플라즈마 응고는 큰 동물 모델에서 에서 Vivo에서 간 조직에의 평가

요약

여기 선물이 비보에간 조직에 플라즈마 응고를 실험적으로 평가 하는 프로토콜. 돼지 모델에서 미세 레이저 도플러 검사, 응고 깊이 조직학 측정, 온도 적외선 온도계와 열감지 카메라와 덕트 씰링 효과 의해 응고 사이트에서 버스트 압력에 의해 문서화 실험입니다.

초록

플라즈마 응고 electrocautery의 형태로 나중 단계에서 출혈을 방지 하기 위해 주요 hepatectomy 후 큰 간 잘라 표면 밀봉 수십 년 간 수술에 사용 됩니다. 간 조직에 플라즈마 응고의 정확한 효과 가난 하 게 검사 합니다. 우리의 돼지 모델에서 응고 효과 임상 응용 프로그램에 가까운 시험 될 수 있다. 결합 된 레이저 도플러 유량 계 및 분 광 광도 계 문서 미세 변경 8 m m 조직 깊이에서 응고 하는 동안 noninvasively, 주관적인 임상 인상 넘어 hemostasis에 대 한 정량 정보를 제공 합니다. 응고 사이트에서 온도 응고 하는 동안 적외선 온도계 사전 및 사후 응고와 열감지 카메라 평가, 가스 빔 온도 측정 소자의 상한값 때문에 가능 하지 않습니다. 응고의 깊이 되며/오신 교정 후 개체 마이크로미터 섹션을 물 들일에 현미경으로 측정 되 고 전원 설정-응고 깊이 관계에 대 한 정확한 정보를 제공. 그것은 큰 혈관을 밀봉 하기 위하여 플라즈마 coagulator 불가능으로 씰링 효과 담 관에 시험 된다. 버스트 압력 실험 수행 됩니다 밖으로 배제 혈압 explanted 장기 효과 관련.

서문

아르곤 플라즈마 응고 (APC) 3 년간^1,2보다 더 복 부 수술에서 널리 사용 되는 악기 이다. 그것은 이차 hemostasis의 성취에 대 한 표준 기술 간 씰링 하 여 주요 hepatectomy 잘라 나중 출혈³을 방지 하기 위해 표면. 플라즈마 응고는 이온화 가스의 아크를 통해 전기 에너지를 전달 하는 고주파 electrocautery의 특수 형태 이다. Monopolar electrothermal hemostasis, 제공이 비접촉 기술 조직⁴에 충실 하는 전극 방지의 이점이 있다. 이온화 가스 빔 자동으로 낮은 전기 저항 지역으로 이동 하 고 아직 포장해 다른 지역에 건조로 인해 저항 상승 때 멀리 설정 되어. 이 응고^5,6의 균일 한 제한 된 깊이 생성합니다. 응고 효과 영향을 미치는 요소는 활성화 시간, 응고 장치 및 조직에는 프로브에서 거리의 전원 설정. 헬륨은 플라즈마 응고⁷사용할 수 있는 다른 캐리어 가스 이다. 최근 임상 연구에 집중된 임상 결과 보다는 조직학 및 기능적인 결과^3,8,9, 체 외에서 조사^{10에 초점을 맞춘 실험 연구 하면서} 또는 격리 끼얹는다 장기¹¹에 실험.

기본 프로토콜 돼지에 인간 표준 장비를 사용 하 여 임상 응용에 가까운 큰 동물 모델에서 플라즈마 응고의 효과의 연구를 수 있습니다: 레이저 도플러 유량 계에 의해 미세 noninvasively 평가 및 분 광 광도 계,이 표시^12,13표준 임상 도구입니다. 응고 하는 동안 온도 변화를 적외선 온도계와 열감지 카메라 모니터링 된다. 조직학 되며/오신의 조직 샘플의 수확 후 섹션 스테인드 응고의 깊이 측정 됩니다. 이차 hemostasis에 대 한 다른 방법 가진 비교에 대 한 파열 압력 실험 수행 됩니다. 앞에서 설명한 기법¹⁴, 달리 이러한 혈압 제외 explanted 장기에 실시 하는 효과 관련. 플라즈마 응고의 로컬 효과에 설명된 조사, 뿐만 아니라 돼지 모델에서 또한 표준 혈액 검사를 맡아 수 있다.

프로토콜

동물 연구로 원리의 실험실 동물 관리 (건강의 국가 학회 간행물 출간: 8, 2011 년) 독일 입법에 의해 경 세 하는 규칙을 따라 했다. 공식 허가 정부 동물 관리 사무실 (Landesamt 위한 Natur, Umwelt und Verbraucherschutz 노르 트 베스트 팔 렌, Recklinghausen, 독일)에서 부여 됩니다.

