Otimizando o uso de um robô de manipulação líquidos para conduzir a uma alta taxa de transferência para a frente química genética tela de Arabidopsis thaliana

Resumo

Realizou-se uma tela de alta taxa de transferência de moléculas pequenas sintéticas sobre espécies a planta modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desenvolvido para um robô de manipulação de líquidos, aumenta a velocidade das telas de genética de química para a frente, acelerando a descoberta de novas moléculas pequenas, que afetam a fisiologia vegetal.

Resumo

Química genética é cada vez mais sendo empregada para decodificar traços nas plantas que podem ser recalcitrantes à genética tradicional devido à redundância de gene ou letalidade. No entanto, a probabilidade de uma pequena molécula sintética, sendo bioativos é baixa; Portanto, milhares de moléculas devem ser testados a fim de encontrar aqueles de interesse. Robótica, sistemas são projetados para lidar com um grande número de amostras, aumentando a velocidade com que uma biblioteca de química pode ser rastreada além de minimizar/padronização erro de manuseio de líquidos. Para obter uma tela de alta produtividade para a frente química genética de uma biblioteca de 50.000 moléculas pequenas em Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolos usando um líquido de multicanal de bancada manipulação robô foram desenvolvidos que exigem mínima envolvimento de técnico. Com estes protocolos, 3.271 pequenas moléculas foram descobertas que causou alterações fenotípicas visíveis. 1.563 compostos induziram raízes curtas, coloração 1.148 compostos alterados, 383 compostos causados raiz do cabelo e outras, não-Categorizado, alterações e germinação de 177 compostos inibidas.

Introdução

Nos últimos 20 anos pesquisadores no campo da biologia vegetal tem feito grandes progressos usando abordagens química genética, tanto para diante e reversos, melhorando nossa compreensão da biossíntese da parede celular, o citoesqueleto, a biossíntese do hormônio e sinalização, geotropismo, patogênese, biossíntese de purinas e endomembranoso tráfico^1,2,3,4,5. Empregando técnicas de genética para a frente de química permite a identificação de fenótipos de interesse e permite que os pesquisadores a entender os fundamentos genotípicos de processos particulares. Por outro lado, genética química inversa procura produtos químicos que interagem com uma proteína pré-determinado alvo⁶. Arabidopsis tem sido na vanguarda destas descobertas em biologia vegetal, porque o seu genoma é pequena, mapeado e anotado. Tem um tempo de geração curto, e existem várias linhas de mutante/repórter disponíveis para facilitar a identificação de máquinas subcellular aberrante⁷.

Existem dois grandes estrangulamentos que retardar o progresso da frente químicas genéticas telas, inicial processo de triagem e determinar o destino do composto de interesse⁸. Uma grande ajuda no aumento da velocidade de seleção pequena molécula é o uso de automação e equipamentos automatizados⁹. Robôs de manipulação de líquido são uma excelente ferramenta para a manipulação de grandes bibliotecas de moléculas pequenas e têm sido fundamentais para dirigir o progresso da ciências biológicas¹⁰. O protocolo aqui apresentado é projetado para aliviar o gargalo associado com o processo de seleção, permitindo a identificação de moléculas bioativas de pequenas em uma taxa rápida. Esta técnica diminui a carga de trabalho e tempo em nome do operador, enquanto também, diminuindo o custo econômico para o investigador de princípio.

