Aislamiento de células endoteliales humanas de Colon Normal y el Carcinoma colorrectal - un protocolo mejorado

Resumen

Las células endoteliales tumorales son determinantes importantes del microambiente tumoral y el curso de la enfermedad. Aquí, se describe un protocolo para el aislamiento de las células endoteliales puras y viables de carcinoma colorrectal humano y colon normal para ser utilizado en la investigación de drogas pruebas y patogenesia.

Resumen

Células primarias aisladas de carcinomas humanos son herramientas valiosas para identificar los mecanismos patogénicos que contribuyen a la progresión y desarrollo de la enfermedad. En particular, las células endoteliales (CE) que constituyen la superficie interna de los vasos, directamente participar en la entrega de oxígeno, fuente nutriente y la eliminación de residuos a y de tumores y participan así un lugar prominente en la Constitución del tumor microambiente (TME). Las células endoteliales del tumor (TECs) se pueden utilizar como biosensores celulares del microambiente intratumoral establecido por la comunicación entre el tumor y las células del estroma. TECs también sirven como objetivos de la terapia. Por consiguiente, en la cultura estas células permiten estudios sobre mecanismos de respuesta o resistencia al tratamiento anti-angiogénico. Recientemente, se encontró que Spark aislada de carcinoma colorrectal humano (CRC) exposición memoria efectos basados en el TME específica que se derivan. Por otra parte, estas TECs contribuyan activamente a la creación de una específica TME por la secreción de diversos factores. Por ejemplo, TECs en un pronóstico favorable TME de Th1 secretan la proteína de tumor-supresor factor secretado de anti-angiogénicos, ácida y rica en cisteína como 1 (SPARCL1). SPARCL1 regula la homeostasis del recipiente e inhibe la migración y proliferación de células de tumor. Por lo tanto, las culturas de TECs puros, viables aislados de tumores sólidos humanos son una herramienta valiosa para estudios funcionales sobre el papel del sistema vascular en tumorigenesis. Aquí, se describe un nuevo protocolo actualizado para el aislamiento de primaria CE del colon normal así como CRC. La técnica se basa en la digestión mecánica y enzimática de los tejidos, inmunomarcación y célula de fluorescencia activada (FACS) de clasificación-clasificación de las células triple-positivas (CD31, VE-cadherina, CD105). Con este protocolo, TEC viable o cultivos de células endoteliales normales (NEC) podrían ser aislados de los tejidos del colon con una tasa de éxito de 62.12% cuando se someten a la clasificación de FACS (cultivos EC puros 41 de 66 muestras de tejido). Por consiguiente, este protocolo proporciona un enfoque robusto para aislar las culturas humanas de la EC de colon normal y el CRC.

Introducción

El microambiente del tumor (TME) se define como una interacción de las células tumorales con el estroma del tumor, que consta de células como las células endoteliales (CE), pericitos, fibroblastos, células musculares lisas o las células inmunes. La comunicación entre estos compartimentos celulares se puede conducir por factores paracrinos (p. ej., factores de crecimiento angiogénicos, citoquinas), por la matriz extracelular, o contacto directo célula-célula. El compartimiento stromal puede fomentar o contrarrestar la iniciación tumoral o progresión, dependiendo de la TME específico establecido.

La capacidad de un tumor para conectar con el sistema de recipiente es clave para la progresión y la metástasis de la enfermedad. El sistema de vaso permite el tumor predominante acceder a la entrega de oxígeno y nutrientes, así como la eliminación de residuos^1,2,3. CE constituyen la superficie interna de los vasos y por lo tanto son importantes componentes celulares que participan activamente en este proceso. Es bien sabido que las células endoteliales del tumor (TEC) son diferentes a sus células endoteliales normales correspondientes (NEC) por muchas características como perturbado jerarquía del árbol vascular, filtración de buque, o reducción maduración ejemplificado por un número reducido de células del pericitos/mural conectados solamente libremente a la CE⁴.

Por lo tanto, TECs son valiosas herramientas celulares para el estudio de la carcinogénesis. TECs eran considerados sobre todo para fomentar el crecimiento y la progresión de tumor³. De este modo, Spark puede utilizarse como biosensores que permiten el seguimiento y la identificación de procesos patogénicos que iniciar, fomentar o contrarrestar la tumorigénesis. Por otra parte, son dianas terapéuticas en la clínica⁵. En consecuencia, TECs aislados y CNE correspondiente puede usarse como herramientas para entender los mecanismos de respuesta o resistencia al tratamiento anti-angiogénico.

