Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana

Riepilogo

Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.

Abstract

Genetica chimica sempre più è stata impiegata per decodificare tratti in piante che possono essere recalcitranti alla tradizionale genetica a causa della ridondanza genica o letalità. Tuttavia, la probabilità di una piccola molecola sintetica essendo bioactive è bassa; di conseguenza, migliaia di molecole dovrà essere testati al fine di trovare quelli di interesse. Gestione robotica sistemi sono progettati per gestire un numero elevato di campioni, aumentando la velocità con cui una biblioteca chimica può essere proiettata oltre a minimizzare/standardizzazione errore di liquidi. Per ottenere una schermata di alto-rendimento avanti genetica chimica di una biblioteca di 50.000 piccole molecole su Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolli usando un liquido multicanale banco manipolazione robot sono stati sviluppati che richiedono minima coinvolgimento tecnico. Con questi protocolli, 3.271 piccole molecole sono state scoperte che ha causato alterazioni fenotipiche visibile. 1.563 composti indotto brevi radici, 1.148 composti alterate colorazione, 383 composti causati radice dei capelli e altre, non categorizzata, alterazioni e germinazione 177 composti hanno inibiti.

Introduzione

Negli ultimi 20 anni i ricercatori nel campo della biologia vegetale hanno compiuto grandi progressi utilizzando approcci di genetica chimica, sia avanti e indietro, migliorando la nostra comprensione della biosintesi della parete cellulare, il citoscheletro, la biosintesi dell'ormone e di segnalazione, gravitropismo, patogenesi, biosintesi delle purine ed endomembrane traffico^1,2,3,4,5. L'impiego di tecniche di genetica chimica in avanti permettendo l'identificazione di fenotipi di interesse e permette ai ricercatori di capire i fondamenti genotipici di particolari processi. Al contrario, genetica chimica inversa Cerca prodotti chimici che interagiscono con un pre-determinata proteina bersaglio⁶. Arabidopsis è stato all'avanguardia di queste scoperte in biologia vegetale, perché il suo genoma è piccolo, mappato e annotati. Ha un tempo di generazione breve, e sono presenti più righe di mutante/reporter disponibili per facilitare l'identificazione di macchinari subcellulare aberrante⁷.

Ci sono due principali colli di bottiglia che rallentano i progressi degli schermi genetici chimici in avanti, l'iniziale processo di screening e determinare l'obiettivo del composto di interesse⁸. Un aiuto importante nell'aumentare la velocità di selezione piccola molecola è l'uso di apparecchiatura automatizzata⁹e automazione. Robot di manipolazione dei liquidi sono un ottimo strumento per la gestione delle grandi biblioteche di piccole molecole e hanno contribuito a guidare il progresso nelle scienze biologiche¹⁰. Il protocollo qui presentato è stato progettato per alleviare il collo di bottiglia associato con il processo di screening, che consentano l'identificazione di piccole molecole bioattive a ritmo veloce. Questa tecnica riduce il carico di lavoro e il tempo per conto dell'operatore, anche diminuendo il costo economico per il ricercatore di principio.

Finora, le librerie più chimiche analizzate hanno tenuto tra 10.000 e 20.000 composti, alcuni con oltre 150.000 ed alcuni con minor come 70^{9,11,12,13,14, 15 , 16}. il protocollo introdotto nel presente documento è stato implementato su una libreria piccola molecola di 50.000 composti (Vedi Tabella materiali), uno della più grande genetica chimica avanti schermi condotti su Arabidopsis fino ad oggi. Questo protocollo si adatta con l'attuale tendenza verso una maggiore efficienza e velocità per quanto riguarda la genetica chimica in avanti, soprattutto per quanto riguarda erbicida scoperta, scoperta di insetticida, fungicida scoprire, drug discovery e biologia del cancro^{17 ,18,19,20,21}. Anche se qui implementato con Arabidopsis, questo protocollo, potrebbe facilmente essere adattato alle colture cellulari, spore e potenzialmente anche gli insetti in mezzo liquido all'interno di 96, 384- o 1536 pozzetti. Grazie alle sue piccole dimensioni, Arabidopsis è favorevole alla proiezione a 96 pozzetti. Tuttavia, distribuendo uniformemente tra pozzi è una sfida. Mano il seeding è accurata, ma ad alta intensità di manodopera, e anche se ci sono dispositivi progettati per erogare semi in piastre da 96 pozzetti, essi sono costosi da acquistare. Qui, ci mostrano come questo passaggio può essere aggirato con solo una piccola perdita in precisione.