Até então, bibliotecas mais químicas analisadas realizaram entre 10.000 e 20.000 compostos, alguns com até 150.000 e alguns com tão poucos como 70^{9,11,12,13,14, 15 , 16}. o protocolo apresentado neste documento foi implementado em uma biblioteca pequena molécula de 50.000 compostos (ver Tabela de materiais), um dos maiores genética química frente ecrãs conduzidos em Arabidopsis até à data. Este protocolo se encaixa com a atual tendência para aumentar a eficiência e velocidade sobre genética de química para a frente, especialmente no que tange a descoberta de herbicida, descoberta de inseticida, fungicida descubra, droga descoberta e a biologia do câncer^{17 ,18,19,20,21}. Embora implementado aqui com Arabidopsis, este protocolo, poderia ser facilmente adaptadas às culturas de células, esporos e potencialmente até insetos em meio líquido, dentro de 96, 384- ou placas boas 1536. Devido ao seu pequeno tamanho, Arabidopsis é passível de triagem em 96 placas bem. No entanto, distribuir sementes uniformemente entre poços é um desafio. Semeadura de mão é preciso mas mão de obra intensiva, e embora existam dispositivos projetados para dispensar as sementes em placas de 96 poços, eles são caros para comprar. Aqui, nós mostramos como este passo pode ser contornado com apenas uma pequena perda de precisão.

O objetivo geral deste método era fazer a triagem de uma grande biblioteca de química contra Arabidopsis mais gerenciável, sem comprometer a precisão, através do uso de um robô de manipulação de líquidos. O uso desse método melhora a eficiência do pesquisador, diminuindo o tempo levado para completar a gestão de séries de diluição inicial e subsequentes telas fenotípicas, permitindo a visualização rápida de amostras sob um microscópio de dissecação e rápida identificação de novas moléculas pequenas bioativas. A Figura 1 mostra os resultados-chave do presente protocolo em 4 passos.

Figura 1: fluxo de trabalho geral da tela frente química genética. Uma visão geral do protocolo a ser descrito com algum detalhe para cada uma das 4 principais etapas. 1: receber a biblioteca química, 2: fazendo a biblioteca de diluição, 3: fazendo as placas de triagem e 4: incubar e visualizando as placas de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. criação de uma biblioteca de diluição

1. Rotule 625 placas de diluição biblioteca à mão, garantindo que eles correspondem à sua placa correspondente da biblioteca de química. Além disso, conectar-se no fluxo e mangueiras de fluxo para o multicanal dica lavagem automatizada Labware posicionador (ALP), passando-os através da unidade de Console para o reservatório de 5 galões (ver Tabela de materiais).
2. Acessar o computador e ligue a bomba de lavagem através da conexão do controlador de dispositivo para o ALP lavagem dica multicanal para circular a água. Isto desliga-se automaticamente no final do protocolo.
3. Carga, à mão, o empilhador 10 anexado para o carrossel de empilhador, na seguinte ordem Hotéis A - D (Figura 4, empilhador); uma caixa de pontas de pipetas de P20 AP96 na sala 1, quatro V 96 poços-placas de fundo em quartos de 2-5 com as duas placas superiores contendo concentrações estoque da biblioteca ordenada e as duas placas inferiores vazios (Figura 5, empilhador). Além disso, carregar uma caixa de pontas de pipetas de P20 AP96 no quarto 6 e quatro V 96 poços-placas de fundo nas salas 7-9 com as duas placas superiores contendo concentrações estoque da biblioteca ordenada e as duas placas inferiores vazios (Figura 5, empilhador).
4. Definir, com a mão, o deck com um reservatório de água de 300 mL na P3, um banho de EtOH 70% 300 mL na P7, dica Loader ALP (TL1) e multicanal dica lavagem ALP (TW1) (Figura 4, Deck e Figura 5, Deck).
5. Usando o software operacional, apresentar pontas de pipetas de P20 AP96 do 10 de empilhador e movê-los para o ALP carregador de ponta.
   Nota: 1.5 através de 1.12 todos são feitos com o líquido manipulação software operacional do robô; consulte Tabela de materiais.
6. Apresentar 2 quarto de Hotel A e separar todos os quatro 96 poços V-fundo placas no convés, colocando a parte inferior dois P4 e P8 e os dois primeiros em P5 e P9 (Figura 4).
7. Carrega AP96 P20, pontas de pipeta com o carregador de ponta ALP para a cabeça do 96-canal 200 µ l. Aspire 90 µ l do reservatório de água de 300 mL e dispense na V 96 poços-placa de diluição inferior em P4. Repita essa etapa para a placa na P8.
8. Misture a placa biblioteca química na P5 por repetidamente por aspiração e dispensação 15 µ l três vezes. Além disso, o Aspire 10 µ l da placa de biblioteca química na P5 e dispense 10 µ l em chapa de diluição P4.
9. Misture as soluções da placa em P4 por repetidamente por aspiração e dispensação 50 µ l, um total de três vezes. Uma vez misturado, limpe as pontas de pipetas de P20 AP96 por aspiração e dispensação 70 µ l de 70% EtOH da P7, então lavá-los no multicanal dica ALP de lavagem por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes.
10. Repita as etapas 1.8-1.9 para o segundo par de placas na P8 e P9. Após criar o segundo V 96 poços-placa de diluição inferior, pilha os pratos na seguinte ordem de baixo para cima: P4, P5, P8 e P9. Em seguida, coloque a pilha em um vazio estático ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 ou P13.
11. Repita as etapas de 1.6-1.10 até 5 quarto em Hotel A esvaziar. Repita a etapa 1.5 atingindo o quarto 6, movendo-se pontas de pipetas de P20 AP96 novo para o ALP Loader dica e colocando as pontas de pipetas de P20 AP96 usado em um vazio estático ALP.
12. Repita as etapas de 1.6-1.10 até 9 quarto de Hotel A esvaziar. No entanto, para poderem passar ao Hotel B, as placas e dicas sobre o pavimento devem ser recarregadas no Hotel A.
13. Voltar a encher, com a mão, o reservatório de água de 300 mL. Esta etapa é crucial, e o programa de computador pode incorporar uma pausa detalhando esta mensagem, exigir que o usuário atingiu 'continue', antes de efectuar o próximo passo.
14. Repita as etapas 1.5-1.13 para os restantes Hotéis, assegurando um reservatório de água cheio de 300 mL cada vez antes de prosseguir para o próximo hotel.