En el pasado, se desarrolló un protocolo para aislar estas células^6,7 y se identificaron TECs no sólo son diferentes de la CNE, que también difieren entre sí dependiendo de lo TME que se derivaron de⁸. A través de este enfoque, fue demostrado que TECs en ciertos TMEs pueden contrarrestar activamente el crecimiento del tumor y la progresión por la secreción de proteínas tumor-supresor anti-angiogénicos como SPARCL1. Esto indica que TECs están contribuyendo activamente al establecimiento de un pronóstico favorable TME en carcinoma colorrectal humano (CRC)⁸.

Estudios anteriores intentaron aislar humanos TECs de tumores sólidos. Un objetivo importante de estos estudios era, por ejemplo, la identificación del nuevo tumor endotelial de la célula marcadores (TEMs)⁹. Una estrategia de uso inmediato de TECs después de Microdisección láser se aplicó con el fin de evitar la alteración o pérdida del fenotipo TEC en cultura. Sin embargo, estudios de seguimiento identifican una población contaminante de células mural como un serio inconveniente de este enfoque¹⁰. Nuestro laboratorio fue el primero en desarrollar un protocolo que permite el aislamiento de TECs puras y viables de humano CRC pacientes^6,7. Se eligió un enfoque con múltiples rondas de selección (MACS) celular magnético de los TECs que garantice alta pureza de las culturas aisladas de la CE. Sin embargo, este enfoque requiere un período de cultivo relativamente larga (6 semanas en promedio), que aumentó el riesgo de artefactos inducidos por la cultura. Por lo tanto, en el siguiente paso, el objetivo era reducir el tiempo de cultivo entre la cirugía y la cosecha de la primera cultura pura. Para lograr este objetivo, un protocolo mejorado empleando una disociación combinado mecánico y enzimático basado en el tejido del tumor inicial, seguido por célula de fluorescencia activada (FACS) de clasificación-clasificación de la triple-etiquetado CE, fue desarrollado. Esto reduce tiempo de aislamiento en promedio a tres semanas, resultando en cultivos puros de TEC y NEC con mayor viabilidad para estudios funcionales. Aislamiento de cultivos viables puros del TEC y NEC de tejidos humanos con tasas de éxito alta puede abrir nuevas avenidas para pruebas durante el desarrollo de los regímenes de terapia individualizada de drogas específico para cada paciente. El enfoque de aislamiento se detalla en los párrafos siguientes.

Protocolo

El proceso de aislamiento ha sido aprobado por el Comité de ética local de la Universidad de Erlangen de centro médico (#159_15 B, estudio de TuMiC). Criterios de inclusión de pacientes fueron los siguientes: CRC, UICC etapa I-IV, sin antecedentes de enfermedad inflamatoria intestinal y ningún tratamiento neoadyuvante.

1. cirugía y preparación del tejido para aislamiento de células individuales

1. Obtener muestras por cirugía de un paciente CRC (tejido de carcinoma > 0.5 g, tumor no necrótico central; tejido normal de colon > 10 cm de distancia del sitio del tumor).
2. Las piezas de tejido obtenidos son en su mayoría < 1 g para el carcinoma, pero > 1 g para el colon normal. Si piezas > 1 g se obtienen, dividido en múltiples pedazos de 1 g con un bisturí fresco para la transformación posterior del tejido.
   Nota: Si el pedazo de tejido del tumor es inferior a 0,5 g desde el comienzo, el aislamiento generalmente falla.
3. Recoger fresco desmontado piezas de tejido con pinzas estériles en 40 mL de hielo frío Hanks equilibrada solución de sal (HBSS) suplementado con penicilina/estreptomicina/amphothericin B (1% HBSS-pluma/strep/ampho) en tubos de centrífuga de 50 mL transferirlos rápidamente a la laboratorio.
   Nota: Tejido de Colon es con frecuencia altamente contaminado con bacterias/hongos desde el inicio. Durante todo el procedimiento de aislamiento, estreptococos/pluma/ampho debe añadirse a todas las soluciones para eliminar organismos contaminantes.
4. Lave cada pieza de tejido por lo menos 4 veces con hielo 40 mL frío HBSS-pluma/strep/ampho (ver paso 1.3) en tubos de centrífuga de 50 mL mediante la transferencia de las piezas de tejido secuencialmente del tubo de centrífuga de uno al siguiente tubo con unas pinzas estériles.
   1. Pinzas limpias después de cada paso con etanol al 70%.
   2. Utilice pinzas separadas para el carcinoma y piezas de tejido de colon normal.
   3. Pesar de todas las piezas de tejido.
      Nota: No coloque piezas de tejido directamente en una báscula para pesar. Después de lavar, pesar el último tubo de centrífuga que contiene el tejido antes y después de introducir las piezas de tejido. Calcular el peso de piezas de tejido individual por sustracción.

