, בתיבת הדו-שיח ' ולחץ על ' אישור '.
7. בחר אורך בתצוגה > ניתוח פקדים > חלון מדידות וביאורים. למדוד מהמשטח הכבד לשוליים קרישה עם העכבר. ייצוא או הערה התוצאה. חזור על המדידה על מיקום אחר לאותה השקופית.
   הערה: עומק קרישה יכול בקלות להיות מבודלים מהקבצים רקמת הכבד נורמלי על ידי השוליים חדים בין חבלים hepatocyte נורמלי באזור של נמק עם ציטופלזמה הגמדי, גרעינים pyknotic אזורי דימום.
8. חישוב ממוצע מתוך שתי מדידות.

7. מדידת לחץ פרץ

1. . הפעילי את המערכת (משאבות אוטומטיים, נפיצות) הכינו את הדגימות כבד על פי השלב 3.7.
   הערה: השתמש שתי משאבות מקבילי מחובר דרך 3-דרך-צימוד. אין אפשרות לקבל את הלחץ המקסימלי של 1500 מ"מ כספית עם משאבה בודדת.
2. לבודד וריד שער הכבד, עורק הכבד נפוץ, צינור המרה עם מספריים ב pedicle המספקת. תהדק את וריד שער הכבד עם מלקחיים אוברהולט, מאתרים ומפסיקים בתפר monofil 4-0. תהדק את עורק הכבד נפוץ מלקחיים אוברהולט, מאתרים ומפסיקים בתפר monofil 4-0.
3. להכניס קטטר Ch-16 צינור המרה, מאתרים ומפסיקים בתפר משי 2-0. להתחבר הקטטר המשאבות אוטומטיים, להתקין 3-דרך צימוד עם מד לחץ (איור 3).
4. למלא את המזרק זלוף עם תמיסת מלח.
5. להתחיל משאבות אוטומטית עם קצב העברה של 99 mL/h.
6. לפקח על הכבד לחתוך משטח ובלחץ מטר ללחץ פרץ זליגת ולהקליט.
   הערה: זיהוי קל של דליפה, פטנט כחול יכול להתווסף תמיסת מלח (2 מ"ל פטנט כחול + 18 מ ל תמיסת מלח). קל יותר להתבונן פרץ לחץ על ידי לב של אובדן הלחץ על מד לחץ.

תוצאות

מנתחי מיקרו: ניצול בהתקן אבחון עבור hemostasis בעקבות קרישה בפלסמה ניתן להדגים על ידי מנתחי מיקרו שינויים. נימי דם זרימה (מוצג בתור יחידות שרירותי (AU)) תקטן מערך הבסיס של 142.7 ± 76.08 AU כדי 57.78 ± 49.57 AU-25 W התקן פלט כוח, כדי 48.5 ± 7.26 AU 50 W וכדי 5.04 ± 1.31 AU ב-100 W (איור 4).

Discussion

מכרסמים מודלים לניתוח בכבד נוצרים עבור זמן¹⁶. עם זאת, מודלים בעלי חיים גדולים מציעות יתרונות מסוימים: אין ציוד המיקרוכירורגית נדרש ציוד פעיל סטנדרטי עבור בני אדם יכול להיות מיושם, טכניקות ניתוחיות דומות לשימוש קליני, שיטות הערכה קלינית רגיל יכול להיות להעביר הניסויים. לדוגמה, ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine 20 mg/mL	Vetoquinol GmbH	Xylapan
Ketamine 100 mg/mL	Ceva GmbH	Ceva Ketamine Injection
Atropine 100 mg / 10 mL	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH	Atropinsulfat Köhler 100mg Amp.
Propofol	Fresenius Kabi GmbH	Propofol 1% MCT Fresenius
Fentanyl	KG Rotexmedica GmbH	Fentanyl 0,5mg Rotexmedica
Isoflurane	Abbot GmbH	Forene 100% (V/V) 250 mL
Ringer's lactate solution	Baxter Deutschland GmbH		sodium 131mmol/l, potassium 5 mmol/l, calcium 2 mmol/l, cloride 111 mmol/l, lactate 29 mmol/l
Surgical disinfactant	Schülke & Mayr GmbH	Kodan Tinktur forte gefärbt 1l 104804
Motorized microscope	Nikon Instruments Europe	Eclipse TE2000-E
Microscope camera	Nikon Instruments Europe	Digitalsight DS-Qi1Mc
Imaging software	Nikon Instruments Europe	NIS elements Vers. 4.40
Plasma coagulator	Söring GmbH	CPC-1000
Argon gas	Linde AG	Argon 4.8
Helium gas	Linde AG	Helium 4.8
O2C	LEA Medizintechnik GmbH	O2C Version 1212	with LF-2 or LF-3 probe
Infrared thermometer	Voltcraft	VOLTCRAFT IR 260-8S
Thermographic camera	InfraTec GmbH	VarioCAM HD head 820
Thermographic analysis sofrtware	InfraTec GmbH	IRBIS 3
Mayer's Hematoxylin solution		Merck 1.09249
Eosin solution	VWR International GmbH	Merck 1.09844
Rollerpump Masterflex L/S easy Load	Cole-Parmer Instrument Company	model 7518-10
Perfusorpump	B. Braun Melsungen AG	Perfusor secura FT
Digital pressure meter	Greisinger electronic	GMH 3161
Perfusorsyringe, 50 mL	B. Braun Melsungen AG	REF 8728810 F
Perfusor line, Type IV Standard, PVC Luer lock	B. Braun Melsungen AG	REF 8722960
3-Way stopcock, Dicofix C35C	B. Braun Melsungen AG	REF 16494 C
Silk 2-0. 3 metric	Resorba	REF H5F
Vicryl 4-0 Sutupak	Ethicon	V1224H
NaCl 0.9 %	B. Braun Melsungen AG