2. adicionando a mistura de sementes de mídia para placas de triagem

1. Fazer ½ Murashige e Skoog (MS) Media com 0,1% ágar pela adição de 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g de ágar para 1 L DI H₂O. ajustar o pH a 5.7 embora a adição de hidróxido de potássio 5m enquanto monitora com uma sonda de pH.
2. Esterilizar as sementes agitando-los em 1% de alvejante e SDS entre 15 e 30 min e depois enxaguar 4 vezes com igual volume de água por centrifugação. Uma vez que as sementes são estéreis, colocá-los em 4 ° C de 24 horas a 7 dias para vernilization. Centro de recursos biológicos de Arabidopsis descreve métodos adicionais de esterilização, vernilization e crescimento²².
3. Adicione sementes a media com a mão em uma densidade de 0,1 g/100 mL. Esta densidade resulta em uma média de 3-10 sementes por alvéolo de uma placa de 96 poços.
4. Lugar, à mão, quatro televisões de 96 poços-placas de fundo nas salas 1 e 2 do Hotel A (Figura 6, A do Hotel). Coloque uma caixa de pontas de pipetas P250 AP96 sobre a dica Loader ALP, um reservatório de 300 mL preenchida com a mistura de sementes de mídia criada em passos 2.1-2.3 no P3, e um reservatório de 300 mL preenchidos com 70% EtOH no P7 (Figura 4, Deck e Figura 6 Baralho).
   Nota: 2.5 através de 2.8 são feitas com o software operacional.
5. Apresentar salas 1 e 2 num Hotel e separar as pilhas de quatro pratos. Coloque uma placa em cada um dos Alpes vazio estático (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 e P12). Carrega AP96 pontas de pipetas P250 na cabeça 96-canal 200 µ l.
6. Aspire 90 µ l do reservatório de mídia-semente de 300ml na P3 e dispensar o primeiro flat de 96 poços-placa inferior. Repita este processo até que todos os oito placas contêm a mistura de sementes de mídia.
7. Limpe as pontas de pipeta P250 AP96 por aspiração e dispensação 70 µ l do reservatório de 300 mL, preenchido com 70% EtOH no P7. Lave as dicas no multicanal dica lavar ALP por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes, descarregar as gorjetas no TL1 e recolher os pratos à mão.