2. generación de suspensión unicelular

Nota: Se recomienda mantener el tejido hidratado en todo momento.

1. Si existe, quitar grasa adjunta, otros tejidos no tumorales o piezas de tejido potencialmente necrótico del espécimen de cirugía mediante la transferencia de las piezas de tejido en una célula estéril cultura de Petri utilizando pinzas estériles.
   1. Mantenga las piezas de tejido hidratadas en todo momento mediante la adición de 3-5 mL de HBSS-pluma/strep/ampho.
   2. Recortar las piezas de tejido con un bisturí estéril fresco (figura 1). Consultar a un patólogo en caso de identificación de tejido claro.
2. Pique el tejido restante en trozos pequeños (aproximadamente 2 × 2 × 2 m m³) con un bisturí fresco con una hoja curva. Transferencia de piezas de tejido con pinzas estériles en tubos de la disociación del tejido (por ejemplo, tubos de gentleMACS C) precargadas con precalentado (37 ° C) medio de cultivo celular (Dulbecco´s modificado medio basal de eagle mediana de [DMEM]) según el fabricante instrucciones.
   Nota: Intente usar el bisturí como una herramienta de balanceo. No exprima las células con el fin de evitar daño tisular.
3. Piezas de tejido Digest/disociar usando un Disociador de tejido (como gentleMACS Octo disociador) en combinación con el kit de la disociación de tumor de tejido humano usando las instrucciones del programa "37C_h_TDK_1" después de la manufacturer´s.
4. Centrifugar tubos de disociación durante 1 min a 300 x g a temperatura ambiente (RT).
5. Añadir 10 mL de precalentado (37 ° C) DMEM suplementado con 0.5% suero bovino fetal (FBS) (DMEM-bajo) en cada tubo utilizando una pipeta serológica y la suspensión de células usando un colador celular (tamaño de poro de 100 μm) en la parte superior un tubo de centrífuga de 50 mL pipetear la célula del filtro suspensión sobre el filtro.
6. Añadir 10 mL de DMEM-baja otra vez a cada tubo de Mac por una pipeta serológica y transferir células restantes a la coladera de la célula en la parte superior del tubo de centrífuga de 50 mL.
7. Lave el filtro de la celda una vez con un adicional 10 mL de medio DMEM-baja con una pipeta serológica.
8. Centrifugar la suspensión celular por 7 min a 300 x g a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
9. Resuspender las células en 5 mL de medio basal endotelial precalentado (EBM) -2-microvascular (MV) suplementado (Lonza) con estreptococos/pluma/ampho en el mismo tubo de centrífuga de 50 mL.
10. Suspensión de células de la placa en un matraz de cultivo celular T-25 previamente recubierto de un día para otro 1,5% gelatina-tamponada de fosfato salino (PBS) a 37 ° C con 5% CO₂.
11. Incubar las células durante 24 h a 37 ° C y 5% CO₂, lavan las células dos veces con aproximadamente 5 mL de PBS y añadir 5 mL de medio fresco.
12. Cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO₂ hasta 80-90% de confluencia (generalmente 5-7 días) con intervalos de 48 h de renovación medio.

3. de FACS-clasificación de las células endoteliales

Nota: Tratar de evitar la pérdida de células en cualquier momento, por ejemplo, al limitar el procedimiento de tinción para la incubación de las células en un tubo único.

