Determinación no invasiva, de alto rendimiento de la duración del sueño en roedores

Resumen

Se describe un método de alto rendimiento de medición de sueño por medio de la actividad casa jaula monitoreo. Este método ofrece ventajas sobre los métodos tradicionales basados en el EEG. Bien validado para la determinación de la duración total del sueño y puede ser una poderosa herramienta para controlar el sueño en modelos de roedores de la enfermedad humana.

Resumen

Tradicionalmente, el sueño es supervisado por un electroencefalograma (EEG). Estudios de EEG en roedores requieren implantación quirúrgica de electrodos seguido por un período de recuperación largo. Para realizar una grabación de EEG, el animal está conectado a un receptor, crear un anclaje natural al montaje de la cabeza. La supervisión de EEG es lento, lleva el riesgo de que el animal y no es un entorno totalmente natural para la medición del sueño. Métodos alternativos para detectar el sueño, particularmente en forma de alto rendimiento, adelantaría considerablemente el campo de la investigación del sueño. Aquí, describimos un método validado para la detección de sueño vía actividad casa jaula monitoreo. Estudios anteriores han demostrado que dormir evaluada a través de este método tiene un alto grado de acuerdo con definido por mediciones tradicionales basadas en EEG de sueño. Mientras que este método está validado para el tiempo total del sueño, es importante tener en cuenta que la duración del sueño pelea debería ser evaluada por un EEG que tiene mejor resolución temporal. El EEG también puede distinguir el movimiento de ojo rápido (REM) y no sueño del REM, dando más detalles sobre la naturaleza exacta del sueño. Sin embargo, determinación de sueño basado en la actividad puede utilizarse para analizar varios días dormir y para evaluar el sueño como respuesta a un evento agudo (como el estrés). A continuación, os mostramos el poder de este sistema para detectar la respuesta de ratones a inyecciones intraperitoneales diarias.

Introducción

Sueño tiene funciones importantes para la restauración del cuerpo y el cerebro después de la carga diaria de vigilia¹. Se ha demostrado que el sueño desempeña un papel en la retención de la memoria y de plasticidad cerebral general¹. El EEG es el estándar de oro para detectar el sueño². En roedores, la supervisión de EEG requiere implantación quirúrgica de electrodos colocado en un soporte de cabeza, después de que el animal necesita un periodo de tiempo de recuperación². Después de la recuperación, el animal se une al dispositivo de grabación y se da otro periodo de habituación². Debido a estos necesarios periodos de recuperación y habituación, EEG es laborioso y desperdiciador de tiempo y no puede realizarse razonablemente a gran escala. Además, el procedimiento quirúrgico de implantación de electrodo conlleva un riesgo inherente al animal. Por último, el análisis de los datos de recuento de sueño en los estudios EEG también es muy laborioso. Alternativa, método no invasivo, de alto rendimiento de control de sueño ayudaría grandemente investigación sueño roedores.

Un basado en jaula de inicio sistema de monitoreo utilizado para detectar el sueño aborda las limitaciones de los estudios de EEG. La premisa simple que es un animal inactivo probablemente un animal dormido. Se ha demostrado que 40 s de inactividad continua (desechado en 10 épocas de s) es una medida confiable de sueño medidos con un EEG (mostrado acuerdo 88-94%)³. Jaula de hogar sistemas de monitoreo pueden utilizarse para el estudio de grandes grupos de animales con el tiempo de instalación mínimo. Hemos demostrado que se necesitan animales aproximadamente un día para habituarse a la vivienda individual en el hogar-jaula Monitoreo sistema⁴ en contraste con las semanas de recuperación para estudios de EEG². Además, algunas configuraciones también pueden detectar parámetros fisiológicos como la temperatura corporal, frecuencia cardiaca, actividad y alimentación. Temperatura y la frecuencia cardiaca se determinan a partir de la implantación de un transmisor pequeño. Estos parámetros pueden proporcionar más información sobre el ratón y pueden usarse en paralelo con la grabación de sueño para añadir más a nuestra comprensión del sueño y cómo es afectado.