L'obiettivo generale di questo metodo era per fare lo screening di una grande biblioteca chimica contro Arabidopsis più gestibile, senza compromettere la precisione, tramite l'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi. L'utilizzo di questo metodo migliora l'efficienza del ricercatore di diminuire il tempo necessario per completare la gestione di serie di diluizione iniziale e schermate successive fenotipiche, consentendo una visualizzazione rapida dei campioni sotto un microscopio per dissezione e rapida identificazione di nuove piccole molecole bioattive. Figura 1 illustra i risultati chiave di questo protocollo in 4 passi.

Figura 1: flusso di lavoro complessivo dello schermo in avanti genetica chimica. Una panoramica del protocollo per essere descritto con qualche dettaglio per ciascuno dei 4 passaggi chiave. 1: ricevendo la biblioteca chimica, 2: rendere la libreria di diluizione, 3: rendendo le piastre di Screening e 4: incubazione e visualizzare le piastre di Screening. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. creazione di una libreria di diluizione

1. Etichetta 625 piastre di diluizione biblioteca a mano, garantendo che essi corrispondono alla loro piastra corrispondente dalla biblioteca chimica. Inoltre, connettersi in flusso e out tubi di flusso per il multicanale suggerimento lavaggio automatizzato Labware posizionatore (ALP) passando attraverso l'unità di Console per il serbatoio da 5 galloni (Vedi Tabella materiali).
2. Accedere al computer e accendere la pompa di lavaggio attraverso la connessione del Controller del dispositivo per il multicanale suggerimento Wash ALP al fine di far circolare l'acqua. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.
3. Carico, a mano, il 10 di Stacker fissato al carosello Stacker, nel seguente ordine in Alberghi A - D (Figura 4, Stacker); una scatola di AP96 P20 puntali in camera 1, quattro V 96 pozzetti-piastre di fondo in camere a 2-5 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio dalla libreria di ordinato e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore). Inoltre, caricare una scatola di AP96 P20 puntali in camera 6 e quattro 96 pozzetti V-piastre inferiori nelle camere: 7-9 con le due piastre superiore contenenti concentrazioni d'archivio della biblioteca ordinata e le due piastre inferiore vuoto (Figura 5, impilatore).
4. Istituire, a mano, il ponte con un serbatoio di acqua 300 mL su P3, un 300 mL 70% EtOH bagno il P7, suggerimento Loader ALP (TL1) e multicanale suggerimento Wash ALP (TW1) (Figura 4, Deck e Figura 5, ponte).
5. Utilizzando il software operativo, presentare AP96 P20 puntali da 10 Stacker e spostarli all'Alpe Loader Tip.
   Nota: 1.5 tramite 1.12 tutte sono fatte con il liquido gestione software operativo del robot; Vedi Tabella materiali.
6. Presentiamo 2 camera da Hotel A e separare tutti i quattro 96 pozzetti V-fondo piastre sul ponte, mettendo sul fondo due su P4 e P8 e le prime due su P5 e P9 (Figura 4).
7. Caricare AP96 P20 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l. 90 µ l del serbatoio di acqua di 300 mL di aspirare e dispensare al v 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4. Ripetere questo passaggio per la piastra su P8.
8. Mescolare la piastra libreria chimica su P5 ripetutamente aspirazione e il dosaggio 15 µ l tre volte. Inoltre, aspirare 10 µ l dalla cassa della libreria chimica su P5 e Pipettare 10 µ l nella piastra diluizione su P4.
9. Mescolare le soluzioni della piastra sul P4 da ripetutamente aspirazione e il dosaggio 50 µ l di un totale di tre volte. Una volta miscelato, pulire le punte di pipetta P20 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH da P7, poi lavarli in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.
10. Ripetere i passaggi da 1.8-1.9 per la seconda coppia di piastre su P8 e P9. Al momento di creare il secondo V 96-Well-piastra inferiore diluizione, stack le piastre nel seguente ordine dal basso verso l'alto: P4, P5, P8 e P9. Quindi, posizionare la risma un vuoto statico ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.
11. Ripetere i passaggi 1.6-1.10 5 camera in Hotel A è vuoto. Ripetere il passaggio 1.5 su raggiungendo la camera 6, spostando nuovo AP96 P20 puntali all'Alpe Loader Tip e mettendo i puntali per pipette usate AP96 P20 su un vuoto statico ALP.
12. Ripetere i passaggi 1.6-1.10 9 camera di Hotel A è vuoto. Tuttavia, al fine di procedere all'Hotel B, le piastre e suggerimenti sul ponte devono essere ricaricati in a Hotel.
13. A mano, ri-riempire il serbatoio di acqua di 300 mL. Questo passaggio è cruciale, e il programma del computer può incorporare una pausa dettagliare questo messaggio, che richiede l'utente a premere 'continua', prima di eseguire il passaggio successivo.
14. Ripetere i passaggi da 1.5-1.13 per i rimanenti Hotel, garantendo un serbatoio dell'acqua pieno 300 mL ogni volta prima di procedere all'hotel successivo.