1. Separar las células con 1 mL de accutase (aproximadamente 10 min) y añadir 4 mL de medio de EBM-2-MV precalentado (37 ° C).
2. Determinar el recuento celular con una célula automatizada contando dispositivo (rango 10-25 μm).
3. Centrifugue la suspensión de células de 4 min con 250 g de x en RT y descartar el sobrenadante.
4. Resuspender las células en tampón FACS precalentado (PBS 1 x, 2.5% albúmina de suero bovino [BSA], pH de EDTA 5 mM 8.0, 10 μm Y-27632) según el conteo de células (5 x 106/ml).
5. Añadir anticuerpos FACS de tinción según volumen de recuento/FACS-buffer celular: CD31-FITC (100 μl/mL = 1/10), CD144 vascular endotelial (VE) - cadherin - PE (100 μl/mL = 1/10), CD105-APC (25 μl/mL = 1/40), mezcle e incube durante 7 min a TA protegido de la luz; suavemente flick e incubar durante otros 8 minutos (para un tiempo total de incubación de 15 minutos).
6. Añadir 2 mL de tampón FACS a la suspensión de células marcadas con una pipeta serológica.
7. Centrifugar durante 4 min con 250 g de x en RT y descartar el sobrenadante.
8. Lavar dos veces añadiendo 2 mL de tampón de FACS y realizar una posterior centrifugación durante 4 min a 250 g de x en RT y deseche el sobrenadante.
9. Resuspender las células en 500 μl de precalentado EBM-2-MV-pluma/strep/ampho y células de transferencia en el instrumento de ordenación de FACS.
   1. Las células endoteliales se mueren rápidamente durante el proceso de clasificación si se enfría el FACS-instrumento. Por lo tanto, llevar a cabo la clasificación de las células endoteliales en RT e inmediatamente la transferencia de células colectadas a la incubadora de 37 ° C, luego.
      Nota: El instrumento de FACS es generalmente sin esterilizar.
10. Recopilar tipo triple-positive células directamente en una placa de cultivo celular (p. ej., placa de 24 pocillos previamente recubierta de un día para otro 1,5% gelatina-PBS) llenan con 0,5 mL de medio fresco precalentado (EBM-2-MV-pluma/strep/ampho).
    Nota: Revise la suspensión de células después de clasificar utilizando un microscopio. Si las células se agrupan, tratar de obtener una distribución uniforme de la célula en la placa de cultivo celular mezclándolos lentamente o añadiendo medio.
11. Cultivar células hasta confluencia de 90-100% con intervalos de 48 h de renovación medio y expandir las células en el tamaño de plato de cultura deseado (placa de 24 pozos → 12 → placa de la pozo 3,5 cm plato → T-25 → T-75).

4. la cosecha y caracterización de células endoteliales puras

1. Las células en la confluencia de 90-100% de la cosecha y caracterizarlos mediante un método adecuado (por ej., FACS, citoquímica, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o células endoteliales función ensayos^7,8).
2. Analizar las células aisladas con cualquier método de caracterización es elegido.

Resultados

Se describe el aislamiento de NEC y TEC de CRC humana por una disociación de tejido mecánico/enzymatical combinado, seguida del posterior CD31/CD105/VE-cadherina-conducido FACS-clasificación aquí (figura 1A). Este protocolo representa un protocolo mejorado con una ventana de la reducción del tiempo hasta la primera cosecha de las células endoteliales puras, viables en comparación con el anterior protocolo basado en Mac⁷.

NEC y TEC fueron aislados de humano CRC usando los siguientes pasos: (1) generación de una suspensión unicelular por disociación combinado tejido mecánica y enzimática y el crecimiento de estas células a confluencia de 80-90% (figura 1), (2) triple etiquetado de la CE. por los anticuerpos de fluorocromo Unido CD31/CD105/VE-cadherina y FACS (3)-clasificación de las respectivas células triple-positivos (figura 2A). De nota, un paso crítico para el éxito del procedimiento de aislamiento y viabilidad de las células son rápidamente someter el espécimen de la cirugía para el procedimiento de aislamiento (generación de suspensión unicelular < 1 hora después de la resección). Usando FACS-clasificación, una media de 12.500 TEC (n = 12) y 17.800 NEC (n = 12, figura 2B, izquierda) que representa un promedio de 3.6 y 5.6% de la población total de la célula (figura 2B, derecha) podría ser aislado. Posteriormente, las células se ampliaron hasta T-75 (denominado paso 1) y cosechado o procesado más de análisis. De nota, usando el protocolo anterior basada en Mac, se logró un éxito de aislamiento promedio de 49,6% (n = 58 TECs puros de n = 117 pacientes⁸) con puro CE culturas disponibles en promedio 6 semanas después de la cirugía. Usando el nuevo protocolo de base de FACS se describe aquí, las primeras culturas puras de CE se obtuvieron en promedio 3 semanas después de la cirugía con una tasa de éxito de aislamiento del 62.1% (n = 41 cultivos puros de CE obtenidos n = 66 solo células suspensiones sometidos a ordenación de FACS). Por lo tanto, un aumento de la tasa de aislamiento en un 12.5% se logró en paralelo con una disminución del tiempo de cultivo de 6 a 3 semanas. Esta reducción del tiempo de cultivo llevó a viabilidad celular mejora y prolonga la vida acompañada por la menor exposición a la inducción de potenciales dependientes de la cultura artefactos de las culturas establecidas.