1입니다. 동물

1. 열린 감 금 소에 여성 독일 landrace 돼지 (25-30 kg 무게)를 사용 합니다.
2. 그룹 (아르곤과 헬륨) 당 5 동물을 사용 합니다.
3. 실험 하기 전에 적어도 1 주일에 대 한 환경에 순응을 동물 허용. 물에 대 한 무료 액세스와 함께 수술 이전 24 시간에 대 한 빠른 동물.

2입니다. 마 취

1. Premedicate 동물 마 취 제 (15 mg/kg 몸 무게 [BW]), xylazine (10 mg/kg BW), 및 아트로핀 (0.1 mg/kg BW) 근육 주사와 마 취의 유도 하기 전에 10 분.
2. 주변 정 맥 접근 배치 22 게이지 정의 귀 정 맥에 의해 설정 됩니다.
3. Propofol 2 mg/kg 체중의 i.v. 주입 하 여 전신 마 취를 유도.
4. 부정사 위치에 동물을 놓고 2 cm. 피하 조직의 무딘 준비를 통해 정 맥 찾기의 길이 jugular 홈에 경도 피부 절 개를 수행 합니다. 정, 다음 Seldinger 와이어를 삽입 합니다.
5. 정을 철회 하 고 가이드를 통해 14 백. 카 테 터를 삽입 합니다. 가이드 와이어를 철회. 카 테 터는 내선 번호로 연결 하 고 스트랩 또는 봉합 하 여 카 테 터를 흥분 시키는.
6. 바로 후 두 경 삽입를 혀 밖으로 당기고. 풀 다운은 후두개는 후 두 경의 팁을 사용 합니다. 성 대를 통해 튜브를 삽입 합니다. Glottis 아래 갑을 놓고 팽창 합니다.
7. 36와 42 mm Hg 사이 끝 갯벌 부분 탄소 이산화 긴장을 유지 하 20-26 호흡/min과 10 ml/kg의 해 일 볼륨에서 40% 산소로 환기.
8. 1-1.5%의 농도에서 isoflurane와 3-4 µ g/k g/h의 농도에 펜타닐 마 취를 유지 합니다.
9. 4 mL/kg의 초기 속도로 벨의 젖 산 솔루션 공급/h, 8 mL/kg의 일정 한 주입 속도에 개복 술 후 증가/h.

3. 수술 및 플라즈마 응고

1. 표준 수술 테이블에 부정사 위치에 동물을 배치 합니다.
2. 표준 외과 살 균 제를 적용 하 여 피부를 소독 (2-프로 판 올 45 g/100 g, 1-프로 판 올 10 g/100 g, 비페닐-2-ol 0.2 g/100 g) 3 번 수술 면봉으로.
3. 메스와 액을 넓은 중간 선 개복 술 칼 프로세스에서 수행 하 고 외과 견인 기를 설치.
4. 플라즈마 응고 장치에 스위치, 아르곤 또는 헬륨 가스 병 사용된 캐리어 가스에 따라 오픈. 원하는 대로 3 L/분 선택 응고 장치 출력 전력에 가스 흐름을 조정 합니다.
   참고: 두 노블 가스, 아르곤 또는 헬륨, 플라즈마 응고에 대 한 사용할 수 있습니다. 응고 효과 비교할 수 있습니다. 자세한 내용은 참조⁷ 를 참조 하십시오.
5. 앞에서 설명한⁷왼쪽된 간 엽에 플라즈마 응고를 수행 합니다. 티타늄 형 (사각 조리개 1 x 1 c m²)를 사용 하 여 응고 영역을 표준화. 5 응고 프로브 거리 1 cm의 s. 5 mm (그림 1)의 coagulations 사이의 짧은 거리와 다른 전원 설정을 coagulations는 수행할 수 있습니다.
6. 간의 수확에 대 한 모든 인 대 연결 간을 나눕니다. 분리 하 고 문맥 및 일반적인 담 관의 긴 부분을 떠나 우수한 십이지 장 굴곡 위 간 작은 꽃 자루를 나눕니다. 위와 간 아래 caval 정 맥을 분할 하 고 기관 검색.
7. 간, 수확 후 돼지 0.16 g/kg BW pentobarbital i.v. 관리에 의해 안락사 되었다.
8. 버스트 압력 실험에 대 한 날카로운가 위 왼쪽된 중간 간 엽의 절반을 resect. 플라즈마 응고 컷 (100W 출력) 표면 또는 섬유 소 실 란 트 (그림 2)와 함께 잘라 표면 밀봉.