Si bien es una poderosa herramienta, existen algunas limitaciones a los tipos de datos que pueden ser adquiridos de actividad casa jaula monitoreo. Estudios de EEG pueden distinguir entre REM y no REM sueño, que puede ser importante para una comprensión más profunda de la arquitectura del sueño. Basado en jaula de hogar sistemas de monitoreo sólo pueden proporcionar datos para la duración total del sueño. Además, aunque el resultado de la actividad casa jaula monitoreo da información sobre la duración del sueño pelea, exactamente no podemos evaluar duración de la pelea debido a la limitación inherente de 40 s intervalos³. A pesar de estas limitaciones, casa jaula de duración proporciona una medida biológica importante que puede influir muchos factores aguas abajo, incluyendo la salud del animal y comportamiento⁵.

Actividad hogar jaula monitoreo se ha utilizado para detectar el sueño en muchos estudios que indican su versatilidad. Citamos un ejemplo de estos estudios^{4,6,7,8,9,10,11,12}. Además del método presentado, existen otros métodos de detección de sueño vía supervisión basada en la actividad, cada uno con sus propias limitaciones^13,14. Algunos de estos estudios examinan largos períodos de sueño ininterrumpido (72 h) mientras que algunos examinan sueño en bloques de 24 h. En este estudio, presentamos el análisis de sueño por cada período de 24 h después de la respuesta a inyecciones intraperitoneales (IP) y a los cambios de jaula periódica en un modelo murino de síndrome (ratones KO deFmr1 ) X frágil. Elegimos los ratones Fmr1 KO porque han reducido sueño⁴ y se presumen para ser hiper reactiva a información sensorial¹⁵. Nuestros datos ponen de relieve la capacidad de detectar cambios en los patrones del sueño en respuesta a un evento estresante. Este método es ideal para obtener información general sobre el sueño en grandes cohortes de ratones. El método puede ser útil para la comprensión de los efectos de las alteraciones genéticas específicas en el sueño, los efectos de los tratamientos farmacológicos, o respuestas a los eventos, como un factor estresante. Además, el método proporciona un medio simple de detección de una respuesta antes de iniciar estudios más.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el nacional Instituto of Mental Salud Animal Care y uso y conformidad con directrices para los institutos nacionales de salud en el cuidado y uso de animales.

1. establecer las unidades de detección de sueño

1. Comprar el número deseado de unidades y software.
2. Siga las instrucciones para configurar los sistemas de vigilancia.
   1. Alinee un detector frente a un emisor. Asegúrese de que los rayos infrarrojos son hacia y están alineados a la misma altura.
   2. Utilice los tornillos suministrados para colocar los detectores y emisores a la altura deseada en el soporte de metal. Esta altura debe ajustarse para que el lecho de la jaula por debajo del nivel de los rayos infrarrojos, pero la viga es a la altura adecuada para detectar la actividad del animal. Esto crea un área interna de 27 cm x 32 cm (10.625 en × en 12,75).
      1. Si se necesitan tornillos, compra más en un hardware almacenar (6-32 ¼ en tornillo de cabeza troncocónica).
3. Conecte cada detector con cada emisor. Conectar el emisor al centro siempre ligado al receptor. Realizar este para el x y el y y planes. Repita este paso para todas las configuraciones.
4. Conecte el receptor a un ordenador con el hub USB proporcionado.

2. software de configuración

1. Instalar el software de análisis y seleccionar el archivo de configuración proporcionado como el valor por defecto. El archivo de configuración sólo se debe cambiar por la empresa.
2. Haga clic en archivo de | Abra configuración de experimento. Abra la configuración predeterminada del experimento.
3. Haz clic en el experimento de | Propiedades.
4. Haga clic en la ficha analizar cambiar la tasa de lectura a 10 s.
5. Haga clic en la ficha de actividad cambie la frecuencia de muestreo de la actividad a 10 s.
6. Haga clic en archivo de | Guardar como experimento para guardar esta configuración para experimentos futuros.