3. a adição de pequenas moléculas para placas de triagem

1. Carga, à mão, uma caixa de pontas de pipetas AP96 P250 na sala 1 do Hotel A, dois V 96 poços-placas de biblioteca de diluição inferior em quartos de 2, 4, 6 e 8 e 2 96 bem fundo plano de triagem placas em quartos de 3, 5, 7 e 9 (Figura 4 Empilhador e Figura 7, um Hotel). Além disso, conecte as mangueiras de e para o ALP multicanal dica lavagem para o reservatório de 5 galões.
   Nota: 3.2 através de 3.10 são feitas com o software operacional.
2. Configurar o convés para conter um reservatório de lavagem 300 mL 70% EtOH no P7; o reservatório de mídia-semente pode ser deixado no chão, aos P3 (Figura 4, Deck e Figura 7, Deck). Além disso, ligue a unidade de Console através da conexão do controlador de dispositivo para circular a água através do multicanal dica lavagem ALP. Isto desliga-se automaticamente no final do protocolo.
3. Apresentar a AP96 P250 pipeta dica caixa do Hotel A e movê-lo para o ALP carregador de ponta.
4. Apresentar o V 96 poços-fundo biblioteca diluição placas de 2 quarto de Hotel A para o convés e coloque um na P4 ALP estático e um na P8. Apresentar o plano de 96 poços-placas de triagem de fundo de quarto 3 do Hotel a plataforma e coloque uma em ALP estático P5 e outra na P9.
5. Carrega AP96 P250, pontas de pipeta com o carregador de ponta ALP para a cabeça do 96-canal 200 µ l.
6. Misture o V 96 poços-placa de diluição inferior em P4 por aspiração e dispensação 50 µ l de três vezes. Em seguida, Aspire 10 µ l desta placa e dispensar para o apartamento de 96 poços-placa de rastreio inferior na P5.
7. Misture as soluções na placa na P5 por aspiração e dispensação 50 µ l de três vezes. Limpe as pontas de pipeta P250 AP96 com etanol por aspiração e dispensação 70 µ l de 70% EtOH do reservatório no P7 e depois lavar as dicas no ALP multicanal dica lavagem por aspiração e dispensação de um volume de 110% de água quatro vezes.
8. Repita as etapas de 3.5 e 3.6, para o segundo V 96 poços-placa de biblioteca de diluição inferior (P8) e 96 poços Flat-placa inferior de triagem (P9).
9. Pilha os dois 96 poços V-fundo biblioteca diluição placas juntas e as placas de triagem de fundo liso 96 poços dois juntas. Mova as placas para estático Alpes P1 P2, P6, P10, P11, P12 e P13.
10. Repita os passos três vezes 3.4-3.9, Adicionar produtos químicos diluídos para triagem chapas um total de oito vezes. Finalmente, verifique o número de sementes em cada poço das placas de triagem através de conformação visual e completar os poços com menos de três sementes por semente esterilizada e vernalized adicionais.

4. incubação e visualização das placas de triagem

1. Incube as placas de triagem de fundo plano de 96 poços para quatro dias em uma câmara ambiental a 22 ° C em um ciclo claro/escuro de 16/8 em um recipiente à prova de dessecação. Visualize as placas de triagem 96 poços fundo plano sob um microscópio de dissecação. Grave todos os fenótipos aberrantes para maiores investigações.

Resultados

A capacidade de precisão e eficiência caracterizam fenótipos baseados a adição de pequenas moléculas em concentrações sob um microscópio dissecação de triagem é o objetivo final deste método de frente química genética em Arabidopsis. Os fenótipos observados quando todos os 50.000 compostos tinham sido selecionados era diversos e pode ser dividida em várias classes distintas (Figura 2). Figura 3A ...

