Optimizar el uso de un Robot de manipulación de líquidos para llevar a cabo un alto rendimiento adelante química genética pantalla de Arabidopsis thaliana

Resumen

Una pantalla de alto rendimiento de pequeñas moléculas sintéticas se llevó a cabo en las especies de plantas modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desarrollado para un robot de manejo de líquidos, aumenta la velocidad de pantallas genética química hacia delante, acelerando el descubrimiento de nuevas moléculas pequeñas que afectan a la fisiología vegetal.

Resumen

Genética química cada vez más se emplea para descifrar rasgos en las plantas que pueden ser recalcitrantes a la genética tradicional debido a la redundancia génica o mortalidad. Sin embargo, la probabilidad de que una pequeña molécula sintética ser bioactivos es baja; por lo tanto, se deben probar miles de moléculas para encontrar de interés. Robótica sistemas están diseñados para manejar grandes números de muestras, aumenta la velocidad con que puede someterse a una biblioteca química además minimizar/estandarización de error para manejo de líquidos. Para lograr una pantalla adelante genética química de alto rendimiento de una biblioteca de 50.000 moléculas pequeñas en Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolos utilizando un líquido multicanal Banco manejo de robot fueron desarrollados que requieren un mínimo participación del técnico. Con estos protocolos, 3.271 pequeñas moléculas fueron descubiertas que causaron alteraciones fenotípicas visibles. compuestos de 1.563 inducida por raíces cortas, coloración de 1.148 compuestos alterados, pelos 383 compuestos causados y otras, no categorizado, alteraciones y germinación 177 compuestos inhibidas.

Introducción

En los últimos 20 años los investigadores en el campo de la biología vegetal han hecho grandes progresos utilizando enfoques de genética química, adelante y atrás, mejorar nuestra comprensión de la biosíntesis de la pared celular, citoesqueleto, biosíntesis de la hormona y señalización, Gravitropismo, patogenesia, biosíntesis de purinas y endomembranoso trata de^1,2,3,4,5. Empleando técnicas de genética química hacia adelante permite la identificación de fenotipos de interés y permite a los investigadores a entender los fundamentos genotípicos de procesos específicos. Por el contrario, genética reversa química busca productos químicos que interactúan con una proteína determinado objetivo⁶. Arabidopsis ha estado a la vanguardia de estos descubrimientos en Biología Vegetal porque su genoma es pequeña, traz y anotado. Tiene un tiempo de generación corto, y hay varias líneas de mutante/reportero disponibles para facilitar la identificación de la maquinaria subcelular aberrante⁷.

Hay dos principales cuellos de botella que retardan el progreso de avance pantallas genéticas química, el inicial proceso de selección y determinar el destino del compuesto de interés de⁸. Una ayuda importante en el aumento de la velocidad de la selección de moléculas pequeñas es el uso de la automatización y equipo automatizado⁹. Robots de manejo de líquidos son una excelente herramienta para manejar grandes bibliotecas de moléculas pequeñas y han sido fundamentales para impulsar avances en las ciencias biológicas¹⁰. El protocolo que presentamos está diseñado para aliviar los cuellos de botella asociados con el proceso de selección, lo que permite la identificación de moléculas bioactivas de pequeño a un ritmo rápido. Esta técnica disminuye la carga de trabajo y tiempo en nombre del operador mientras que también disminuye el costo económico para el investigador de principio.

Hasta el momento, han tenido más quimiotecas analizados entre 10.000 y 20.000 compuestos, algunos con tanto como 150.000 y algunos con tan sólo 70^{9,11,12,13,14, 15 , 16}. el protocolo introducido aquí se implementó en una biblioteca pequeña molécula de 50.000 compuestos (véase Tabla de materiales), uno de la genética química hacia adelante más grande pantallas realizados en Arabidopsis hasta la fecha. Este protocolo se ajusta a la tendencia actual de aumento de la eficiencia y la velocidad con respecto a la genética química hacia adelante, especialmente lo que respecta al herbicida descubrimiento, descubrimiento de insecticida, fungicida descubrir, descubrimiento y Biología del cáncer^{17 drogas ,18,19,20,21}. Aunque implementado aquí con Arabidopsis, este protocolo podría ser fácilmente adaptado a cultivos de células, las esporas y potencialmente incluso insectos en medio líquido de 96, 384 o placas 1536 pocillos. Debido a su pequeño tamaño, Arabidopsis es favorable a la proyección en 96 placas bien. Sin embargo, distribuir semillas uniformemente entre pozos es un desafío. Mano siembra es correcta pero el uso intensivo de mano de obra, y aunque existen dispositivos diseñados para dispensar las semillas en placas de 96 pocillos, son caros para comprar. Aquí, mostramos cómo puede eludirse este paso con sólo una pequeña pérdida de precisión.