Caracterización de la pureza de la CE se realizó primero por CD31-citoquímica (figura 3A). Si las culturas fueran desprovista de células CD31-negativas (figura 3A, TEC y NEC), se sometieron a una célula más detallada escribir por reacción en cadena cuantitativa de polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR) (figura 3B). Se utilizaron los iniciadores específicos de tipo celular para CE (factor de CD31, CD105, VE-cadherina y von Willebrand [vWF]), leucocitos (CD45), células epiteliales (citoqueratina [CK] -20) y células de músculo liso/fibroblastos (desmin) (figura 3B). Usar este celular basada en qPCR escribiendo, un potencial de contaminación de los cultivos EC por otras células en el rango de 0.1 - 2%, dependiendo del tipo de célula, puede ser detectado⁸.

En particular, hemos divulgado previamente una pérdida preferente de expresión de la proteína del FvW en culturas TEC en comparación con sus correspondientes NEC culturas⁷. Estos resultados se podrían confirmar con el protocolo de aislamiento recién creado (figura 3C, significa pérdida de Ct NEC-TEC = 0.687, p = 0.173, junto t-test). Culturas con éxito pasando estos controles de calidad eran pruebas de infección por mycoplasma y posteriormente utilizadas para experimentos adicionales.

Figura 1 : Células endoteliales puras pueden ser aisladas de colon normal humano y CRC clasificando FACS. (A) diagrama de flujo de los pasos esenciales del proceso de aislamiento de CE. (B) tejido graso (amarillo), otros no-con tumores partes o piezas de tejido potencialmente necrótico (marrón) se retiraron de la muestra de la cirugía (panel de la izquierda y centro) y el tumor fue desintegrado en dados de 2-3 mm de longitud de lado antes (disociación) del tejido panel de la derecha). (C) la célula suspensión obtenido después de la disociación del tejido (panel izquierdo) se incubó durante 24 h en platos de cultivo celular. Posteriormente, las células no adherentes fueron removidas por lavado suave con PBS (panel central) y las células fueron cultivadas a 80-90% de confluencia antes de la ordenación de FACS (panel derecho). Imágenes de la parte inferior (C) fueron adquiridas por microscopía de contraste de fase. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Un promedio de 3.6-5.6% de la suspensión unicelular aislado de pacientes humanos con CRC y ordenados por FACS eran triple positivo EC (A) NEC y TEC fueron FACS y ordenada con un triple de etiquetado de las células con anticuerpos anti-CD31, CD105 y - VE-cadherina. (B) una media de 12.500 TECs (n = 12) y 17.800 CNE (n = 12) puede ser aislado de colon humano normal o CRC mediante FACS-clasificación (células CD31, CD105 y VE-cadherina-positivo, panel de la izquierda), que representa en promedio 3.6 y 5.6% (panel derecho) de la celda total población empleada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : NEC y TEC de CRC humano expresan marcadores de células endoteliales típicas. Células endoteliales de colon normal (NEC, n = 10) y tumor de células endoteliales (TEC, n = 10) de CRC humana son CD31 (marcador de la CE)-, CD105 (marcador de la CE)-, VE-cadherina (marcador CE)-, vWF (marcador CE) - positivo y CK20 (marcador de células CRC)-, desmin (marcador del fibroblasto/SMC)-, CD45 ( marcador leucocitario)-negativa determinada por (A) CD31-inmunocitoquímica (células positivas = rojo) y (B) RT-qPCR (puntos de datos por debajo de la línea punteada son muestras detectadas negativo). Expresión de vWF (C) según lo determinado por RT-qPCR para muestras TEC/NEC correspondientes de los mismos pacientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Principalmente, tres diferentes métodos se han empleado hasta ahora para aislar pura y viable NECs y TECs de tejidos sólidos humanos, a saber, (1) Inmunomagnética enriquecimiento, Microdisección láser (2) y (3) FACS-clasificación de la fracción de la CE. En la mayoría de las publicaciones, Inmunomagnética enriquecimiento de las células después de la generación de una suspensión unicelular de desintegración mecánica fue usado^11,12,13. Por ejemplo, purificación Inmunomagnética de humano dérmica microvascular CE (HDMEC) por E-selectina anticuerpos después de factor de necrosis tumoral (TNF)-tratamiento de α de prepucio neonatal¹³ se ha divulgado para el aislamiento de la CE humano de glioma por tejido digerir, gradiente de percoll y selección utilizando anti-CD31/CD105 y VE-cadherina-anticuerpos¹², o por anticuerpos anti-CD105 de humanos de mama carcinoma¹¹. Protocolos que emplean Microdisección láser o clasificación de FACS han divulgado menos con frecuencia. Microdisección laser fue utilizado, por ejemplo, para identificar potenciales pan-tumor marcadores de células endoteliales (TEMs) CE derivan de carcinoma colorrectal humano con el análisis de las células inmediatamente después de la disección⁹. Clasificación de FACS utilizando anti-CD31-anticuerpos fue demostrado con éxito para el aislamiento de la fracción de CE de humanos indiferenciadas embrionarias células madre¹⁴.