Discussão

Este protocolo é projetado para ajudar os pesquisadores a conseguir uma tela frente química genética em Arabidopsis. Nós fornecemos resultados representativos de uma tela de 50.000 compostos (Figura 2 e Figura 3), uma das maiores telas frente química genética realizada em Arabidopsis até à data de^13,9,23. O uso de um robô de manipulação líquido habilitado ma...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keyboard	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Mouse	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer Screen	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
Computer	Local Provider	N/A	Used for protocol design and operating the Biomek FX
DIVERSet Diverse Screening Library	ChemBridge	N/A	Chemical library
Biomek Software	Beckman Coulter	N/A	Runs and designs the Biomek FX
Device Controller	Beckman Coulter	719366	Operates the water pump/tip washing station
Stacker Carousel Pendent	Beckman Coulter	148240	Manual operation of Biomek Stacker Carousel
Biomek Stacker Carousel	Beckman Coulter	148520	Rotary unit that houses all FX Stacker 10's
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
FX Stacker 10	Beckman Coulter	148522	Elevator unit that houses components for screen
Biomek FX	Beckman Coulter	https://www.beckman.com/liquid-handlers	Robot that performs the desired operations
Accuframe	Artisan Technology Group	76853-4	Frames arm to place components corretly
Framing Fixture	Beckman Coulter	719415	Centers arm in the Accuframe
Multichannel Tip Wash ALP	Beckman Coulter	719662	Washes the tips after the ethanol bath
Tip Loader ALP	Beckman Coulter	719356	Pneumatically loads tips onto the arm
Air Compressor	Local Provider	N/A	Provides air for pneumatic tip loading
MasterFlex Console Drive	Cole-Parmer	77200-65	Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer
Air Hose	Local Provider	N/A	Provides air from air compressor to Tip Loader
Water Hose	Local Provider	N/A	Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer
Static ALP's	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Supports equipment for the Screen
5 Gallon Reserviour	Local Provider	N/A	Recirculates the dirty water from cleaning the tips
Grippers	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Grabs and moves the equipment to the correct places
96-Channel 200 µL Head	Beckman Coulter	Comes with Biomek FX	Holds the 96 tips used within the screen
AP96 P200 Pipette Tips	Beckman Coulter	717251	Used to make the screening library
96 Well Flat Bottom Plate	Costar	9018	Aids in visulization of screen
96 Well V-Bottom Plate	Costar	3897	Aids in storing of dilution library
AlumaSeal 96 Sealing Film	MedSci	F-96-100	Seals for storage both the chemicle library and dilution library
Plastic ziplock sandwich bags	Local Provider	N/A	Used to ensure a humid environment for screen
AP96 P20 Pipette Tips	Beckman Coulter	717254	Used in the dilution library creation
Growth Chamber	Percival	AR36L3	Germinates seeds for phenotypic visulization
Spatula	Local Provider	N/A	Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly
Toothpick	Local Provider	N/A	Pushes seeds from spatula to wells
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Add to MS media mixture
MES Free Acid Monohydrate	Fisher Scientific	ICN19483580	Added to MS media to decrease pH
Agar Powder	Alfa Aesar	9002-18-0	Increases thickness of media to support seed suspension
5M KOH	Sigma-Aldrich	484016	Increases pH to adequate levels
1L Media Storage Bottle	Corning	1395-1L	Holds enough media for a screen
Polypropylene Centrifuge Tubes	Corning	431470	Sterilizes seeds prior to vernilization
pH Probe	Davis Instruments	YX-58825-26	Used for making media
ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual	Beckman Coulter	PN 987836	Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX
Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide	Beckman Coulter	609862-AA	Aids in setting up the Stacker Carousel
Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual	Beckman Coulter	PN 987834	Used to frame the Multichannel Pod
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide	Beckman Coulter	PN B32335AB	Used to aid in setting up the Biomek FX
Biomek Software User's Manual	Beckman Coulter	PN 987835	Used to set up and understand the Software