2. aggiunta di miscela di Media-semi per piastre di Screening

1. Fare ½ Murashige e Skoog (MS) Media con 0,1% Agar con l'aggiunta di 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar a 1 L DI H₂O. regolare il pH a 5.7 però l'aggiunta di 5 M di idrossido di potassio durante il monitoraggio con una sonda di pH.
2. Sterilizzare i semi agitando in 1% candeggina e SDS tra 15 e 30 min e poi lavare 4 volte con un volume uguale di acqua mediante centrifugazione. Una volta che i semi sono sterili, metterli a 4 ° C da 24 ore a 7 giorni per vernilization. Il centro di risorse biologiche di Arabidopsis descrive ulteriori metodi di sterilizzazione, vernilization e crescita²².
3. Aggiungere i semi ai media a mano ad una densità di 0,1 g/100 mL. Questa densità si traduce in una media di 3-10 semi per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
4. Luogo, a mano, quattro 96 pozzetti piatto-piastre di fondo in camere 1 e 2 di Hotel A (Figura 6, A Hotel). Inserire una casella di AP96 P250 puntali sull'Alpe Loader Tip, un serbatoio 300ml riempito con la miscela di semi di media creata nei passaggi da 2.1-2.3 in P3 e un serbatoio 300 mL riempita con 70% EtOH sul P7 (Figura 4, Deck e Figura 6 Ponte).
   Nota: 2.5 tramite 2.8 sono fatto con il software operativo.
5. Presentare le camere 1 e 2 in Hotel A e separare le pile di quattro piastre. Posizionare una piastra su ciascuna delle Alpi vuoto statico (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 e P12). Caricare AP96 P250 puntali sulla testa con 96 canali a 200 µ l.
6. 90 µ l dal serbatoio 300ml media-seme su P3 di aspirare e dispensare nel primo appartamento di 96 pozzetti-piastra inferiore. Ripetere questo processo fino a quando tutte le otto tavole contengono la miscela di semi di media.
7. Pulizia delle punte di pipetta P250 AP96 di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l dal serbatoio 300 mL riempito con 70% EtOH sul P7. Lavare le punte in multicanale suggerimento lavare Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte, scaricare le punte presso TL1 e raccogliere i piatti a mano.

3. aggiunta di piccole molecole per piastre di Screening

1. Carico, a mano, una scatola di AP96 P250 puntali in 1 camera di Hotel A, due V 96 pozzetti-piastre inferiori del libreria di diluizione in camere da 2, 4, 6 e 8 e due 96 ben piatto-Screening piastre inferiori in camere 3, 5, 7 e 9 (Figura 4 Fascicolatore e Figura 7, un Hotel). Inoltre, collegare i tubi flessibili da e verso l'Alpe di Wash suggerimento multicanale per il serbatoio da 5 galloni.
   Nota: 3.2 al 3.10 sono fatto con il software operativo.
2. Configurare il mazzo per contenere un serbatoio di lavaggio 300 mL 70% EtOH presso P7; il serbatoio di media-seme può essere lasciato sul ponte a P3 (Figura 4, Deck e Figura 7, ponte). Inoltre, accendere l'unità di Console tramite connessione del dispositivo Controller per far circolare l'acqua attraverso l'Alpe Wash suggerimento multicanale. Questo si spegne automaticamente alla fine del protocollo.
3. Presentiamo la scatola di Tip pipetta AP96 P250 da Hotel A e spostarlo all'Alpe Loader Tip.
4. Presentare il V 96 pozzetti-piastre di diluizione biblioteca inferiori da 2 camera di Hotel al ponte e posto uno statico ALP P4 e uno su P8. Presentare il piatto di 96 pozzetti-piastre di Screening di fondo da camera 3 di Hotel al ponte e posizionare uno statico ALP P5 e uno su P9.
5. Caricare AP96 P250 puntali con il caricatore di punta ALP sulla testa con 96 canali a 200 µ l.
6. Mescolare il V 96-Well-piastra di diluizione inferiore su P4 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. In seguito, aspirare 10 µ l da questo piatto e versare nel piatto 96-Well-piastra di Screening inferiore su P5.
7. Mescolare le soluzioni nella piastra a P5 di aspirazione e il dosaggio 50 µ l tre volte. Pulire le punte di pipetta AP96 P250 con etanolo di aspirazione e il dosaggio di 70 µ l di 70% EtOH dal serbatoio a P7 e poi lavare i suggerimenti in multicanale suggerimento Wash Alpe di aspirazione e il dosaggio di un 110% del volume di acqua quattro volte.
8. Ripetere i passaggi da 3.5 e 3.6 per il secondo V 96-Well-piastra di fondo diluizione biblioteca (P8) e 96 pozzetti piatto-piastra inferiore Screening (P9).
9. Stack due 96 pozzetti V-piastre di diluizione biblioteca inferiori insieme e le due piastre di fondo Screening 96 pozzetti piatto insieme. Spostare le piastre statico Alpi P1, P2, P6, P10, P11, P12 o P13.
10. Ripetere i passaggi da 3.4-3.9 tre volte, l'aggiunta di prodotti chimici diluiti allo screening piatti un totale di otto volte. Infine, controllare il numero di semi in ciascun pozzetto delle piastre di screening attraverso visual conformazione e integrare tali pozzetti con meno di tre semi per ulteriori seme vernalizzato e sterilizzato.