Estos enfoques tienen diversas ventajas y desventajas que tienen que ser considerados. Las ventajas para el enfoque de Inmunomagnética son que ningún equipo elaborado es necesaria, la selección puede ser realizada en cualquier momento, y el enriquecimiento de la célula es rápido (aproximadamente 15 min) en comparación con la clasificación de FACS (aproximadamente 1 hora). La falta de matriz para un período más largo de tiempo puede inducir la muerte celular de la CE por anoikis. Por lo tanto, además del rho quinasa inhibidor Y-27632 el tampón FACS fue empleado para evitar que la célula anoikis¹⁵.

Las desventajas de enriquecimiento Inmunomagnética son que varias rondas de selección son necesarios para alcanzar pureza superior al 99%. Por otra parte, cultivo celular entre enriquecimientos se requiere para la recuperación de la célula, que aumenta la edad de las culturas apoyando artefactos inducidos por la cultura. Microdisección por láser se la ventaja de que las células pueden ser utilizado inmediatamente que reduce artefactos inducidos por la cultura sino que incluye el riesgo de contaminación por células del tejido adyacente zonas¹⁰. Por otra parte, microdisección no esté establecido en cada laboratorio. Las desventajas de la FACS-clasificación-enfoque incluyen, similar al laser microdissection, que el equipo es elaborada y costosa. En consecuencia, este equipo puede no ser accesible en cualquier momento. En un ajuste clínico, donde la disponibilidad del tejido de interés no puede ser exactamente planificada, esto puede añadir otra desventaja.

Sin embargo, las principales ventajas de la clasificación de FACS son que la fracción de CE puede ser etiquetada por los anticuerpos múltiples en paralelo. Así, puede emplearse una estrategia bloquea estricta que garanticen una alta pureza. Basado en la experiencia, no re-clasificación de la fracción de la CE era necesario, en contraste con el anterior mac-protocolo basado en donde múltiples rondas de selección tuvieron que emplearse. Esto condujo a un tiempo significativamente menor cultivo hasta pureza de seis semanas (enfoque Mac) a tres semanas en el enfoque de la FACS, resultando en una viabilidad celular mejorada que permite una ventana de tiempo prolongado de análisis. Finalmente, usando la estrategia de FACS-clasificación-basado, una mejora de la tasa de éxito de aislamiento podría ser logrado (aumento de 12,5%). En conclusión, la FACS-clasificación base empleando 3 anticuerpos estrategia en paralelo después de digerir tejido por digestión del tejido mecánico y enzimático combinado tenía numerosas ventajas que establece este protocolo como el método de elección para el aislamiento de Spark y NECs de carcinoma colorrectal humano y colon.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS 1x	Gibco by Life Technologies	14175-053
Penicillin-streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
amphotericin B	Gibco by Life Technologies	15290-026
Scalpels, disposable	Feather	No. 23
gentleMACS octo dissociator	Miltenyi Biotec	130-095-937
gentleMACS C-tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
human tumor dissociation kit	Miltenyi Biotec	130-095-929
DMEM	Gibco by Life Technologies	21969-035
EGM-2-MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Cell strainer, 100 µm	Falcon	352360
StemPro Accutase	Gibco by Life Technologies	A11105-01
Cell counter, automated	Coulter Counter	Z1
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
CD31-FITC	BD Pharmingen	555445
CD144/VE-cadherin-PE	BD Pharmingen	560410
CD105-APC	BD Pharmingen	562408
gelatin from bovine skin	Sigma-Aldrich	G9391
FACS-Sorting device	Beckman Coulter	MoFlo XDP