El objetivo general de este método fue hacer examen una gran biblioteca química contra Arabidopsis más manejable, sin comprometer la precisión, mediante el uso de un robot para manejo de líquidos. El uso de este método mejora la eficacia del investigador al disminuir el tiempo necesario para la completa gestión de series de dilución inicial y subsecuentes pantallas fenotípicas, permitiendo una visualización rápida de muestras con un microscopio de disección y rápido identificación de nuevas moléculas bioactivas de pequeño. La figura 1 muestra los resultados clave de este protocolo en 4 pasos.

Figura 1: flujo de trabajo general de la pantalla genética química adelante. Un resumen del protocolo que se describe con algún detalle para cada uno de los 4 pasos claves. 1: recibir la biblioteca química, 2: lo que hace la biblioteca de la dilución, 3: fabricación de las placas de cribado y 4: incubación y visualizar las placas de cribado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. creación de una biblioteca de dilución

1. La etiqueta 625 placas de dilución biblioteca a mano, asegurando que coinciden con su placa correspondiente de la biblioteca de química. Además, conecte en el flujo y las mangueras de flujo para el multicanal punta lavado automatizado laboratorio posicionador (montan@A) atravesando el disco de la consola para el depósito de 5 galones (véase Tabla de materiales).
2. Acceder al ordenador y encienda la bomba de lavado a través de la conexión del controlador de dispositivo a la ALP de lavado punta de multicanal para circular el agua. Esto apagará automáticamente al final del protocolo.
3. Carga, con la mano, el apilador 10 conectado al carrusel del apilador, en el siguiente orden en hoteles A - D (figura 4, apilador); una caja de AP96 P20 pipetas en el cuarto 1, cuatro 96-Well V-placas inferiores en habitaciones de 2-5 con las dos placas superiores que contienen concentraciones comunes de la biblioteca ordenada y las dos placas inferiores vacíos (figura 5, apilador). Además, carga una caja de puntas de pipeta de P20 AP96 en sala 6 y cuatro V 96-Well-placas inferiores en habitaciones 7-9 con las dos placas superiores que contienen concentraciones comunes de la biblioteca ordenada y las dos placas inferiores vacíos (figura 5, apilador).
4. Establecer, con la mano, la cubierta con un depósito de agua de 300 mL en el P3, un baño de EtOH de 70% 300 mL en P7, punta cargador ALP (TL1) y multicanal punta lavado ALP (TW1) (cubierta,figura 4y figura 5, cubierta).
5. Utilizando el software operativo, presentamos AP96 P20 pipetas de la 10 de apilador y moverlos a la ALP de cargador de punta.
   Nota: 1.5 a través de 1.12 todos se realizan con el sistema operativo del robot; el manejo de líquidos Véase Tabla de materiales.
6. Actualmente 2 habitaciones de Hotel A y separar los cuatro V de 96 pocillos-parte inferior placas en la cubierta, colocar la parte inferior dos en P4 y P8 y los dos primeros en P5 y P9 (figura 4).
7. Carga AP96 P20 pipetas con el Punta cargador ALP en el canal 96 200 μL cabeza. 90 μl del depósito de agua de 300 mL de aspirar y dispensar en el V 96-Well-placa inferior de la dilución en P4. Repita este paso para la placa P8.
8. Mezclar la placa biblioteca química P5 repetitivamente aspirando y distribución 15 μl tres veces. Además, Aspire 10 μl de la placa de la biblioteca química de P5 y dispensar 10 μL en la placa de dilución de P4.
9. Mezclar las soluciones de la placa P4 repetitivamente aspirando y dispensar 50 μl un total de tres veces. Una vez mezclado, limpie el AP96 P20 pipetas de aspiración y dispensación 70 μl de 70% EtOH de P7, luego lavarlas en el ALP de lavado punta de multicanal por aspiración y la dispensación de un 110% del volumen de agua cuatro veces.
10. Repita los pasos 1.8-1.9 para el segundo par de placas en P8 y P9. Al crear el segundo V 96-Well-placa inferior de la dilución, pila las placas en el siguiente orden de abajo a arriba: P9, P5, P8 y P4. Luego, coloque la pila en una montan@A estático vacío; sea P1, P2, P6, P10, P11, P12 y P13.
11. Repita los pasos 1.6-1.10 hasta sala de 5 en un Hotel. Repita el paso 1.5 a llegar a la sala 6, hacia nuevo AP96 P20 pipetas de la montan@A de cargador punta y colocando las puntas de pipetas de P20 AP96 utilizado en un vacío estático ALP.
12. Repita los pasos 1.6-1.10 hasta 9 habitaciones de Hotel A es vacío. Sin embargo, con el fin de proceder a Hotel B, las placas y consejos sobre la cubierta deben ser recargados en Hotel A.
13. A mano, llene el depósito de agua de 300 mL. Este paso es crucial, y el programa de computadora puede incorporar una pausa que detalla este mensaje, que requiere que el usuario a 'continuar', antes de realizar el siguiente paso.
14. Repita los pasos 1.5 1.13 para los hoteles restantes, asegurando un depósito completo 300 mL de agua cada vez antes de proceder al siguiente hotel.