3. animal configuración

1. Por separado de la casa los ratones en jaulas limpias que son 31 cm (12,25 pulg) de largo y 16,5 cm (6,5 pulgadas) de ancho. Para prevenir el ratón desde la construcción de la ropa de cama y obstruir los rayos, ropa de cama a una profundidad de 3 mm. No proporcionan material de anidación adicional para los ratones.
2. Que los ratones tengan acceso a alimento y agua ad libitum mediante un alimentador de alambre que descansa en la parte superior de la jaula fuera del camino de las vigas. Si es necesario, rellenar la comida y cambiar las botellas de agua cuando las jaulas se cambian cada 3-5 días durante toda la duración del estudio.
3. Alinee la jaula del ratón dentro del rayo infrarrojo instalado, asegurando que se reclina en aproximadamente la mitad de los haces de cobertura total.
4. Asegúrese de que la luz ciclo oscuro de la habitación se establece en el ciclo de luz oscuro de las condiciones de vivienda normal de los ratones del espejo o cambiar como desee basado en el experimento.

4. preparación e inyecciones de la droga

1. Obtener agua estéril y ciclodextrina estéril.
2. Para todas las inyecciones, use una jeringa de 1 mL con una aguja hipodérmica de 30.5 25.5 G. Deben utilizarse una jeringa y aguja estéril nueva para cada ratón.
3. Para reducir el tiempo entre inyecciones, montar todas las jeringas de antemano.
4. Para inyecciones de ciclodextrina: preparar la solución de ciclodextrina agregando 3 g de la ciclodextrina a 10 mL de agua para hacer una solución de Ciclodextrina de 30%.
5. Administrar 0.3 mL de solución salina o de ciclodextrina mediante inyección de IP.

5. software para grabación sueño

1. Abra el archivo de configuración por defecto.
2. Haga clic en archivo de | Abra configuración de experimento. Abrir la deseada o por defecto la configuración del experimento.
3. Haz clic en el experimento de | Configuración.
   1. Designar la ubicación para guardar el archivo de datos, así como una ubicación para guardar el archivo de copia de seguridad. El software requiere que el archivo de datos se almacene en los Archivos de programa en la carpeta de programa específico.
      Nota: dado que algunos equipos ver los Archivos de programa como sensibles, acceso al archivo de datos no es posible después de la experiencia. Por lo tanto, se recomienda guardar el archivo de copia de seguridad en otra zona no sensible en el equipo local.
   2. Designar los animales ID a cada sueño del compartimiento y se introduce el peso del animal si lo desea. Si una cámara no se está utilizando en el experimento, desmarcando la casilla desactivará esa cámara. Una vez que haya introducido la información de identificación, haga clic en hecho.
4. Haga clic en archivo de | Guardar experimentar como para guardar la configuración actual del experimento bajo el nombre de archivo.
5. Haz clic en el experimento de | Ejecute o F5 para iniciar la grabación. Esperar una época s 10 para asegurarse de que todas las cámaras están escogiendo encima de la actividad. Como los animales sólo se inyectaron, es muy probable que los animales se moverá lo suficiente para ser detectado por los rayos infrarrojos.
   1. Si no se detectó actividad, trate de mover la jaula del ratón manualmente para asegurar que las vigas recoger el movimiento. Continúe la solución de problemas o pasar a una cámara de trabajo si aún no se registra la actividad.
      Nota: Ejecutar el experimento en cuanto terminen las inyecciones.
6. Cubren las pantallas de ordenador con una cubierta opaca para bloquear la luz. Cubrir los destellos en el medidor de actividad.
7. Ejecutar el experimento durante 24 h.
   Nota: Debido al tiempo necesario para realizar las inyecciones, no será un completo 24 h. Las inyecciones deben realizarse al mismo tiempo todos los días. Sueño no debe registrarse durante las inyecciones.
8. Al día siguiente, a la hora de las inyecciones, haga clic en experimento | Dejar de para finalizar la grabación. Haga clic en archivo de | De exportación | Generar CSVs tema para recoger los datos en bruto para cada ratón.
   Nota: Puede tomar algún tiempo para exportar, así que hacerlo inmediatamente y luego proceder a inyecciones mientras el ordenador está procesando.
9. Haga clic en archivo de | De exportación | Sueño a exportar el archivo de sueño de cada experimento mediante la apertura de la materia prima. Archivo de datos de CDTA en cualquier ordenador que tenga instalado el software.
   1. Bajo de Detección de parámetros de actividad de origen, asegúrese de que el eje x y eje y cajas estén marcadas.
   2. En Épocas de umbral de dormir, asegúrese de que están seleccionadas 4 épocas.
   3. Dormir umbral umbral de actividad, asegúrese de que está seleccionado cuenta 0.
   4. En el Ciclo luz/oscuridad, compruebe el momento oportuno para el ciclo luz/oscuridad.
   5. Bajo la Ventana de análisis, seleccionar el tiempo deseado para el análisis. En el caso de los estudios de inyección, deje el día como por defecto. Establecer el tiempo de inicio como ExpSTART. Ajuste la duración como las 24:00 h. 24 análisis usando que el software se puede hacer para un máximo de 72 h.
   6. Guardar la configuración para ahorrar tiempo para exportar datos.
   7. Haga clic en Actualizar.
   8. Haga clic en Generar un archivo CSV y guardar el archivo en la ubicación deseada.