4. incubazione e visualizzazione delle piastre di Screening

1. Incubare le piastre a 96 pozzetti a fondo piatto di Screening per quattro giorni in una camera climatica a 22 ° C su un ciclo luce/buio di 16/8 in un contenitore di prova di essiccazione. Visualizzare le piastre da 96 pozzetti a fondo piatto Vagli sotto un microscopio per dissezione. Registrare tutti i fenotipi aberranti per ulteriori indagini.

Risultati

La capacità di esattamente ed efficientemente caratterizzare fenotipi basati sull'aggiunta di piccole molecole alle concentrazioni sotto un microscopio per dissezione di screening è l'obiettivo finale di questo metodo di inoltro genetica chimica su Arabidopsis. I fenotipi osservati quando tutti i 50.000 composti erano stati proiettati era vari e può essere suddiviso in diverse classi distinte (Figura 2). Figura 3A

Discussione

Questo protocollo è progettato per aiutare i ricercatori nella realizzazione di uno schermo in avanti genetica chimica su Arabidopsis. Forniamo risultati rappresentativi da uno schermo di 50.000 composti (Figura 2 e Figura 3), uno dei più grandi schermi avanti genetica chimica eseguita su Arabidopsis ad oggi^9,13,23. L'utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keyboard	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Mouse	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer Screen	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening Library	ChemBridge	N/A	Chemical library
Biomek Software	Beckman Coulter	N/A	Runs and designs the Biomek FX
Device Controller	Beckman Coulter	719366	Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel Pendent	Beckman Coulter	148240	Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker Carousel	Beckman Coulter	148520	Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
Biomek FX	Beckman Coulter	https://www.beckman.com/liquid-handlers	Robot that performs the desired operations
Accuframe	Artisan Technology Group	76853-4	Frames arm to place components corretly
Framing Fixture	Beckman Coulter	719415	Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALP	Beckman Coulter	719662	Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALP	Beckman Coulter	719356	Pneumatically loads tips onto the arm
Air Compressor	Local Provider	N/A	Provides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console Drive	Cole-Parmer	77200-65	Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air Hose	Local Provider	N/A	Provides air from air compressor to Tip Loader
Water Hose	Local Provider	N/A	Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP's	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Supports equipment for the Screen
5 Gallon Reserviour	Local Provider	N/A	Recirculates the dirty water from cleaning the tips
Grippers	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Grabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL Head	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Holds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette Tips	Beckman Coulter	717251	Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom Plate	Costar	9018	Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom Plate	Costar	3897	Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing Film	MedSci	F-96-100	Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bags	Local Provider	N/A	Used to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette Tips	Beckman Coulter	717254	Used in the dilution library creation
Growth Chamber	Percival	AR36L3	Germinates seeds for phenotypic visulization
Spatula	Local Provider	N/A	Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
Toothpick	Local Provider	N/A	Pushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Add to MS media mixture
MES Free Acid Monohydrate	Fisher Scientific	ICN19483580	Added to MS media to decrease pH
Agar Powder	Alfa Aesar	9002-18-0	Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOH	Sigma-Aldrich	484016	Increases pH to adequate levels
1L Media Storage Bottle	Corning	1395-1L	Holds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge Tubes	Corning	431470	Sterilizes seeds prior to vernilization
pH Probe	Davis Instruments	YX-58825-26	Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual	Beckman Coulter	PN 987836	Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide	Beckman Coulter	609862-AA	Aids in setting up the Stacker Carousel
Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual	Beckman Coulter	PN 987834	Used to frame the Multichannel Pod
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide	Beckman Coulter	PN B32335AB	Used to aid in setting up the Biomek FX
Biomek Software User's Manual	Beckman Coulter	PN 987835	Used to set up and understand the Software