4. 미세 측정

참고: 레이저 도플러 분광학은 적혈구의 움직임으로 인 한 도플러 이동 측정을 통해 조직에 혈액 흐름을 확인할 수 있습니다. 레이저 신호 이동 적혈구의 수와 상관 한다. 레이저 도플러 분광학 임상 사용 (예: 이식 의학)과 여러 번¹⁵확인.

1. 레이저 도플러 유량 계 및 분 광 광도 계에 전환 합니다. 플랫 프로브를 사용 합니다.
2. 흐름 및 속도 대 한 기준 측정을 가져가 라. 저장 하거나 값을 확인 합니다.
3. 3.5에서 설명 된 대로 응고를 수행 합니다.
4. 응고 사이트 및 측정 흐름 및 속도에 플랫 프로브를 배치 합니다. 다시 저장 하거나 값을 참고 합니다.
5. Coagulator 장치의 모든 전원 설정에 대 한 반복 합니다.

5. 온도 측정

1. (열감지 카메라, 노트북, 및 적외선 온도계)에 시스템을 전환 하 고 측정을 수행 하기 전에 적어도 1 시간 동안 실행 하자.
2. 초점을 조정 하 고 응고 사이트에 열감지 카메라에 프레임을 봅니다. 20 보다 더 큰 온도 해상도 1024 x 768 픽셀의 해상도와 적외선 시퀀스를 검출 될 수 있다 mK. 고려, 그 응고와 주변 조직의 지역-열 전달에 의해 영향을-보기 중간에 위치 하 고 있습니다.
   참고: 그것은 가능한 최적 공간 해상도 대 한 프레임의 픽셀을 포함 해야 합니다.
3. 2 분 동안 열감지 카메라와 함께 간 표면에 플라즈마 coagulator과 응고 과정을 기록 합니다.
4. 온도 기록 분석 소프트웨어와 함께 이미지 시퀀스 분석: 관심의 영역을 정의.
   참고: 소프트웨어 시간 해당 평균 온도 과정을 계산합니다.

6. 응고 깊이 측정

1. 날카로운가 위 왼쪽된 중간 간 엽 수확.
2. 1 cm 두께가 응고 사이트를 삭제할. 추가 처리를 위해 3 m m 두꺼운 경도 세그먼트를 잘라.
3. 밤새 중립 10%와 4 ° C에서 수정 조직 샘플 버퍼링 말린. 열 용융 점 이상 2 ° C 파라핀 하 고 분할 영역을 포함. 프로세스 하룻밤입니다.
4. 되며/오신 얼룩을 수행 합니다.
   1. Deparaffinize 및 이후 2에 담거 서 조직을 수 화 x 크 실 렌, 100% 에탄올 (EtOH), 95 %EtOH, 70 %EtOH, 이온된 H₂O 2 분.
   2. 3 분 위한 마이어의 되며 솔루션 조직 샘플을 얼룩.
   3. 이제 5 분 동안 수돗물에 씻어.
   4. 3 분 오신 솔루션 조직 얼룩.
   5. 3 분 2 x EtOH 95% 그리고 크 실 렌에 린스. 표준 설치 매체와 함께 탑재.
5. (현미경 연결 된 카메라, 이미징 소프트웨어)에 시스템을 전환 합니다. 40 X 확대와 함께 모든 섹션을 보기.
6. 40 X의 확대는 개체 마이크로미터의 이미지를 가져가 라. 재조정 목표 창에서 버튼을 누릅니다. 수동 보정을 선택 합니다. 100 µ m. 대화 상자에서 m m 입력 0, 1 마이크로미터 이미지에 라인을 그릴 하 고 확인을 누릅니다.
7. 보기에서 길이 선택 > 분석 컨트롤 > 주석 및 측정 창. 마우스로 응고 여백에 간 표면에서 측정 합니다. 내보내기 또는 결과 참고. 같은 슬라이드에 다른 위치에 측정을 반복 합니다.
   참고: 응고 깊이 쉽게 정상적인 hepatocyte 코드와 수축 된 세포질, pyknotic 핵 및 출혈 영역 괴의 영역 사이의 날카로운 차이로 정상적인 간 조직에서 분화 될 수 있다.
8. 두 측정의 평균을 계산 합니다.