6. Análisis de datos

1. Para cada sesión de grabación, abra el archivo de sueño. Para asignar el identificador de objeto, abra el archivo CSV para cada cámara determinar el identificador de objeto. Grabar TOT sueño HH para la luz y la fase oscura para todos los animales.
   1. Consulte el archivo CSV de tema Individual para las inconsistencias que indica la falta de grabación. Si cuentas de luz de carretera se detectan en un plano, pero no hay cuentas se observan en el otro plano, esto indica falta de viga.
      Nota: El "%" para dormir las fases clara y oscuras se calcula sobre el período de registro total, que incluye fases clara y oscuras. Para los ciclos de 12 h luz/oscuridad, multiplique a este número por 2 para obtener el "% dormir" en las 12 h de luz o fase oscura. Dado que los estudios de inyección no fueron por completo 24 h, la calculada "% durmiendo" no es exacta. Para generar el correcto "% durmiendo", divida el "TOT dormir HH" por el "experimento el tiempo transcurrido: HH," multiplicar por 2 y luego multiplicar por 100 para obtener el porcentaje. Si las inyecciones se realizaron en la fase de la luz, entonces sólo la fase de la luz debe ajustarse de esta manera.
2. Desde fases y diferentes días se está comparando uno con el otro, analizar la duración del sueño por ciento para cada fase y cada día.

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Resultados

Para determinar el efecto de inyecciones diarias sobre el sueño y si animales habituarse a las inyecciones, se realizaron inyecciones diarias de IP durante 14 días consecutivos en el 9:00 (ciclo de luz comenzó en 6:00) y duración del sueño en ratones Fmr1 KO C57Bl/6J 12. Utilizamos un diseño de sujetos, inyectando cada animal con solución salina normal durante 4 días consecutivos (días 1-4) y luego 30% ciclodextrina para los siguientes diez días consecutivos (días 5-14...

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Discusión

Aquí, presentamos un método no invasivo, de alto rendimiento para la determinación de la duración del sueño basado en monitoreo de la actividad en la jaula de la casa. Este método de evaluación de tiempo de sueño total se ha validado contra EEG estudios³. Actividad hogar jaula monitoreo es simple, no invasivo y aplicable a estudios poblacionales en gran número de animales. Es limitado que no puede dar toda la información sobre el sueño (como pelea sueño y duración de las etapas del su...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Equipment and software to analyze sleep duration
Captisol Research Grade	Captisol	RC-0C7-100	Captisol for dissolving hydrophobic compounds
30 G BD Needle 1/2 inch	BD	305106	Needle for injections
BD Disposable Syringes	Fisher	14-823-30	Syringes for injections
B6.129P2-Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Labs	3025	Fmr1 KO mice
Super Mouse 750 Mouse Cage	Lab Products, Inc.		Homecages for the mice
SANI-Chips Bedding	PJ Murphys		Bedding for the mice