2. Añadir mezcla de semilla de los medios de comunicación a las placas de cribado

1. Hacer ½ Murashige y Skoog (MS) los medios con 0,1% Agar por la adición de 4,3 g MS Salts, 0.50 g MES, 1,0 g Agar en 1 L DI H₂O. ajustar el pH a 5.7 aunque la adición de hidróxido de potasio de 5 M vigilando con una sonda de pH.
2. Esterilizar las semillas por sacudiéndolos en 1% de lejía y SDS entre 15 y 30 min y enjuagar 4 veces con un volumen igual de agua por centrifugación. Una vez que las semillas son estériles, ponerlos a 4 ° C de 24 horas a 7 días para vernilization. El centro de recursos biológicos de Arabidopsis se describen otros métodos de esterilización, vernilization y crecimiento²².
3. Añade a los medios de comunicación a mano con una densidad de 0,1 g/100 mL. Esta densidad se traduce en un promedio de 3 a 10 semillas por pozo de una placa de 96 pocillos.
4. Lugar, a mano, cuatro plano de 96 pozos-placas de fondo en las habitaciones 1 y 2 del Hotel (Hotel A,figura 6). Poner una caja de puntas de pipeta AP96 P250 en la montan@A cargador punta, un depósito de 300 mL llena con la mezcla de semilla de los medios de comunicación creada en pasos 2.1-2.3 en P3 y un depósito de 300 mL se llena con el 70% EtOH en P7 (figura 4, la cubierta y figura 6 Cubierta).
   Nota: 2.5 a 2.8 se realizan con el software operativo.
5. Presentan habitaciones 1 y 2 en un Hotel y separar las pilas de cuatro placas. Coloque una placa en cada uno de los Alpes estático vacío (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 y P12). Carga AP96 P250 pipetas en el canal 96 200 μL cabeza.
6. 90 μl del depósito de los medios de comunicación-semilla 300 mL en el P3 de aspirar y dispensar en el primer piso de 96 pocillos-placa inferior. Repita este proceso hasta que todas las ocho placas contienen la mezcla de semilla de los medios de comunicación.
7. Limpiar las puntas de pipetas AP96 P250 por aspiración y dispensación 70 μl del depósito de 300 mL con 70% EtOH en P7. Lavar las puntas en la montan@A multicanal Tip lavar por aspiración y la dispensación de un 110% del volumen de agua cuatro veces, descargan las puntas en TL1 y recoger las placas con la mano.

3. adición de pequeñas moléculas a las placas de cribado

1. Carga a mano, una caja de puntas de pipeta AP96 P250 en habitación de Hotel 1 A, V dos de 96 pocillos-placas inferiores de la biblioteca del dilución en salas de 2, 4, 6 y 8 y dos 96 bien fondo plano proyección placas en salas de 3, 5, 7 y 9 (figura 4 Figura 7, un Hotel y apilador). Además, conecte las mangueras a y de la montan@A de lavado punta de multicanal para el depósito de 5 galones.
   Nota: 3.2 a 3.10 se realizan con el software operativo.
2. Configurar la plataforma para contener un depósito de lavado 300 mL de 70% EtOH en P7; el depósito de semilla de los medios de comunicación puede dejarse en la cubierta en P3 (figura 4, Deck y figura 7, cubierta). Además, encienda la unidad de la consola a través de conexión del controlador de dispositivo para hacer circular agua a través de la ALP de lavado punta de multicanal. Esto apagará automáticamente al final del protocolo.
3. Presentar el AP96 P250 pipeta Tip Box desde el Hotel A y a la ALP de cargador de punta.
4. Presentan el V 96-bien-las placas inferiores de la biblioteca de dilución de 2 habitaciones de Hotel A la cubierta y coloque uno sobre P4 ALP estático y sobre P8. Presentar el plano de 96 pozos-placas de proyección de fondo de sala de 3 del Hotel a la cubierta y coloque una en ALP estática P5 y P9 otra.
5. Carga AP96 P250 pipetas con el Punta cargador ALP en el canal 96 200 μL cabeza.
6. Mezclar el V 96-Well-placa inferior de la dilución en P4 aspirando y dispensar 50 μl tres veces. A continuación, aspirar 10 μl de esta placa y dispensar en el plano de 96 pozos-placa inferior de la proyección en P5.
7. Mezclar las soluciones de la placa en el P5 por aspirar y dispensar 50 μl tres veces. Limpiar las puntas de pipetas AP96 P250 con etanol por aspiración y dispensación 70 μl de 70% EtOH desde el embalse de P7 y luego lavar las puntas en el multicanal punta lavado ALP por aspiración y la dispensación de un 110% del volumen de agua cuatro veces.
8. Repita los pasos del 3.5 y 3.6 para la segunda V 96-Well-placa inferior de la biblioteca de dilución (P8) y plano de 96 pozos-placa inferior de la proyección (P9).
9. Pila los dos 96-Well V-placas de dilución biblioteca inferiores juntas y las dos placas de proyección de fondo plano de 96 pozos juntas. Hacia las placas estáticas Alpes P1 P2, P6, P10, P11, P12 y P13.
10. Repita los pasos 3.4 3.9 tres veces, añadiendo productos químicos diluidos a proyección placas un total de ocho veces. Por último, compruebe el número de semillas en cada pocillo de las placas de cribado a través de la conformación visual y complementar esos pozos con menos de tres semillas por semillas esterilizadas y vernalized adicionales.