7. 버스트 압력 측정

1. (자동 펌프, 압력 미터)에 시스템을 전환 합니다. 3.7 단계에 따라 간 견본을 준비 합니다.
   참고: 3-방법-자 지를 통해 연결 된 두 개의 병렬 펌프를 사용 합니다. 1500 mm Hg의 최대 압력은 단일 펌프와 함께 얻을 수 없습니다.
2. 햅 틱 작은 꽃 자루가 위 문맥, 일반적인 간 동맥 및 담 즙 덕트를 격리 합니다. 문맥 overholt 집게와 클램프와 monofil 봉합 4-0와 선. 일반적인 간 동맥 overholt 집게를 죄 십시오 그리고 monofil 봉합 4-0와 선.
3. 일반적인 담 관으로 채널 16 카 테 터를 삽입 하 고 2-0 비단 봉합 사로 선. 자동 펌프 카 테 터를 연결, 압력 미터 (그림 3)와 함께 3 자 지를 설치 합니다.
4. 식 염 수로 관류 주사기를 채우십시오.
5. 99 mL/h의 배달 속도와 자동 펌프를 시작 합니다.
6. 버스트 압력 누설 및 기록에 대 한 잘라 간 표면과 압력 미터를 모니터링 합니다.
   참고: 누설의 더 쉬운 인식을 위해 특허 블루는 식 염 수 (2 mL 특허 블루 + 18 mL 식 염 수)을 추가할 수 있습니다. 버스트 압력 압력 미터에 압력의 손실의 시간을 주의 하 여 관찰 하는 것이 쉽습니다.

결과

미세: 플라즈마 응고 다음 hemostasis 위한 진단 장치를 활용 하 여 미세 혈관 변화에 의해 설명할 수 있습니다. 142.7 ± 76.08의 기준 값에서 모 세관 혈액 흐름 (임의의 단위 (AU)로 표시) 감소 57.78 ± 49.57 하는 누구나 48.5 ± 7.26에 25 W 장치 출력 전력, AU AU 50 W와 5.04 ± 1.31 AU 100 W (그림 4).

온도:

토론

설치류 모델 간 수술에 대 한 오랜 시간¹⁶에 대 한 설정 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 큰 동물 모델 특정 이점을 제공:로 적용할 수 있는 인 간에 대 한 표준 수술 장비, 수술 기법 비교 임상 사용 표준 임상 평가 방법 수 없음 microsurgical 장비 필요 전송 실험. 예를 들어 표준 임상 혈액 검사 특별 한 실험실 테스트 방법 (그림 10)에 대 한 필요 없이 수행할 수 있...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine 20 mg/mL	Vetoquinol GmbH	Xylapan
Ketamine 100 mg/mL	Ceva GmbH	Ceva Ketamine Injection
Atropine 100 mg / 10 mL	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH	Atropinsulfat Köhler 100mg Amp.
Propofol	Fresenius Kabi GmbH	Propofol 1% MCT Fresenius
Fentanyl	KG Rotexmedica GmbH	Fentanyl 0,5mg Rotexmedica
Isoflurane	Abbot GmbH	Forene 100% (V/V) 250 mL
Ringer's lactate solution	Baxter Deutschland GmbH		sodium 131mmol/l, potassium 5 mmol/l, calcium 2 mmol/l, cloride 111 mmol/l, lactate 29 mmol/l
Surgical disinfactant	Schülke & Mayr GmbH	Kodan Tinktur forte gefärbt 1l 104804
Motorized microscope	Nikon Instruments Europe	Eclipse TE2000-E
Microscope camera	Nikon Instruments Europe	Digitalsight DS-Qi1Mc
Imaging software	Nikon Instruments Europe	NIS elements Vers. 4.40
Plasma coagulator	Söring GmbH	CPC-1000
Argon gas	Linde AG	Argon 4.8
Helium gas	Linde AG	Helium 4.8
O2C	LEA Medizintechnik GmbH	O2C Version 1212	with LF-2 or LF-3 probe
Infrared thermometer	Voltcraft	VOLTCRAFT IR 260-8S
Thermographic camera	InfraTec GmbH	VarioCAM HD head 820
Thermographic analysis sofrtware	InfraTec GmbH	IRBIS 3
Mayer's Hematoxylin solution		Merck 1.09249
Eosin solution	VWR International GmbH	Merck 1.09844
Rollerpump Masterflex L/S easy Load	Cole-Parmer Instrument Company	model 7518-10
Perfusorpump	B. Braun Melsungen AG	Perfusor secura FT
Digital pressure meter	Greisinger electronic	GMH 3161
Perfusorsyringe, 50 mL	B. Braun Melsungen AG	REF 8728810 F
Perfusor line, Type IV Standard, PVC Luer lock	B. Braun Melsungen AG	REF 8722960
3-Way stopcock, Dicofix C35C	B. Braun Melsungen AG	REF 16494 C
Silk 2-0. 3 metric	Resorba	REF H5F
Vicryl 4-0 Sutupak	Ethicon	V1224H
NaCl 0.9 %	B. Braun Melsungen AG