4. incubación y la visualización de las placas de cribado

1. Incubar las placas de Screening de 96 pocillos fondo plano durante cuatro días en una cámara ambiental a 22 ° C en un ciclo de luz/oscuridad de 16/8 en un contenedor de prueba de desecación. Visualizar la placas de 96 pocillos de fondo plano de detección con un microscopio de disección. Registrar todos los fenotipos aberrantes para la posterior investigación.

Resultados

La capacidad con precisión y eficiencia caracterizan fenotipos basados en la adición de pequeñas moléculas en concentraciones debajo de un microscopio de disección de detección es el objetivo final de este método de avance genética química en Arabidopsis. Los fenotipos observados cuando todos los compuestos de 50.000 habían sido defendidos era diversos y podría ser dividido en varias clases distintas (figura 2). Figura...

Discusión

Este protocolo está diseñado para ayudar a los investigadores a lograr una pantalla adelante genética química en Arabidopsis. Proporcionamos resultados representativos desde una pantalla de 50.000 compuestos (figura 2 y figura 3), una de las más grandes pantallas adelante genética química realizada en Arabidopsis a fecha^9,13,23. El uso de un robot para manejo de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keyboard	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Mouse	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer Screen	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening Library	ChemBridge	N/A	Chemical library
Biomek Software	Beckman Coulter	N/A	Runs and designs the Biomek FX
Device Controller	Beckman Coulter	719366	Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel Pendent	Beckman Coulter	148240	Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker Carousel	Beckman Coulter	148520	Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
Biomek FX	Beckman Coulter	https://www.beckman.com/liquid-handlers	Robot that performs the desired operations
Accuframe	Artisan Technology Group	76853-4	Frames arm to place components corretly
Framing Fixture	Beckman Coulter	719415	Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALP	Beckman Coulter	719662	Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALP	Beckman Coulter	719356	Pneumatically loads tips onto the arm
Air Compressor	Local Provider	N/A	Provides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console Drive	Cole-Parmer	77200-65	Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air Hose	Local Provider	N/A	Provides air from air compressor to Tip Loader
Water Hose	Local Provider	N/A	Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP's	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Supports equipment for the Screen
5 Gallon Reserviour	Local Provider	N/A	Recirculates the dirty water from cleaning the tips
Grippers	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Grabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL Head	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Holds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette Tips	Beckman Coulter	717251	Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom Plate	Costar	9018	Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom Plate	Costar	3897	Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing Film	MedSci	F-96-100	Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bags	Local Provider	N/A	Used to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette Tips	Beckman Coulter	717254	Used in the dilution library creation
Growth Chamber	Percival	AR36L3	Germinates seeds for phenotypic visulization
Spatula	Local Provider	N/A	Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
Toothpick	Local Provider	N/A	Pushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Add to MS media mixture
MES Free Acid Monohydrate	Fisher Scientific	ICN19483580	Added to MS media to decrease pH
Agar Powder	Alfa Aesar	9002-18-0	Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOH	Sigma-Aldrich	484016	Increases pH to adequate levels
1L Media Storage Bottle	Corning	1395-1L	Holds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge Tubes	Corning	431470	Sterilizes seeds prior to vernilization
pH Probe	Davis Instruments	YX-58825-26	Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual	Beckman Coulter	PN 987836	Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide	Beckman Coulter	609862-AA	Aids in setting up the Stacker Carousel
Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual	Beckman Coulter	PN 987834	Used to frame the Multichannel Pod
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide	Beckman Coulter	PN B32335AB	Used to aid in setting up the Biomek FX
Biomek Software User's Manual	Beckman Coulter	PN 987835	Used to set up and understand the Software